WO2017057932A1 - 노화 색소형성 세포의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 세포 및 그 세포를 이용한 노화개선 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

노화 색소형성 세포의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 세포 및 그 세포를 이용한 노화개선 물질의 스크리닝 방법 Download PDF

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melanocytes
whitening
cells
skin
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최서연
이은경
조은경
이태룡
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(주)아모레퍼시픽
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    • C12N2503/02—Drug screening
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation
    • C12N2529/10—Stimulation by light

Definitions

  • a method for producing aging pigmented cells that can be used for the study of aging phenomena of pigmented cells by repeated ultraviolet exposure and culture for a period of time, and for the study of aging pigmentation, Disclosed are melanocyte cells and methods for screening substances for improving aging or skin whitening using the cells.
  • the skin is the largest organ of the human body, occupying about 16% of the body's volume and is in direct contact with the external environment, and is important to protect the body from many deadly harmful factors such as temperature, humidity, and ultraviolet radiation. Act as a shield.
  • the skin cells are damaged by various contaminants and external environment such as strong ultraviolet rays, so that cell proliferation is not performed properly, and wrinkles, loss of elasticity and keratinization, and irregular pigmentation occur on the skin.
  • Skin aging is largely divided into natural aging (or endogenous aging) and exogenous aging, and natural aging is difficult to artificially control because it is influenced by genetic factors, whereas exogenous aging is influenced by environmental factors. It is easy.
  • Representative exogenous aging factors include ultraviolet rays, reactive oxygen species, and stress.
  • an object of the present invention is to provide a method of inducing aging of melanocytes and screening materials having both an aging improving effect and a whitening effect.
  • the invention comprises the step of irradiating the human primary melanocyte (human primary melanocyte) 1 to 12 passages of ultraviolet light at an intensity of 10 to 30 mJ / cm2, at least twice It provides a method for producing melanocytes.
  • the present invention comprises the steps of treating the aged melanocytes for improving skin aging or skin whitening candidates; And it provides a screening method of the material for improving skin aging or skin whitening comprising the step of detecting the aging index or whitening index before and after the candidate treatment.
  • the present invention includes the aging melanocytes and instructions, wherein the instructions, by measuring the amount of aging or whitening indicators before and after the treatment of the candidate substance in the aging melanocytes, the expression amount after the candidate substance treatment If the candidate substance is reduced or increased compared to the control group not treated, the present invention provides a kit for screening a material for improving skin aging or skin whitening, including a content for determining skin aging improvement or skin whitening material.
  • the aged melanocytes prepared according to the method of the present invention can be used to study the cellular aging phenomenon and pigmentation mechanism due to the accumulation of ultraviolet stimulation.
  • the cells can be screened for substances having an effect of improving aging or skin whitening, which is useful.
  • 1 is a diagram showing cell viability according to ultraviolet light intensity.
  • Figure 2 is a view of the cell phenotype according to the UV intensity: senescent cells are indicated by the arrow.
  • Figure 3 is a (a) measuring the activity of beta-galactosidase after 2 weeks of the UV intensity, the activity of beta-galactosidase after 2 weeks of irradiation 2 times 20mJ / cm2 UV
  • Figure 2b shows the expression of p53 and p21 after 2 weeks of irradiation with twice the UV irradiation of 20mJ / cm 2 (*; p ⁇ 0.05)
  • 5 is a view showing the change in activity (a) and the content of melanin (b) of beta-galactosidase after the whitening agent A (*; p ⁇ 0.05).
  • FIG. 6 is a diagram showing the change in expression (a, b, c) and the melanin content (d) of p16 and p21 when whitening substances A, B and C were treated (*; p ⁇ 0.05, * *; p ⁇ 0.01).
  • the present invention a method for producing aged melanocytes, twice the human primary melanocytes (human primary melanocytes) passaged 1 to 12 times, the UV light with an intensity of 10 to 30 mJ / cm2 Including the step of irradiating, aging melanocytes manufacturing method.
  • UVA ultraviolet rays A
  • UVB ultraviolet rays B
  • UVC ultraviolet rays C
  • wavelengths of 320 nm to 400 nm are ultraviolet rays A
  • wavelengths of 280 nm to 320 nm are ultraviolet rays B and 100 nm to ultraviolet rays.
  • 280nm is called ultraviolet C.
  • the ultraviolet light may be ultraviolet B, but is not limited thereto.
  • it may be ultraviolet A or ultraviolet C.
  • the most optimized aging melanocytes can be obtained.
  • the irradiated ultraviolet rays are included in the region of the ultraviolet ray B, there will be no significant effect difference depending on the wavelength.
