KR102371416B1 - 노화 색소형성 세포의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 세포 및 그 세포를 이용한 노화개선 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

노화 색소형성 세포의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 세포 및 그 세포를 이용한 노화개선 물질의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 명세서에는, 노화 멜라노사이트 제조방법과, 제조방법에 의해 제조된 노화세포 및 상기 노화세포를 이용하여 노화개선 또는 피부 미백용 물질을 스크리닝하는 방법이 개시된다. 상기 세포를 이용하여 자외선 자극의 누적으로 인한 세포 노화 현상과 색소 침착 기전을 연구하는데 사용할 수 있다. 특히, 노화 개선과 피부 미백의 효과를 동시에 갖는 물질을 선별할 수 있으므로 유용하다.

Description

노화 색소형성 세포의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 세포 및 그 세포를 이용한 노화개선 물질의 스크리닝 방법{Method for making senescent melanocyte cells, senescent cells therefrom and method for screening anti-aging material using the same}
본 명세서에는 반복적 자외선 노출 및 일정 기간 동안의 배양에 의한 색소형성 세포의 노화 현상의 연구 및 노화성 색소침착의 연구에 사용할 수 있는 노화 색소형성 세포를 제조하는 방법, 그 방법에 의해 제조된 노화된 멜라노사이트 세포와, 그 세포를 이용하여 노화개선 또는 피부 미백용 물질을 스크리닝하는 방법이 개시된다.
최근 생활수준이 향상됨에 따라 현대인들은 건강한 신체를 유지하는 것에 더하여 건강한 피부를 유지하는 데에도 많은 관심을 기울이고 있다. 따라서 피부미용과 피부노화 개선에 대한 관심이 높아지고 있다.
피부는 인체의 가장 큰 기관으로서 전체 인체 부피의 약 16%를 차지하고, 외부환경과 직접 접해 있으면서, 인체 안으로 침입하려는 치명적인 많은 유해인자, 예를 들면, 온도, 습도 및 자외선 등으로부터 인체를 보호하는 중요한 보호막 역할을 담당한다. 그러나, 각종 오염물질, 강한 자외선과 같은 외부환경으로 인해 피부 세포들이 손상을 입게 되어, 세포 증식이 제대로 이루어지지 않게 되어 피부에 주름, 탄력 손실 및 각질화, 불규칙한 색소 침착 등이 발생한다.
피부 노화는 크게 자연 노화(또는, 내인성 노화)와 외인성 노화로 구분되며, 자연 노화는 유전적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 어려운 반면 외인성 노화는 환경적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 비교적 용이하다. 대표적인 외인성 노화 인자로는 자외선, 활성 산소종(reactive oxygen species) 및 스트레스 등이 알려져 있다.
따라서, 최근 외인성 노화를 개선하기 위한 방법들이 활발히 연구되고 있으며, 특히 노화방지 또는 개선을 위한 물질을 규명하기 위한 노력이 계속되고 있다.
피부노화의 원인, Biowave 2011, Vol.13, no.3(1), 1-15pages, 강태진
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 노화성 색소 침착 연구에 사용할 수 있는 노화된색소형성세포(멜라노사이트)를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 반복적 자외선 노출 및 일정 기간의 배양을 통해 얻어진 노화된 멜라노사이트를 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 멜라노사이트의 노화를 유도하여 노화 개선 또는 미백효과가 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 멜라노사이트의 노화를 유도하여 노화 개선 효과와 미백효과를 동시에 갖는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 자외선을 10 내지 30 mJ/㎠의 세기로, 1 내지 12회 계대배양한 인간 1차 멜라노사이트(human primary melanocyte)에 2회 이상 조사하는 단계를 포함하는, 노화된 멜라노사이트 제조방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 노화된 멜라노사이트에 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질 처리 전후의 노화 지표 또는 미백 지표를 검출하는 단계를 포함하는, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 노화된 멜라노사이트 및 지시서를 포함하며, 상기 지시서에는, 노화 멜라노사이트에 후보 물질 처리 전후의 노화지표 또는 미백 지표의 발현양을 측정하여, 발현양이 후보 물질 처리 후에 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 감소 또는 증가한 경우, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질로 판단하는 내용을 포함하는, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질의 스크린용 키트를 제공한다.
