ES2950394T3 - Método para preparar melanocitos senescentes, células preparadas mediante el método y método de cribado de material que alivia la senescencia mediante el uso de células - Google Patents

Método para preparar melanocitos senescentes, células preparadas mediante el método y método de cribado de material que alivia la senescencia mediante el uso de células Download PDF

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Abstract

En la presente especificación se describen: un método para preparar melanocitos senescentes; células senescentes preparadas mediante el método de preparación; y un método para detectar un material que alivie la senescencia o que blanquee la piel mediante el uso de células senescentes. Las células se pueden utilizar para estudiar un fenómeno de senescencia celular y un mecanismo de pigmentación, que son causados por la acumulación de estimulación de los rayos UV. En particular, las células son útiles ya que se puede seleccionar un material que tenga efectos tanto de alivio de la senescencia como de blanqueamiento de la piel. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método para preparar melanocitos senescentes, células preparadas mediante el método y método de cribado de material que alivia la senescencia mediante el uso de células
[Campo técnico]
La presente memoria descriptiva describe un método para preparar melanocitos senescentes, que puede usarse en estudios sobre el fenómeno de senescencia de los melanocitos y la pigmentación senescente mediante exposición repetida a rayos UV y cultivo durante un determinado periodo de tiempo y melanocitos senescentes preparados mediante el método.
[Antecedentes de la técnica]
Con las recientes mejoras en el nivel de vida, la gente moderna presta más atención al mantenimiento de una piel sana, así como de un cuerpo sano. De ahí el creciente interés por el cuidado de la piel y el alivio de la senescencia de la piel.
La piel es el órgano más grande del cuerpo humano que representa aproximadamente el 16 % del volumen total del cuerpo humano. Está en contacto directo con el entorno exterior y funciona como una importante barrera protectora para proteger al cuerpo humano de una serie de factores nocivos mortales que se inmiscuyen en él, tales como la temperatura, la humedad y los rayos UV. Sin embargo, cuando las células de la piel resultan dañadas por el entorno externo, como diversos contaminantes y los fuertes rayos UV, la proliferación celular no se realiza correctamente y la piel sufre arrugas, pérdida de elasticidad, queratinización y pigmentación irregular.
La senescencia de la piel se divide brevemente en senescencia natural (o senescencia endógena) y senescencia exógena, y es difícil controlar artificialmente la senescencia natural ya que la senescencia natural se ve afectada por factores genéticos. Sin embargo, es relativamente fácil controlar artificialmente la senescencia exógena, ya que ésta se ve afectada por factores ambientales. Como factores de senescencia exógenos representativos,
se conocen los rayos UV, las especies reactivas del oxígeno, el estrés, etc. Por tanto, recientemente se han estudiado activamente métodos para aliviar la senescencia exógena y, en particular, se han realizado continuos esfuerzos para identificar un material que prevenga o alivie la senescencia.
El documento JP 2014-520166 A (Bio Spectrum, Inc) 21 de agosto de 2014 describe un ensayo sobre los efectos del madecassoside en la melanogénesis de los melanocitos, la prueba caracterizada por tratar, con madecassoside, los melanocitos generados mediante el cultivo de melanocitos epidérmicos humanos, derivados de un lactante, en un medio que comprende un suplemento de crecimiento de melanocitos humanos y, a continuación, irradiar rayos ultravioleta artificiales (UVB 20 mJ).
El documento JP 2014-112073 A (Nagoya Univ.) 19 de junio de 2014 describe un método para cribar un material activo con respecto a la senescencia de la piel por medio de marcadores relacionados con senescencia.
El documento “Analysisofthe UV-Induces Melanogenesis and GrowthArrestof Human Melanocytes” , publicado por Abdel-Malek Z y col., enseña que someter a los melanocitos cultivados a dos o tres rondas de irradiación UV provoca una disminución dependiente de la dosis en la proliferación y cambios morfológicos que recuerdan a las alteraciones observadas cuando los melanocitos alcanzan la senescencia en cultivo.