  • the intensity of the ultraviolet ray may be 10 to 30 mJ / cm2, 15 to 25 mJ / cm2, but is not limited, 15mJ / cm2 or more, 16mJ / cm2 or more, 17mJ / cm2 Or more, 18 mJ / cm 2 or more, 19 mJ / cm 2 or more, 20 mJ / cm 2 or more, 21 mJ / cm 2 or more, 22 mJ / cm 2 or more, 23 mJ / cm 2 or more, 24 mJ / cm 2 or more, 25 mJ / cm 2 or less, 24 mJ / cm 2 or less, 23 mJ / M 2 or less, 22mJ / cm 2 or less, 21mJ / cm 2 or less, 20mJ / cm 2 or less, 19mJ / cm 2 or less, 18mJ / cm 2 or less, 17mJ / cm 2 or less, 16mJ / cm 2 or less, but is not
  • aging melanocytes in the most optimized state can be obtained when irradiating UVB with an intensity of 20 mJ / cm 2.
  • Aged melanocytes of the aged state optimized herein are, for example, cells with reduced metabolic activity except for normal cells that have not progressed aging in the cell population and cells that have not already survived due to cell death.
  • it can mean a cell that may or may not delay aging. That is, it may mean melanocytes in a state showing an acceptable survival rate while no longer inducing cell proliferation.
  • the aging pigmentation model may mean a cell in which pigmentation occurs due to aging, and despite the absence of any further pigment-induced stimulus, pigmentation is increased with an increase in the aging index.
  • Melanosite and the meaning can be used interchangeably.
  • the progress of aging can be confirmed by observing, for example, increased expression of p16, p21, p53, etc., known as aging markers, increased activity of beta-galactosidase, decreased cell proliferation, and phenotypic changes of cells. .
  • the ultraviolet B may refer to an ultraviolet region having a wavelength of, for example, 280 nm to 320 nm.
  • the method for producing aged melanocytes may further comprise the step of culturing the ultraviolet irradiation melanocytes for 24 hours or more.
  • At least 24 hours at least 1 day, at least 2 days, at least 3 days, at least 5 days, at least 7 days, at least 9 days, at least 11 days, at least 12 days, at least 13 days after the UV irradiation.
  • at least 14 days at least 15 days, or at least 16 days.
  • the ultraviolet irradiation may be carried out two or more times at intervals of 18 hours to 30 hours.
  • the number of ultraviolet irradiation is not limited and may be one, two, three or more times.
  • the interval of ultraviolet irradiation may be 18 hours to 30 hours, but is not limited thereto.
  • the UV secondary irradiation is 23 hours after 17 hours, after 18 hours, after 19 hours, after 20 hours, after 21 hours, after 22 hours, after 23 hours, and after 23 hours After 30 minutes, 23 hours, 45 minutes, 24 hours, 24 hours, 10 minutes, 24 hours, 15 minutes, 24 hours, 30 minutes, 25 hours, 26 hours, 27 hours After elapsed, after 28 hours, after 29 hours, after 30 hours or after 31 hours.
  • the most optimized aging state can be obtained melanocytes.
  • the UV-irradiated cells may be human primary melanocytes.
  • the present invention in another aspect, is an isolated, aged melanocytes produced by the process.
  • the present invention may, in another aspect, relate to the use of aged melanocytes for screening substances for improving aging or for skin whitening.
  • the present invention may, in another aspect, relate to aged melanocytes for screening aging or skin whitening material.
  • the present invention comprises the steps of treating the candidate for improving skin aging or skin whitening; And detecting an aging index or a whitening index before and after treatment with the candidate substance, for screening a material for improving skin aging or skin whitening.
  • the aging index may specifically refer to a gene capable of confirming the degree of aging of a cell by increasing or decreasing the amount of expression in an aged cell, and an expression product of the gene.
  • Aging indicators may be, for example, the activity of beta-galactosidase, p16, p21 or p53 genes or proteins thereof, but are not limited thereto and include known aging markers known in the art.
  • the whitening index may refer to a gene capable of confirming intracellular pigmentation and an expression product of the gene.
  • it may be melanin.
  • the screening method for improving skin aging or skin whitening candidate material if the expression amount of the aging index or whitening index after treatment of the candidate material is reduced or increased compared to the control group not treated with the candidate material
  • the method may further include determining a substance for improving skin aging or skin whitening.
  • both the aging indicator and the amount of melanin accumulation are reduced or increased after treatment of the skin aging improvement candidate and the skin whitening candidate, it is determined to have the effect of improving skin aging and skin whitening at the same time. It may be.