일 측면에 있어서, 본 발명의 제조방법에 따라서 제조된 노화된 멜라노사이트는, 자외선 자극의 누적으로 인한 세포 노화 현상과 색소 침착 기전을 연구하는데 사용할 수 있다. 또한, 상기 세포를 이용하여 노화 개선 또는 피부 미백 효과가 있는 물질을 스크리닝할 수 있어, 유용하다.
도 1은 자외선 세기에 따른 세포 생존율을 보이는 도이다.
도 2는 자외선 세기에 따른 세포 표현형을 관찰한 도이다: 노화세포를 화살표로 표시하였음.
도 3은 자외선 세기에 따른 2주 경과 후 베타-갈락토시다아제의 활성을 측정한 도(a), 20mJ/㎠의 자외선을 2회 조사한 후 2주 경과시 베타-갈락토시다아제의 활성을 염색하여 표시한 도(b) 및 20mJ/㎠의 자외선을 2회 조사한 후 2주 경과시 p53과 p21의 발현을 보이는 도(c)이다(*; p<0.05)
도 4는 자외선 세기에 따른 멜라닌 세포의 함량을 확인한 도이다(*; p<0.05).
도 5는 미백용 물질 A를 처리한 후 베타-갈락토시다아제의 활성 변화(a), 멜라닌의 함량 변화(b)를 보이는 도이다(*; p<0.05).
도 6은 미백용 물질 A, B 및 C를 각각 처리했을 경우, p16 및 p21 의 발현변화(a, b, c)와 멜라닌 함량의 변화(d)를 보이는 도이다(*; p<0.05, **; p<0.01).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은, 노화된 멜라노사이트를 제조하는 방법으로서, 자외선을 10 내지 30 mJ/㎠의 세기로, 1 내지 12회 계대배양한 인간 1차 멜라노사이트(human primary melanocyte) 에 2회 이상 조사하는 단계를 포함하는, 노화된 멜라노사이트 제조방법이다.
자외선은, 일반적으로 파장에 의해 자외선A(UVA), 자외선B(UVB) 및 자외선C(UVC) 로 나뉘며, 통상, 320nm~400nm의 파장은 자외선A, 280nm~320nm의 파장은 자외선B, 100nm~280nm는 자외선C라 한다.
상기와 같은 측면에서, 상기 자외선은 자외선B일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 자외선A 또는 자외선C일 수 있다.
일 구현예에서, 세포에 자외선B를 조사한 경우, 가장 최적화된 노화상태의 노화된멜라노사이트를 얻을 수 있다. 다만, 조사하는 자외선이 자외선B의 영역에 포함된다면, 파장에 따른 큰 효과차이는 없을 것이다.
또한, 상기와 같은 측면에서, 상기 자외선의 세기는 10 내지 30 mJ/㎠ 일 수 있고, 15 내지 25 mJ/㎠일 수 있으나, 제한되지 않고, 15㎠ 이상, 16mJ/㎠ 이상, 17mJ/㎠ 이상, 18mJ/㎠ 이상, 19mJ/㎠ 이상, 20mJ/㎠ 이상, 21mJ/㎠ 이상, 22mJ/㎠ 이상, 23mJ/㎠ 이상, 24mJ/㎠이상일 수 있고, 25 mJ/㎠ 이하, 24 mJ/㎠ 이하, 23 mJ/㎠ 이하, 22 mJ/㎠ 이하, 21 mJ/㎠ 이하, 20 mJ/㎠ 이하, 19 mJ/㎠ 이하, 18 mJ/㎠ 이하, 17 mJ/㎠ 이하, 16 mJ/㎠ 이하일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 자외선B를 20 mJ/㎠의 세기로 조사할 때 가장 최적화된 상태의 노화된 멜라노사이트를 얻을 수 있다.
본 명세서에서 최적화된 노화상태의 노화된 멜라노사이트는, 예컨대, 세포 군집 중 노화가 진행되지 않은 정상세포 및 이미 세포 사멸이 일어나서 살아있지 않은 세포를 제외하고 대사 활동이 저하된 세포로서, 노화 개선 혹은 방지 물질 처리시, 노화가 지연되거나 일어나지 않을 수 있는 세포를 의미할 수 있다. 즉, 더 이상 세포 증식을 유도하지 않으면서, 허용 가능한 생존률을 보이는 상태의 멜라노사이트를 의미할 수 있다.