[Resumen de la invención]
[Problema técnico]
En un aspecto, un objeto de la presente invención es proporcionar un método para preparar melanocitos senescentes, que se pueden usar para un estudio sobre la pigmentación senescente.
En otro aspecto, la presente invención proporciona melanocitos senescentes obtenidos mediante exposición repetida a rayos UV y cultivo durante un determinado periodo de tiempo.
[Solución al problema]
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar melanocitos senescentes, incluyendo el método irradiar melanocitos primarios humanos, que se han subcultivado de 1 a 12 veces, con rayos UV a una potencia de 20 a 30 mJ/cm2 dos o más veces; y cultivar los melanocitos irradiados con rayos UV durante 14 días o más.
[Efectos ventajosos de la invención]
En un aspecto, los melanocitos senescentes preparados según el método de la presente invención pueden usarse para estudiar un fenómeno de senescencia celular y un mecanismo de pigmentación debido a la acumulación de estimulación por rayos UV. Además, las células son útiles ya que un material que tiene un efecto de alivio de la senescencia o de blanqueamiento de la piel puede ser cribado mediante el uso de las células.
[Breve descripción de los dibujos]
La figura 1 es un diagrama que ilustra los resultados de la observación sobre la viabilidad celular en función de la intensidad UV.
La figura 2 es un diagrama que ilustra el fenotipo celular en función de la intensidad UV: las células senescentes se indican mediante flechas.
La figura 3a es un diagrama que ilustra la actividad de p-galactosidasa en función de la intensidad UV medida después de 2 semanas, la figura 3b es un diagrama que ilustra la actividad de p-galactosidasa teñida en 2 semanas después de ser irradiada con rayos UV a 20 mJ/cm2 dos veces, y la figura 3c es un diagrama que ilustra la expresión de p53 y p21 en 2 semanas después de ser irradiados con rayos UV a 20 mJ/cm2 dos veces (*; p < 0,05).
La figura 4 es un diagrama que ilustra el contenido de melanina en función de la intensidad UV (*; p < 0,05).
La figura 5a es un diagrama que ilustra un cambio en la actividad de p-galactosidasa después de tratarse con el material de blanqueamiento A y la figura 5b es un diagrama que ilustra un cambio en el contenido de melanina después de ser tratada con material de blanqueamiento A (*; p < 0,05).
Las figuras 6a, 6b y 6c son diagramas que ilustran un cambio en la expresión de p16 y p21 en el caso de tratarse con materiales de blanqueamiento A, B y C, respectivamente y la figura 6d es un diagrama que ilustra un cambio en el contenido de melanina en el caso de ser tratada con materiales de blanqueamiento A, B y C (*; p < 0,05, **; p < 0,01).
[Descripción de las realizaciones]
A continuación en el presente documento, se describirá con detalle la presente invención.
En un aspecto, la presente invención es un método para preparar melanocitos senescentes, que incluye irradiar melanocitos primarios humanos, que se han subcultivado de 1 a 12 veces, con rayos UV a una potencia de 20 a 30 mJ/cm2 dos o más veces; y cultivar los melanocitos irradiados con rayos UV durante 14 días o más.
Los rayos UV se dividen generalmente en ultravioleta A (UVA), ultravioleta B (UVB) y ultravioleta C (UVC) según la longitud de onda. En general, los rayos UV con longitudes de onda de 320 a 400 nm se definen como UVA, los rayos UV con longitudes de onda de 280 a 320 nm se definen como UVB y los rayos UV con longitudes de onda de 100 nm a 280 nm se definen como UVC.
En el aspecto anterior, los rayos UV pueden ser UVB, pero la presente invención no se limita a los mismos. Por ejemplo, los rayos UV pueden ser UVA o UVC.
En una realización, pueden obtenerse melanocitos senescentes en el estado senescente más optimizado en el caso de irradiar las células con UVB. Sin embargo, no hay grandes diferencias en el efecto en función de la longitud de onda siempre que los rayos UV a irradiar estén incluidos en la región de los UVB.