  • the present invention is a kit for screening a material for improving skin aging or skin whitening.
  • the kit may include the aged melanocytes and instructions, wherein the instructions, by measuring the expression amount of the aging indicator or whitening indicator before and after the candidate substance treatment on the aging melanocytes, the expression amount did not process the candidate substance When reduced or increased compared to the control, it may include information that is determined to improve skin aging or skin whitening material.
  • the normal or aged melanosite may be in a cryopreserved or carrier preserved state.
  • Aged melanocytes included in the kit may be included in the kit with the optimal aging state preserved by techniques well known to those skilled in the art, in addition to the techniques listed above, to minimize further cell proliferation or aging.
  • the aging indicator may be one or more selected from the group consisting of beta-galactosidase, p16, p21, and p53, but is not limited thereto.
  • the whitening indicator may be melanin, but is not limited thereto.
  • M-254 medium supplemented with human primary melanocytes (Life Technologies, CA, USA) with human melanocyte growth supplement (HMGS), Gibco BRL, NY, USA Gibco BRL, NY, USA) and incubated at room temperature, 5% CO 2 incubator using a cell number of laying a 100mm culture dish so that the 2 ⁇ 10 5, and wait for cells to catch the gibyeok overnight, 11mJ / cm2 , UV irradiation B of 20mJ / cm 2, 30mJ / cm 2 intensity was irradiated twice at intervals of 24 hours.
  • HMGS human melanocyte growth supplement
  • the melanocytes were exchanged every 3 days and cultured for up to 2 weeks, and cytotoxicity, phenotype, and aging indices were observed.
  • the change of the pigmentation cell was observed with the optical microscope.
  • the phenotype of the cells was observed by magnification of 40 times with an optical microscope in the living state containing the medium.
  • the shape of the melanocytes was flatter, the size of the cell body increased, the number of dendrite increased, that is, the aged cells As the number of these cells increased in intensity-dependent manner, the overall heterogeneity of the cells was increased.
  • the group irradiated with UV light at 11mJ / cm 2 intensity had many unaging cells showing a phenotype similar to the group not irradiated with UV light, and the group irradiated with UV light at 30mJ / cm 2 intensity showed relatively few living cells. It was.
  • beta-galactosidase activity which is a representative aging indicator of cells, was measured, and the activity was increased in proportion to the intensity of the irradiated UVB (FIG. 3A).
  • the phenotypic change due to aging was clearly observed in some cells, but the activity of beta-galactosidase was significantly higher than that of the control group because of the presence of a large amount of normal cells. No difference was seen.
  • the cells showing the aging phenotype shown in Figure 2 was confirmed through the color development experiments showing the beta-galactosidase activity significantly compared to normal cells (Fig. 3b).
  • Lysis buffer Radioimmunoprecipitation assay buffer, Millipore, 20-188 was added to break the cells, centrifuged at 13,500 rpm for 30 minutes, and the supernatant was separated to extract the total protein.
  • Pigment-forming cells were irradiated with UVB B of 11 mJ / cm 2, 20 mJ / cm 2, and 30 mJ / cm 2, respectively, twice and incubated for two weeks, and then the cells were removed from the culture dish and counted. After pooling, RIPA lysis buffer (Millipore, 20-188) was added to break the cells and centrifuged at 13,500 rpm for 30 minutes to obtain a precipitate. The precipitate was dissolved in 1N sodium hydroxide (NaOH), the color was compared (FIG. 4A), and the absorbance was measured at 450 nm to compare the melanin content (FIG. 4B).
  • UVB B UVB
  • the melanin content of the pigment-forming cells was significantly increased as the intensity of the UVB irradiation at 20mJ / cm2, 30mJ / cm2. This means that if the pigment-forming cells are repeatedly irradiated with ultraviolet rays B over a certain intensity and then cultured for a specific period of time, the expression of aging indicators is increased and the melanin content is increased.
  • Q-PCR Applied biosystems, 7500 Fast
  • Primers used were TaqMan manufactured by Applied Biosystems, respectively: p16 (product number: Hs00923894_m1), p21 (product number: Hs00355782_m1)
  • the cells determined to have the most suitable aging state that is, the cells irradiated with UVB B of 20 mJ / cm 2 intensity twice at 24 hour intervals, the representative whitening function from 48 hours after UV irradiation
  • the medium containing the material A (melasolv, 30 uM) was incubated at intervals of three days (four times in total).
  • beta-galactosidase activity and melanin content were compared with the control (vehicle (DMSO) treatment) (FIG. 5).