또한, 본 명세서에서, 노화성 색소침착 모델이란, 노화로 인해 색소 침착이 생긴 세포를 의미할 수 있으며, 더 이상의 색소 유발 자극원이 없음에도 불구하고 노화지표의 증가와 함께 색소 침착이 증가 되어 있는 멜라노사이트와 의미가 혼용되어 사용될 수 있다.
또한, 상기 노화 진행 정도는, 예컨대, 노화 표지로 알려져 있는, p16, p21, p53 등의 발현 증가, 베타-갈락토시다아제의 활성 증가, 세포 증식율 저하 및 세포의 표현형 변화 통해 관찰하여 확인할 수 있다.
본 명세서에서 자외선 B는, 예컨대, 280nm 내지 320nm의 파장을 갖는 자외선 영역을 의미할 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 노화된 멜라노사이트의 제조방법은, 상기 자외선 조사된 멜라노사이트를 24시간 이상 배양시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 자외선 조사된 세포를 자외선 조사 후 24시간 이상, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 5일 이상, 7일 이상, 9일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상, 15일 이상 또는 16일 이상 동안 배양시킬 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 자외선 조사는 18 시간 내지 30시간 간격으로 2회 이상 실시할 수 있다. 자외선 조사 횟수는 제한되지 않고 1회, 2회, 3회 또는 그 이상일 수 있다.
또한, 자외선 조사의 간격은 18시간 내지 30시간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 자외선 2차 조사는, 자외선 1차 조사 후 17시간 경과 후, 18시간 경과 후, 19시간 경과 후, 20 시간 경과 후, 21시간 경과 후, 22시간 경과 후, 23시간 경과 후, 23시간 30분 경과 후, 23시간 45분 경과 후, 24시간 경과 후, 24시간 10분 경과 후, 24시간 15분 경과 후, 24시간 30분 경과 후, 25시간 경과 후, 26시간 경과 후, 27시간 경과 후, 28시간 경과 후, 29시간 경과 후, 30시간 경과 후 또는 31시간 경과 후에 실시될 수 있다.
또한, 일 구현예에서, 자외선 B를 20mJ/㎠의 세기로 멜라노사이트에 1차 조사한 후 24시간 경과 후 1차 자외선 조사 때와 동일한 조건으로 자외선을 2차 조사한 경우, 가장 최적화된 노화상태의 노화된 멜라노사이트를 얻을 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 자외선 조사를 받는 세포는 인간 1차 색소 형성 세포(human primary melanocyte)일 수 있다.
본 발명은, 다른 측면에서, 상기 방법에 의하여 제조된 분리된, 노화된 멜라노사이트이다.
다른 측면에서, 본 발명은 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질 처리 전후의 노화 지표 또는 미백 지표를 검출하는 단계를 포함하는, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질의 스크리닝 방법이다.
본 명세서에서, 노화 지표란, 노화된 세포에서 특이적으로 발현양이 증가하거나 감소하여, 세포의 노화 정도를 확인할 수 있는 유전자, 그 유전자의 발현산물을 의미할 수 있다. 노화지표는, 예컨대, 베타-갈락토시다아제(β- galactosidase)의 활성, p16, p21또는 p53 유전자 또는 그 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 업계에 알려진 공지의 노화표지를 포함한다.
또한, 본 명세서에서 미백 지표란, 세포 내 색소 침착 여부를 확인할 수 있는 유전자, 그 유전자의 발현 산물을 의미할 수 있다. 예컨대, 멜라닌일 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 후보물질의 스크리닝 방법은, 상기 후보물질의 처리 후에 노화 지표 또는 미백 지표의 발현양이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 감소 또는 증가하면, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 피부 노화 개선용 후보물질과 피부 미백용 후보물질의 처리 후에 상기 노화지표와 멜라닌의 축적양이 모두 감소 또는 증가하면, 피부 노화 개선과 피부 미백의 효과를 동시에 갖는 물질로 결정하는 것일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질의 스크린용 키트이다. 상기 키트는 상기 노화된 멜라노사이트 및 지시서를 포함할 수 있으며, 상기 지시서에는, 노화 멜라노사이트에 후보 물질 처리 전후의 노화지표 또는 미백 지표의 발현양을 측정하여, 발현양이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 감소 또는 증가한 경우, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질로 판단하는 내용을 포함할 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 정상 또는 상기 노화된 멜라노사이트는, 냉동보존 또는 담체 보존된 상태인 것일 수 있다. 상기 키트 내에 포함되는 노화된 멜라노사이트는, 추가적인 세포증식이나 노화를 최소화하기 위해, 상기 나열된 기술 외에도 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해, 최적의 노화상태가 보존된 채로 키트 내에 포함될 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 노화 지표는 베타-갈락토시다아제(β- galactosidase), p16, p21 및 p53으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 미백 지표는 멜라닌일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시에는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지 않는다.