Además, en el aspecto anterior, la potencia UV puede ser de 20 a 30 mJ/cm2 o de 20 a 25 mJ/cm2, y por ejemplo, la potencia UV puede ser de 20 mJ/cm2 o más, 21 mJ/cm2 o más, 22 mJ/cm2 o más, 23 mJ/cm2 o más, o 24 mJ/cm2 o más y la potencia UV puede ser de 25 mJ/cm2 o menos, 24 mJ/cm2 o menos, 23 mJ/cm2 o menos, 22 mJ/cm2 o menos, 21 mJ/cm2 o menos.
En una realización, pueden obtenerse melanocitos senescentes en el estado senescente más optimizado cuando la célula se irradia con UVB a una potencia de 20 mJ/cm2.
En la presente memoria descriptiva, los melanocitos senescentes en el estado senescente más optimizado pueden referirse, por ejemplo, a células que presentan una actividad metabólica disminuida, tales como células de las cuales se puede retrasar la senescencia o pueden no proceder cuando se tratan con un material de alivio de senescencia o prevención de senescencia, excepto células normales que no han sufrido senescencia y células que ya han experimentado muerte celular y no están vivas en un grupo celular. En otras palabras, puede referirse a melanocitos en un estado que tiene una tasa de supervivencia aceptable sin inducir adicionalmente la proliferación celular.
Además, en la presente memoria descriptiva, el modelo de pigmentación senescente puede referirse a una célula en la que se ha producido la pigmentación debido a la senescencia, y se puede usar indistintamente con melanocitos en los que la pigmentación se aumenta junto con un aumento en el índice de senescencia a pesar de la ausencia de una fuente estimulante para inducir la generación de pigmento.
Además, el grado de progreso de la senescencia se puede determinar observando, por ejemplo, un aumento en la expresión de p16, p21, p53, y similares conocidos como marcadores de senescencia, un aumento en la actividad de p-galactosidasa, una disminución en la tasa de proliferación celular y un cambio en el fenotipo de la célula.
En la presente memoria descriptiva, UVB puede referirse, por ejemplo, a una región de rayos UV que tiene una longitud de onda de 280 nm a 320 nm.
Las células irradiadas con rayos UV se cultivan durante 14 días o más, 15 días o más, o 16 días o más después de la irradiación con rayos UV.
En el aspecto anterior, la irradiación con rayos UV puede realizarse dos o más veces con un intervalo de 18 horas a 30 horas. El número de irradiación de rayos UV no está limitado y puede ser dos veces, tres veces o más.
Además, el intervalo de irradiación de rayos UV puede ser de 18 horas a 30 horas. Por ejemplo, la segunda irradiación con rayos UV puede realizarse en 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 23 horas y 30 minutos, 23 horas y 45 minutos, 24 horas, 24 horas y 10 minutos, 24 horas y 15 minutos, 24 horas y 30 minutos, 25 horas, 26 horas, 27 horas, 28 horas, 29 horas, 30 horas o 31 horas después de la primera irradiación con rayos UV.
Además, en una realización, los melanocitos senescentes en el estado senescente más optimizado pueden obtenerse en un caso en el que los melanocitos se irradian en primer lugar con UVB a una potencia de 20 mJ/cm2 y en segundo lugar se irradian en las mismas condiciones que en la primera irradiación con rayos UV en 24 horas después de la primera irradiación con rayos UV.
En los aspectos anteriores, las células a irradiar con rayos UV pueden ser melanocitos primarios humanos.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un melanocito senescente separado preparado mediante el método descrito anteriormente.
En otro aspecto, la presente invención proporciona melanocitos senescentes para cribar un material de alivio de la senescencia o blanqueador de la piel.
En otro aspecto, la presente invención proporciona melanocitos senescentes para cribar un material de alivio de la senescencia o blanqueador de la piel.