  • DMSO vehicle
  • Example 8 Screening of Whitening Substances to Improve Aging Pigmentation: Observation of Expression Changes of p16 and p21 after Treatment of Whitening Substances

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Abstract

본 명세서에는, 노화 멜라노사이트 제조방법과, 제조방법에 의해 제조된 노화세포 및 상기 노화세포를 이용하여 노화개선 또는 피부 미백용 물질을 스크리닝하는 방법이 개시된다. 상기 세포를 이용하여 자외선 자극의 누적으로 인한 세포 노화 현상과 색소 침착 기전을 연구하는데 사용할 수 있다. 특히, 노화 개선과 피부 미백의 효과를 동시에 갖는 물질을 선별할 수 있으므로 유용하다.

Description

노화 색소형성 세포의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 세포 및 그 세포를 이용한 노화개선 물질의 스크리닝 방법
본 명세서에는 반복적 자외선 노출 및 일정 기간 동안의 배양에 의한 색소형성 세포의 노화 현상의 연구 및 노화성 색소침착의 연구에 사용할 수 있는 노화 색소형성 세포를 제조하는 방법, 그 방법에 의해 제조된 노화된 멜라노사이트 세포와, 그 세포를 이용하여 노화개선 또는 피부 미백용 물질을 스크리닝하는 방법이 개시된다.
최근 생활수준이 향상됨에 따라 현대인들은 건강한 신체를 유지하는 것에 더하여 건강한 피부를 유지하는 데에도 많은 관심을 기울이고 있다. 따라서 피부미용과 피부노화 개선에 대한 관심이 높아지고 있다.
피부는 인체의 가장 큰 기관으로서 전체 인체 부피의 약 16%를 차지하고, 외부환경과 직접 접해 있으면서, 인체 안으로 침입하려는 치명적인 많은 유해인자, 예를 들면, 온도, 습도 및 자외선 등으로부터 인체를 보호하는 중요한 보호막 역할을 담당한다. 그러나, 각종 오염물질, 강한 자외선과 같은 외부환경으로 인해 피부 세포들이 손상을 입게 되어, 세포 증식이 제대로 이루어지지 않게 되어 피부에 주름, 탄력 손실 및 각질화, 불규칙한 색소 침착 등이 발생한다.
피부 노화는 크게 자연 노화(또는, 내인성 노화)와 외인성 노화로 구분되며, 자연 노화는 유전적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 어려운 반면 외인성 노화는 환경적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 비교적 용이하다. 대표적인 외인성 노화 인자로는 자외선, 활성 산소종(reactive oxygen species) 및 스트레스 등이 알려져 있다.
따라서, 최근 외인성 노화를 개선하기 위한 방법들이 활발히 연구되고 있으며, 특히 노화방지 또는 개선을 위한 물질을 규명하기 위한 노력이 계속되고 있다.
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 노화성 색소 침착 연구에 사용할 수 있는 노화된 색소형성 세포(멜라노사이트)를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 반복적 자외선 노출 및 일정 기간의 배양을 통해 얻어진 노화된 멜라노사이트를 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 멜라노사이트의 노화를 유도하여 노화 개선 또는 미백 효과가 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 멜라노사이트의 노화를 유도하여 노화 개선 효과와 미백 효과를 동시에 갖는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 자외선을 10 내지 30 mJ/㎠의 세기로, 1 내지 12회 계대배양한 인간 1차 멜라노사이트(human primary melanocyte)에 2회 이상 조사하는 단계를 포함하는, 노화된 멜라노사이트 제조방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 노화된 멜라노사이트에 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질 처리 전후의 노화 지표 또는 미백 지표를 검출하는 단계를 포함하는, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 노화된 멜라노사이트 및 지시서를 포함하며, 상기 지시서에는, 노화 멜라노사이트에 후보 물질 처리 전후의 노화 지표 또는 미백 지표의 발현양을 측정하여, 발현양이 후보 물질 처리 후에 후보 물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 감소 또는 증가한 경우, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질로 판단하는 내용을 포함하는, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질의 스크린용 키트를 제공한다.
일 측면에 있어서, 본 발명의 제조방법에 따라서 제조된 노화된 멜라노사이트는, 자외선 자극의 누적으로 인한 세포 노화 현상과 색소 침착 기전을 연구하는데 사용할 수 있다. 또한, 상기 세포를 이용하여 노화 개선 또는 피부 미백 효과가 있는 물질을 스크리닝할 수 있어, 유용하다.
도 1은 자외선 세기에 따른 세포 생존율을 보이는 도이다.
도 2는 자외선 세기에 따른 세포 표현형을 관찰한 도이다: 노화세포를 화살표로 표시하였음.