[실시예 1] 색소형성 세포의 배양 및 자외선 B 조사
인간 1차 색소 형성 세포(human primary melanocyte, Life Technologies, CA, USA)를 인간 색소 형성 세포 성장 보충물(human melanocyte growth supplement(HMGS), Gibco BRL, NY, USA)를 첨가한 M-254 배지(Gibco BRL, NY, USA)를 이용하여 상온, 5% CO2 배양기에서 배양한 후, 세포수가 2×105이 되도록 100mm 배양 접시에 깔고, 하룻밤 동안 세포가 기벽에 붙기를 기다린 후, 11mJ/㎠, 20mJ/㎠, 30mJ/㎠ 세기의 자외선 B를 24시간 간격으로 2번 조사하였다.
상기 멜라닌 세포를 3일에 한번씩 배지를 교환하여 주며 최대 2주 동안 배양하면서 세포 독성, 표현형, 노화 지표들을 관찰하였다.
[실시예 2] 색소 형성 세포의 자외선 B 조사 후 세포 증식 및 생존 관찰
더 이상 세포 증식을 유도하지 않으면서, 허용 가능한 생존율을 보이는 자외선 B 조사 조건을 찾기 위해, wst-1 (Roche Applied Science, Germany)용액을 이용하여 세포의 증식 및 생존율을 조사하였다. 실시예 1의 세포와, 자외선B를 조사하지 않고 배양한 세포(대조군)의 48시간, 1주일, 2주일 후의 생존율을 관찰하였다(도1).
그 결과, 자외선 B를 처리하지 않은 대조군의 경우, 시간이 지나면서 그 수가 급격히 증가하는 것을 알 수 있다. 이에 비해, 11mJ/㎠, 20mJ/㎠, 30mJ/㎠ 자외선 B 조사를 받은 세포들은 처리 후 48시간 경과시, 대조군의 세포수와 비교하여 각각 약 93%, 85%, 75%의 생존율을 보였다. 또한, 자외선 B 조사 후2주 경과시, 대조군 대비 각각 약 71%, 40%, 23%의 생존율을 보였다. 이는 자외선 B 세기 의존적으로 세포의 증식이 저하되고, 특히 20 mJ/㎠ 이상의 자외선 B 세기에서는 그 증식률이 유의미하게 억제됨을 보인다. 세포의 증식 저하는 대표적인 노화(senescent) 세포의 특성이다.
[실시예 3] 자외선 B 조사 2주 경과 후 색소 형성 세포의 표현형 관찰
실시예1의 조건으로 자외선 B를 조사한 후, 색소 형성 세포의 변화를 광학 현미경으로 관찰하였다. 세포의 표현형은 배지가 포함되어 있는 살아있는 상태에서 광학 현미경으로 40배 확대하여 관찰하였다.
그 결과, 자외선 B를 조사한 경우 멜라닌 세포들 중에는 그 모양이 초기에 비하여, 평평해지고, 세포체(cell body)의 크기가 증가하며, 가지돌기(dendrite)의 개수가 증가된, 즉, 노화된 세포들이 증가하였으며, 이러한 세포들의 수가 자외선 B의 세기 의존적으로 늘어남으로써, 전체적으로 세포간 이질성(heterogeneity)이 증가되었음을 알 수 있었다. 다만, 11mJ/㎠ 세기로 자외선 조사한 군은, 자외선을 조사하지 않은 군과 비슷한 표현형을 보이는 노화되지 않은 세포가 많이 존재 하였고, 30mJ/㎠ 세기로 자외선 조사한 군은 살아 있는 세포가 비교적 적게 관찰됨을 확인하였다.