En la presente memoria descriptiva, el índice de senescencia puede referirse a un gen del cual el nivel de expresión aumenta o disminuye específicamente en una célula senescente y por el cual puede confirmarse el grado de senescencia de la célula y un producto de expresión del gen. El índice de senescencia puede ser, por ejemplo, la actividad de la p-galactosidasa o los genes p16, p21 o p53 o una proteína de los mismos, y el índice de senescencia incluye marcadores de senescencia conocidos en la técnica.
Además, en la presente memoria descriptiva, el índice de blanqueamiento puede referirse a un gen mediante el cual puede confirmarse la pigmentación intracelular y a un producto de expresión del gen. Por ejemplo, el índice de blanqueamiento puede ser melanina.
A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá más específicamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos para facilitar la comprensión de la presente invención, y la esencia y el alcance de la presente invención no se limitan a los mismos.
[Ejemplo 1] Cultivo de melanocitos e irradiación UVB
Los melanocitos primarios humanos (Life Technologies, CA, EE.UU.) se cultivaron en una incubadora con un 5 % de CO2 a temperatura ambiente utilizando medio M-254 (Gibco BRL, NY, EE.UU.) suplementado con suplemento de crecimiento de melanocitos humanos (HMGS) (Gibco BRL, NY, EE.UU.), se colocaron en una placa de cultivo de 100 mm de modo que el número de células fuera de 2 x 105, se dejaron adherir a la pared de la placa durante la noche y se irradiaron con UVB a una potencia de 11 mJ/cm2, 20 mJ/cm2 y 30 mJ/cm2 dos veces con un intervalo de 24 horas.
Los melanocitos se cultivaron durante hasta 2 semanas mientras se cambió el medio cada 3 días para observar la citotoxicidad, el fenotipo, el índice de senescencia y similares.
[Ejemplo 2] Observación sobre la proliferación celular y la viabilidad de los melanocitos después de la irradiación con UVB
Con el fin de encontrar las condiciones de irradiación UVB que tuvieran una tasa de supervivencia aceptable sin inducir aún más la proliferación celular, se investigó la proliferación y viabilidad celular utilizando la solución wst-1 (Roche Applied Science, Alemania). Se observaron las tasas de supervivencia de las células del ejemplo 1 y de las células (grupo de control) cultivadas sin ser irradiadas con UVB después de 48 horas, 1 semana y 2 semanas (Figura 1).
Como resultado, puede observarse que el número de células aumenta rápidamente con el tiempo en el caso del grupo de control que no ha sido tratado con UVB. Por el contrario, las células irradiadas con UVB a una potencia de 11 mJ/cm2, 20 mJ/cm2 y 30 mJ/cm2 tuvieron tasas de supervivencia de alrededor del 93 %, 85 % y 75 %, respectivamente, en comparación con las células del grupo de control en 48 horas después del tratamiento. Además, las tasas de supervivencia fueron de alrededor del 71 %, 40 % y 23 %, respectivamente, en comparación con el grupo de control en 2 semanas después de la irradiación UVB. Esto indica que la proliferación celular disminuye en función de la potencia UVB y que la tasa de proliferación se inhibe significativamente, en particular a una potencia UVB igual o superior a 20 mJ/cm2. La disminución de la proliferación celular es una característica representativa de las células senescentes.
[Ejemplo 3] Observación del fenotipo de los melanocitos 2 semanas después de la irradiación UVB
Después de la irradiación UVB en las condiciones del Ejemplo 1, se observaron cambios en los melanocitos con un microscopio óptico. El fenotipo de las células se observó con un aumento de 40 veces bajo un microscopio óptico en estado vivo en el medio.
Como resultado, se ha descubierto que las células que tienen una forma aplanada en comparación con la forma inicial, un mayor tamaño del cuerpo celular, y un mayor número de dendritas, es decir, las células senescentes han aumentado entre los melanocitos en el caso de ser irradiados con UVB, el número de estas células han aumentado de una manera dependiente de la potencia UVB, y por lo tanto la heterogeneidad celular ha aumentado en su conjunto. Sin embargo, se ha confirmado que hay un gran número de células que no han sufrido senescencia y tienen un fenotipo similar al del grupo no irradiado con rayos UV en el grupo irradiado con rayos UV a una potencia de 11 mJ/cm2 y se observa un número relativamente pequeño de células vivas en el grupo irradiado con rayos UV a una potencia de 30 mJ/cm2.