도 3은 자외선 세기에 따른 2주 경과 후 베타-갈락토시다아제의 활성을 측정한 도(a), 20mJ/㎠의 자외선을 2회 조사한 후 2주 경과시 베타-갈락토시다아제의 활성을 염색하여 표시한 도(b) 및 20mJ/㎠의 자외선을 2회 조사한 후 2주 경과시 p53과 p21의 발현을 보이는 도(c)이다(*; p<0.05)
도 4는 자외선 세기에 따른 멜라닌의 함량을 확인한 도이다(*; p<0.05).
도 5는 미백용 물질 A를 처리한 후 베타-갈락토시다아제의 활성 변화(a), 멜라닌의 함량 변화(b)를 보이는 도이다(*; p<0.05).
도 6은 미백용 물질 A, B 및 C를 각각 처리했을 경우, p16 및 p21의 발현변화(a, b, c)와 멜라닌 함량의 변화(d)를 보이는 도이다(*; p<0.05, **; p<0.01).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은, 노화된 멜라노사이트를 제조하는 방법으로서, 자외선을 10 내지 30 mJ/㎠의 세기로, 1 내지 12회 계대배양한 인간 1차 멜라노사이트(human primary melanocyte) 에 2회 이상 조사하는 단계를 포함하는, 노화된 멜라노사이트 제조방법이다.
자외선은, 일반적으로 파장에 의해 자외선A(UVA), 자외선B(UVB) 및 자외선C(UVC) 로 나뉘며, 통상, 320nm~400nm의 파장은 자외선A, 280nm~320nm의 파장은 자외선B, 100nm~280nm는 자외선C라 한다.
상기와 같은 측면에서, 상기 자외선은 자외선B일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 자외선A 또는 자외선C일 수 있다.
일 구현예에서, 세포에 자외선B를 조사한 경우, 가장 최적화된 노화상태의 노화된 멜라노사이트를 얻을 수 있다. 다만, 조사하는 자외선이 자외선B의 영역에 포함된다면, 파장에 따른 큰 효과 차이는 없을 것이다.
또한, 상기와 같은 측면에서, 상기 자외선의 세기는 10 내지 30 mJ/㎠ 일 수 있고, 15 내지 25 mJ/㎠ 일 수 있으나, 제한되지 않고, 15mJ/㎠ 이상, 16mJ/㎠ 이상, 17mJ/㎠ 이상, 18mJ/㎠ 이상, 19mJ/㎠ 이상, 20mJ/㎠ 이상, 21mJ/㎠ 이상, 22mJ/㎠ 이상, 23mJ/㎠ 이상, 24mJ/㎠ 이상일 수 있고, 25mJ/㎠ 이하, 24mJ/㎠ 이하, 23mJ/㎠ 이하, 22mJ/㎠ 이하, 21mJ/㎠ 이하, 20mJ/㎠ 이하, 19mJ/㎠ 이하, 18mJ/㎠ 이하, 17mJ/㎠ 이하, 16mJ/㎠ 이하일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 자외선B를 20mJ/㎠의 세기로 조사할 때 가장 최적화된 상태의 노화된 멜라노사이트를 얻을 수 있다.
본 명세서에서 최적화된 노화상태의 노화된 멜라노사이트는, 예컨대, 세포 군집 중 노화가 진행되지 않은 정상세포 및 이미 세포 사멸이 일어나서 살아있지 않은 세포를 제외하고 대사 활동이 저하된 세포로서, 노화 개선 혹은 방지 물질 처리시, 노화가 지연되거나 일어나지 않을 수 있는 세포를 의미할 수 있다. 즉, 더이상 세포 증식을 유도하지 않으면서, 허용 가능한 생존률을 보이는 상태의 멜라노사이트를 의미할 수 있다.
또한, 본 명세서에서, 노화성 색소침착 모델이란, 노화로 인해 색소 침착이 생긴 세포를 의미할 수 있으며, 더 이상의 색소 유발 자극원이 없음에도 불구하고 노화 지표의 증가와 함께 색소 침착이 증가 되어 있는 멜라노사이트와 의미가 혼용되어 사용될 수 있다.
또한, 상기 노화 진행 정도는, 예컨대, 노화 표지로 알려져 있는, p16, p21, p53 등의 발현 증가, 베타-갈락토시다아제의 활성 증가, 세포 증식율 저하 및 세포의 표현형 변화 통해 관찰하여 확인할 수 있다.