[실시예 4] 자외선 B 조사 2주 경과 후의 색소 형성 세포의 베타-갈락토시다아제 활성과 p53, p21 단백질 발현 조사
실시예1의 조건으로 자외선 B 를 조사한 후, 세포의 대표적 노화 지표인 베타-갈락토시다아제 활성을 측정한 결과, 조사한 자외선 B의 세기에 비례하여 그 활성이 증가함을 확인하였다(도3a). 단, 11mJ/㎠ 세기의 자외선 B를 조사한 경우, 일부 세포들에서 노화로 인한 표현형 변화가 확실히 관찰되나, 정상 세포가 다량으로 존재하기 때문에 베타-갈락토시다아제의 활성이 대조군과 비교하여 유의적 차이가 보이지 않았다. 또한, 도2에서 보여진 노화성 표현형을 보이는 세포들은 정상세포들 대비 확연히 베타-갈락토시다아제 활성을 보이는 것을 발색 실험을 통해 확인하였다 (도3b).
또한, 노화된 세포에서 다량 발현되는 것으로 알려진, p53과 p21의 단백질의 발현량을 확인하기 위해, 세포에 각 세기의 자외선 B를 조사한 후 2주 동안 배양하고, 세포를 배양접시에서 떼어낸 후 RIPA 용해 버퍼 (Radioimmunoprecipitation assay buffer, Millipore, 20-188)를 넣어 세포를 부수고 13,500 rpm으로 30분 원심 분리하고 상층액을 분리하여 총 단백질을 추출하였다. p53 특이적 항체 (Dako, #M7001)와 p21 특이적 항체 (cell signaling #2947)를 이용하여 웨스턴 블랏을 한 결과, 20mJ/㎠ 자외선 B 조사 후 p53과 p21 단백질의 발현이 증가하였음을 확인하였다 (도3c).
[실시예 5] 자외선 B 조사 2주 경과 후 세포 내 멜라닌 축적 관찰
색소 형성 세포에 각각 11mJ/㎠, 20mJ/㎠, 30mJ/㎠ 세기의 자외선 B 를 2회 조사하고 2주일간 배양한 후, 그 세포를 배양 접시에서 떼어 그 수를 센 후, 같은 수의 세포를 마이크로 튜브에 모은 다음, RIPA 용해 버퍼 (Millipore, 20-188)를 넣어 세포를 부수고 13,500 rpm으로 30분 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 침전물을 1N 수산화나트륨(NaOH)에 용해 시켜, 그 색을 비교하고 (도4a), 450 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌의 함유량을 비교하였다 (도 4b)
그 결과, 색소 형성 세포의 멜라닌의 함량은 20mJ/㎠, 30mJ/㎠의 자외선 B 조사시 그 세기가 증가함에 따라 유의미하게 증가됨을 확인하였다. 이는 색소 형성 세포에 특정 세기 이상의 자외선 B를 반복적으로 조사한 후 특정 기간 동안 배양하는 경우, 노화성 지표들의 발현이 증가됨과 동시에, 멜라닌 함량이 증가됨을 의미한다.
[실시예 6] 자외선 B 조사 2주 경과 후 p16, p21의 mRNA 발현량 관찰
20mJ/㎠ 세기의 자외선 B를 24시간 간격으로 2회 조사한 후 2주 뒤의 세포에서 RNA를 수득하여 cDNA를 제작하였고 p16, p21 특이적 프라이머를 이용하여 Q-PCR(Applied biosystems, 7500 Fast)로 mRNA양의 변화를 측정하였다. Q-PCR의 실험은 95℃에서 15초, 60℃ 60초 싸이클을 총 40회 반복하였으며, 대조군과 비교하여 해당 유전자 발현이 얼마나 증가하였는지 상대적인 값을 측정하였다. 사용한 프라이머는 Applied Biosystems에서 제조한 TaqMan 제품으로 각각 다음과 같다: p16 (제품번호: Hs00923894_m1), p21 (제품번호: Hs00355782_m1)
그 결과, 대조군 대비 노화성 색소 침착 모델에서 p16 과 p21의 mRNA 발현이 크게 증가함을 확인하였다(도6).