[Ejemplo 4] Investigación sobre la actividad de la p-galactosidasa y la expresión de las proteínas p53 y p21 en melanocitos 2 semanas después de la irradiación UVB.
Después de la irradiación UVB en las condiciones del ejemplo 1, se ha medido la actividad p-galactosidasa, que es un índice representativo de senescencia de la célula, y se ha confirmado que la actividad aumentaba en proporción a la potencia de UVB irradiada (Figura 3a). Sin embargo, en el caso de ser irradiadas con UVB a una potencia de 11 mJ/cm2, se observaron claramente cambios fenotípicos debidos a la senescencia en algunas células, pero hay un gran número de células normales, por lo que la actividad p-galactosidasa no fue significativamente diferente de la del grupo de control. Además, se ha confirmado que las células que tienen el fenotipo senescente ilustrado en la figura 2 muestran claramente actividad p-galactosidasa en comparación con las células normales mediante un experimento de tinción (Figura 3b).
Además, para confirmar los niveles de expresión de las proteínas p53 y p21, que se sabe que se expresan en gran cantidad en las células senescentes, se irradiaron las células con UVB a las potencias respectivas y se cultivaron durante 2 semanas, se separaron de la placa de cultivo, se disgregaron añadiéndoles tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA, Millipore, 20-188) y se sometieron a centrifugación a 13.500 rpm durante 30 minutos, se separó el sobrenadante y se extrajeron las proteínas totales. Se realizó un análisis de inmunotrasnferencia de tipo Western usando un anticuerpo específico de p53 (Dako, #M7001) y un anticuerpo específico de p21 (cellsignaling #2947), y como resultado se ha confirmado que la expresión de las proteínas p53 y p21 ha aumentado tras la irradiación UVB a una potencia de 20 mJ/cm2 (Figura 3c).
[Ejemplo 5] Observación de la acumulación intracelular de melanina 2 semanas después de la irradiación UVB Los melanocitos se irradiaron con UVB a una potencia de 11 mJ/cm2, 20 mJ/cm2 y 30 mJ/cm2, respectivamente, dos veces, se cultivaron durante 2 semanas, se separaron de la placa de cultivo y se contaron, y el mismo número de células se recogió en un microtubo, se disolvió añadiendo al mismo tampón de ensayo RIPA (Millipore, 20-188) y se sometió a centrifugación a 13.500 rpm durante 30 minutos para obtener un precipitado. El precipitado se disolvió en una solución de hidróxido de sodio (NaOH) 1N, y se compararon los colores entre sí (Figura 4a), y se midió la absorbancia a 450 nm para comparar el contenido de melanina (Figura 4b).
Como resultado, se ha confirmado que el contenido de melanina en los melanocitos aumenta significativamente a medida que aumenta la potencia de UVB cuando se irradian melanocitos con UVB a una potencia de 20 mJ/cm2 y 30 mJ/cm2. Esto significa que la expresión de los índices de senescencia y el contenido de melanina aumentan al mismo tiempo en un caso en el que los melanocitos se irradian repetidamente con UVB a una potencia específica o superior y luego se cultivan durante un periodo de tiempo específico.