본 명세서에서 자외선B는, 예컨대, 280nm 내지 320nm의 파장을 갖는 자외선 영역을 의미할 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 노화된 멜라노사이트의 제조방법은, 상기 자외선 조사된 멜라노사이트를 24시간 이상 배양시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 자외선 조사된 세포를 자외선 조사 후 24시간 이상, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 5일 이상, 7일 이상, 9일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상, 15일 이상 또는 16일 이상 동안 배양시킬 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 자외선 조사는 18시간 내지 30시간 간격으로 2회 이상 실시할 수 있다. 자외선 조사 횟수는 제한되지 않고 1회, 2회, 3회 또는 그 이상일 수 있다.
또한, 자외선 조사의 간격은 18시간 내지 30시간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 자외선 2차 조사는, 자외선 1차 조사 후 17시간 경과 후, 18시간 경과 후, 19시간 경과 후, 20시간 경과 후, 21시간 경과 후, 22시간 경과 후, 23시간 경과 후, 23시간 30분 경과 후, 23시간 45분 경과 후, 24시간 경과 후, 24시간 10분 경과 후, 24시간 15분 경과 후, 24시간 30분 경과 후, 25시간 경과 후, 26시간 경과 후, 27시간 경과 후, 28시간 경과 후, 29시간 경과 후, 30시간 경과 후 또는 31시간 경과 후에 실시될 수 있다.
또한, 일 구현예에서, 자외선B를 20mJ/㎠의 세기로 멜라노사이트에 1차 조사한 후 24시간 경과 후 1차 자외선 조사 때와 동일한 조건으로 자외선을 2차 조사한 경우, 가장 최적화된 노화상태의 노화된 멜라노사이트를 얻을 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 자외선 조사를 받는 세포는 인간 1차 색소 형성 세포(human primary melanocyte)일 수 있다.
본 발명은, 다른 측면에서, 상기 방법에 의하여 제조된 분리된, 노화된 멜라노사이트이다.
본 발명은, 또 다른 측면에서, 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질을 스크리닝하기 위한 노화된 멜라노사이트의 용도에 관한 것일 수 있다.
본 발명은, 또 다른 측면에서, 노화 개선 또는 피부 미백 물질 스크린용 노화된 멜라노사이트에 관한 것일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질 처리 전후의 노화 지표 또는 미백 지표를 검출하는 단계를 포함하는, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질의 스크리닝 방법이다.
본 명세서에서, 노화 지표란, 노화된 세포에서 특이적으로 발현양이 증가하거나 감소하여, 세포의 노화 정도를 확인할 수 있는 유전자, 그 유전자의 발현산물을 의미할 수 있다. 노화 지표는, 예컨대, 베타-갈락토시다아제(β- galactosidase)의 활성, p16, p21 또는 p53 유전자 또는 그 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 업계에 알려진 공지의 노화 표지를 포함한다.
또한, 본 명세서에서 미백 지표란, 세포 내 색소 침착 여부를 확인할 수 있는 유전자, 그 유전자의 발현 산물을 의미할 수 있다. 예컨대, 멜라닌일 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 후보물질의 스크리닝 방법은, 상기 후보물질의 처리 후에 노화 지표 또는 미백 지표의 발현양이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 감소 또는 증가하면, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 피부 노화 개선용 후보물질과 피부 미백용 후보물질의 처리 후에 상기 노화지표와 멜라닌의 축적양이 모두 감소 또는 증가하면, 피부 노화 개선과 피부 미백의 효과를 동시에 갖는 물질로 결정하는 것일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질의 스크린용 키트이다. 상기 키트는 상기 노화된 멜라노사이트 및 지시서를 포함할 수 있으며, 상기 지시서에는, 노화 멜라노사이트에 후보 물질 처리 전후의 노화 지표 또는 미백 지표의 발현양을 측정하여, 발현양이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 감소 또는 증가한 경우, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질로 판단하는 내용을 포함할 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 정상 또는 상기 노화된 멜라노사이트는, 냉동보존 또는 담체 보존된 상태인 것일 수 있다. 상기 키트 내에 포함되는 노화된 멜라노사이트는, 추가적인 세포 증식이나 노화를 최소화하기 위해, 상기 나열된 기술 외에도 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해, 최적의 노화 상태가 보존된 채로 키트 내에 포함될 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 노화 지표는 베타-갈락토시다아제(β- galactosidase), p16, p21 및 p53으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 미백 지표는 멜라닌일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시에는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지 않는다.