[실시예 6] 노화성 색소 침착을 개선하는 미백용 물질의 스크리닝 : 미백용 물질 처리 후 멜라닌 함량 변화 확인
상기 실시예들을 통해, 가장 적합한 노화 상태를 보유한다고 판단된 세포, 즉, 색소 형성 세포에 20mJ/㎠ 세기의 자외선 B를 24시간 간격으로 2회 조사한 세포를, 자외선 조사 후 48시간부터 대표적 미백 기능 소재인 물질A (melasolv, 30 uM)를 포함한 배지로 3일 간격으로 갈아주며 배양하였다(총 4회). 2주 후, 베타-갈락토시다아제의 활성과 멜라닌 함량을 대조군(비히클(DMSO) 처리)과 비교하였다 (도5). 그 결과 자외선 B 처리로 인해 증가되었던 베타-갈락토시다아제의 활성이 감소됨 (도5a; *, p<0.05)과 더불어 멜라닌 함량이 물질A 처리에 의해 대조군 수준으로 확연하게 감소되는 것을 확인하였다(도5b; *, p<0.05). 이를 통하여, 상기 노화 세포는, 색소 형성세포의 노화에서 기인한 색소 침착을 개선하는 물질을 유용하게 스크리닝 할 수 있음을 확인하였다.
[실시예 7] 노화성 색소 침착을 개선하는 미백용 물질의 스크리닝 : 미백용 물질 처리 후 p16, p21의 발현 변화 관찰
색소 형성 세포에 20mJ/㎠ 세기의 자외선 B를 24시간 간격으로 2회 조사한 세포에, 기존에 미백효과가 있다고 보고된 물질A, 물질B, 물질C를, 자외선 B 최종 조사 후 48시간부터 2주간 3일 간격으로, 총 4회 처리시, 증가되었던 상기 유전자 발현이 현저히 억제되었음을 확인하였다(도6; *, p<0.05, **, p<0.01). 특히, 일반 색소 침착 유도 조건에서는 미백 효능을 보이지 않는 물질 C를 처리한 경우도 미백 효과가 관찰되었는데, 이는 상기 노화성 색소 침착 모델 세포가 색소 세포 노화에 기인한 색소 침착을 스크리닝하는데 효과적임을 보여준다.

Claims (17)

  1. 노화된 멜라노사이트를 제조하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    자외선을, 10 내지 30 mJ/㎠의 세기로, 1 내지 12회 계대배양한 인간 1차 멜라노사이트(human primary melanocyte)에 2회 이상 조사하는 단계; 및
    상기 자외선 조사된 멜라노사이트를 2주 이상 배양시키는 단계를 포함하는, 노화된 멜라노사이트 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 자외선은, 자외선B인, 노화된 멜라노사이트 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 자외선 세기는,
    15 내지 25 mJ/㎠인, 노화된 멜라노사이트 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 자외선 조사는, 18 내지 30시간 간격으로 실시하는, 노화된 멜라노사이트 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 자외선 조사는, 2회 실시하는, 노화된 멜라노사이트 제조방법.
  8. 제1항 및 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된, 분리된, 노화된 멜라노사이트.
  9. 제8항의 세포에, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질 처리 전후의 노화 지표 또는 미백 지표를 검출하는 단계를 포함하는, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질의 스크리닝 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 후보물질의 처리 후에 노화 지표 또는 미백 지표의 발현양이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 감소 또는 증가하면, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질로 결정하는 단계를 더 포함하는, 스크리닝 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 노화 지표 및 미백 지표의 발현양이 모두 감소 또는 증가하면, 피부 노화개선과 피부 미백의 효과를 동시에 갖는 물질로 결정하는, 스크리닝 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 노화 지표는 베타-갈락토시다아제(β- galactosidase), p16, p21및 p53으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 스크리닝 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 미백 지표는 멜라닌인, 스크리닝 방법.
  14. 제8항의 세포; 및
    지시서를 포함하며,
    상기 지시서에는, 후보 물질 처리 전후의 노화 지표 또는 미백 지표를 측정하여, 발현양이 후보 물질 처리 후에 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 감소 또는 증가한 경우, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질로 판단하는 내용을 포함하는, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질의 스크린용 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 세포는 냉동보존 또는 담체 보존된 상태인, 키트.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 노화 지표는 베타-갈락토시다아제(β- galactosidase), p16, p21 및 p53으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 키트.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 미백 지표는, 멜라닌인, 키트.
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