[Ejemplo 6] Observación del nivel de expresión de ARNm de p16 y p21 2 semanas después de la irradiación UVB
Se preparó ADNc obteniendo ARN de células 2 semanas después de ser irradiadas con UVB a una potencia de 20 mJ/cm2 dos veces con un intervalo de 24 horas, y se midió el cambio en el nivel de ARNm mediante Q-PCR (Appliedbiosystems, 7500 Fast) usando cebadores específicos de p16 y p21. Como experimento de Q-PCR, se realizó repetidamente un ciclo a 95 0C durante 15 segundos y a 60 0C durante 60 segundos 40 veces en total, y se midió el valor relativo de un aumento de la expresión génica en comparación con el de un grupo de control. Los cebadores usados son los siguientes productos TaqMan fabricados por AppliedBiosystems, respectivamente: p16 (número de producto: Hs00923894_m1) y p21 (número de producto: Hs00355782_m1)
Como resultado, se ha confirmado que la expresión de ARNm de p16 y p21 aumenta considerablemente en un modelo de pigmentación senescente en comparación con un grupo de control (Figura 6).
[Ejemplo 7] Cribado de material blanqueador para aliviar la pigmentación senescente: Confirmación del cambio en el contenido de melanina después del tratamiento con material blanqueador
Las células determinadas en el estado senescente más adecuado mediante los Ejemplos descritos anteriormente, a saber, las células preparadas irradiando los melanocitos con UVB a una potencia de 20 mJ/cm2 dos veces con un intervalo de 24 horas se cultivaron a partir de la hora 48 después de la irradiación con rayos UV en un medio que contenía Material A (melasolv, 30 pM) de un material blanqueador representativo mientras se cambiaba el medio con un intervalo de 3 días (4 veces en total). Después de dos semanas, la actividad p-galactosidasa y el contenido de melanina se compararon con los de un grupo de control (tratado con vehículo (DMSO)) (Figura 5). Como resultado, se ha confirmado que la actividad p-galactosidasa aumentó debido a que el tratamiento UVB disminuye (Figura 5a, *; p<0,05) y el contenido de melanina disminuye significativamente al nivel del grupo de control mediante el tratamiento con material A (Figura 5b, *; p < 0,05). A partir de esto, se ha confirmado que las células senescentes descritas anteriormente pueden ser útiles para cribar un material que alivie la pigmentación debida a la senescencia de los melanocitos.
[Ejemplo 8] Material blanqueador de cribado para aliviar la pigmentación senescente: Observación del cambio en la expresión de p16 y p21 después del tratamiento con material blanqueador
Se ha confirmado que el aumento de la expresión génica se inhibe significativamente cuando las células preparadas irradiando los melanocitos con UVB a una potencia de 20 mJ/cm2 dos veces con un intervalo de 24 horas se tratan con los materiales A, B y C, de los que se ha informado anteriormente que tienen un efecto blanqueador, durante 2 semanas a partir de las 48 horas después de la irradiación UVB final cuatro veces en total con un intervalo de 3 días (Figura 6, *; p < 0,05, **; p < 0,01). En particular, el efecto blanqueador se ha observado en el caso de ser tratados con el material C que no presenta un efecto blanqueador en condiciones generales de inducción de pigmentación también, y esto indica que las células modelo de pigmentación senescente son eficaces en el cribado de la pigmentación debida a la senescencia de las células pigmentarias.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un método para preparar melanocitos senescentes, comprendiendo el método:
irradiar melanocitos primarios humanos, que se han subcultivado de 1 a 12 veces, con rayos UV a una potencia de 20 a 30 mJ/cm2 dos o más veces; y
cultivar los melanocitos irradiados con rayos UV durante 14 días o más.
2. El método para preparar melanocitos senescentes según la reivindicación 1, en el que los rayos UV son UVB.
3. El método para preparar melanocitos senescentes según la reivindicación 1, en el que la potencia UV es de 20 a 25 mJ/cm2.
4. El método para preparar melanocitos senescentes según la reivindicación 1, en el que la irradiación de rayos UV se lleva a cabo en un intervalo de 18 a 30 horas.
5. El método para preparar melanocitos senescentes según la reivindicación 1, en el que la irradiación de rayos UV se lleva a cabo dos veces.
ES16852078T 2015-09-30 2016-09-29 Método para preparar melanocitos senescentes, células preparadas mediante el método y método de cribado de material que alivia la senescencia mediante el uso de células Active ES2950394T3 (es)

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