[실시예 1] 색소형성 세포의 배양 및 자외선 B 조사
인간 1차 색소형성 세포(human primary melanocyte, Life Technologies, CA, USA)를 인간 색소형성 세포 성장 보충물(human melanocyte growth supplement(HMGS), Gibco BRL, NY, USA)을 첨가한 M-254 배지(Gibco BRL, NY, USA)를 이용하여 상온, 5% CO2 배양기에서 배양한 후, 세포수가 2×105이 되도록 100mm 배양 접시에 깔고, 하룻밤 동안 세포가 기벽에 붙기를 기다린 후, 11mJ/㎠, 20mJ/㎠, 30mJ/㎠ 세기의 자외선B를 24시간 간격으로 2번 조사하였다.
상기 멜라닌 세포를 3일에 한번씩 배지를 교환하여 주며 최대 2주 동안 배양하면서 세포 독성, 표현형, 노화 지표들을 관찰하였다.
[실시예 2] 색소 형성 세포의 자외선B 조사 후 세포 증식 및 생존 관찰
더이상 세포 증식을 유도하지 않으면서, 허용 가능한 생존율을 보이는 자외선B 조사 조건을 찾기 위해, wst-1 (Roche Applied Science, Germany)용액을 이용하여 세포의 증식 및 생존율을 조사하였다. 실시예 1의 세포와, 자외선B를 조사하지 않고 배양한 세포(대조군)의 48시간, 1주일, 2주일 후의 생존율을 관찰하였다(도 1).
그 결과, 자외선B를 처리하지 않은 대조군의 경우, 시간이 지나면서 그 수가 급격히 증가하는 것을 알 수 있다. 이에 비해, 11mJ/㎠, 20mJ/㎠, 30mJ/㎠ 자외선 B 조사를 받은 세포들은 처리 후 48시간 경과시, 대조군의 세포수와 비교하여 각각 약 93%, 85%, 75%의 생존율을 보였다. 또한, 자외선B 조사 후 2주 경과 시, 대조군 대비 각각 약 71%, 40%, 23%의 생존율을 보였다. 이는 자외선B 세기 의존적으로 세포의 증식이 저하되고, 특히 20 mJ/㎠ 이상의 자외선B 세기에서는 그 증식률이 유의미하게 억제됨을 보인다. 세포의 증식 저하는 대표적인 노화(senescent) 세포의 특성이다.
[실시예 3] 자외선B 조사 2주 경과 후 색소형성 세포의 표현형 관찰
실시예 1의 조건으로 자외선B를 조사한 후, 색소형성 세포의 변화를 광학 현미경으로 관찰하였다. 세포의 표현형은 배지가 포함되어 있는 살아있는 상태에서 광학 현미경으로 40배 확대하여 관찰하였다.
그 결과, 자외선B를 조사한 경우 멜라닌 세포들 중에는 그 모양이 초기에 비하여, 평평해지고, 세포체(cell body)의 크기가 증가하며, 가지돌기(dendrite)의 개수가 증가된, 즉, 노화된 세포들이 증가하였으며, 이러한 세포들의 수가 자외선B의 세기 의존적으로 늘어남으로써, 전체적으로 세포간 이질성(heterogeneity)이 증가되었음을 알 수 있었다. 다만, 11mJ/㎠ 세기로 자외선 조사한 군은, 자외선을 조사하지 않은 군과 비슷한 표현형을 보이는 노화되지 않은 세포가 많이 존재하였고, 30mJ/㎠ 세기로 자외선 조사한 군은 살아 있는 세포가 비교적 적게 관찰됨을 확인하였다.
[실시예 4] 자외선B 조사 2주 경과 후의 색소형성 세포의 베타-갈락토시다아제 활성과 p53, p21 단백질 발현 조사
실시예 1의 조건으로 자외선B를 조사한 후, 세포의 대표적 노화 지표인 베타-갈락토시다아제 활성을 측정한 결과, 조사한 자외선B의 세기에 비례하여 그 활성이 증가함을 확인하였다(도 3a). 단, 11mJ/㎠ 세기의 자외선B를 조사한 경우, 일부 세포들에서 노화로 인한 표현형 변화가 확실히 관찰되나, 정상 세포가 다량으로 존재하기 때문에 베타-갈락토시다아제의 활성이 대조군과 비교하여 유의적 차이가 보이지 않았다. 또한, 도 2에서 보여진 노화성 표현형을 보이는 세포들은 정상세포들 대비 확연히 베타-갈락토시다아제 활성을 보이는 것을 발색 실험을 통해 확인하였다(도 3b).
또한, 노화된 세포에서 다량 발현되는 것으로 알려진, p53과 p21의 단백질의 발현량을 확인하기 위해, 세포에 각 세기의 자외선B를 조사한 후 2주 동안 배양하고, 세포를 배양접시에서 떼어낸 후 RIPA 용해 버퍼 (Radioimmunoprecipitation assay buffer, Millipore, 20-188)를 넣어 세포를 부수고 13,500 rpm으로 30분 원심 분리하고 상층액을 분리하여 총 단백질을 추출하였다. p53 특이적 항체(Dako, #M7001)와 p21 특이적 항체(cell signaling #2947)를 이용하여 웨스턴 블랏을 한 결과, 20mJ/㎠ 자외선 B 조사 후 p53과 p21 단백질의 발현이 증가하였음을 확인하였다(도 3c).
[실시예 5] 자외선B 조사 2주 경과 후 세포 내 멜라닌 축적 관찰
색소 형성 세포에 각각 11mJ/㎠, 20mJ/㎠, 30mJ/㎠ 세기의 자외선B 를 2회 조사하고 2주일간 배양한 후, 그 세포를 배양 접시에서 떼어 그 수를 센 후, 같은 수의 세포를 마이크로 튜브에 모은 다음, RIPA 용해 버퍼(Millipore, 20-188)를 넣어 세포를 부수고 13,500 rpm으로 30분 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 침전물을 1N 수산화나트륨(NaOH)에 용해 시켜, 그 색을 비교하고(도 4a), 450nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌의 함유량을 비교하였다(도 4b)
그 결과, 색소 형성 세포의 멜라닌의 함량은 20mJ/㎠, 30mJ/㎠의 자외선 B 조사시 그 세기가 증가함에 따라 유의미하게 증가됨을 확인하였다. 이는 색소 형성 세포에 특정 세기 이상의 자외선 B를 반복적으로 조사한 후 특정 기간 동안 배양하는 경우, 노화성 지표들의 발현이 증가됨과 동시에, 멜라닌 함량이 증가됨을 의미한다.
[실시예 6] 자외선B 조사 2주 경과 후 p16, p21의 mRNA 발현량 관찰
20mJ/㎠ 세기의 자외선B를 24시간 간격으로 2회 조사한 후 2주 뒤의 세포에서 RNA를 수득하여 cDNA를 제작하였고 p16, p21 특이적 프라이머를 이용하여 Q-PCR(Applied biosystems, 7500 Fast)로 mRNA양의 변화를 측정하였다. Q-PCR의 실험은 95℃에서 15초, 60℃에서 60초 싸이클을 총 40회 반복하였으며, 대조군과 비교하여 해당 유전자 발현이 얼마나 증가하였는지 상대적인 값을 측정하였다. 사용한 프라이머는 Applied Biosystems에서 제조한 TaqMan 제품으로 각각 다음과 같다: p16 (제품번호: Hs00923894_m1), p21 (제품번호: Hs00355782_m1)
그 결과, 대조군 대비 노화성 색소 침착 모델에서 p16 과 p21의 mRNA 발현이 크게 증가함을 확인하였다(도 6).
[실시예 7] 노화성 색소 침착을 개선하는 미백용 물질의 스크리닝 : 미백용 물질 처리 후 멜라닌 함량 변화 확인
상기 실시예들을 통해, 가장 적합한 노화 상태를 보유한다고 판단된 세포, 즉, 색소 형성 세포에 20mJ/㎠ 세기의 자외선B를 24시간 간격으로 2회 조사한 세포를, 자외선 조사 후 48시간부터 대표적 미백 기능 소재인 물질 A(melasolv, 30 uM)를 포함한 배지로 3일 간격으로 갈아주며 배양하였다(총 4회). 2주 후, 베타-갈락토시다아제의 활성과 멜라닌 함량을 대조군(비히클(DMSO) 처리)과 비교하였다(도 5). 그 결과 자외선B 처리로 인해 증가되었던 베타-갈락토시다아제의 활성이 감소됨(도 5a; *, p<0.05)과 더불어 멜라닌 함량이 물질A 처리에 의해 대조군 수준으로 확연하게 감소되는 것을 확인하였다(도 5b; *, p<0.05). 이를 통하여, 상기 노화 세포는, 색소 형성세포의 노화에서 기인한 색소 침착을 개선하는 물질을 유용하게 스크리닝할 수 있음을 확인하였다.
[실시예 8] 노화성 색소 침착을 개선하는 미백용 물질의 스크리닝 : 미백용 물질 처리 후 p16, p21의 발현 변화 관찰
색소 형성 세포에 20mJ/㎠ 세기의 자외선B를 24시간 간격으로 2회 조사한 세포에, 기존에 미백효과가 있다고 보고된 물질A, 물질B, 물질C를, 자외선 B 최종 조사 후 48시간부터 2주간 3일 간격으로, 총 4회 처리시, 증가되었던 상기 유전자 발현이 현저히 억제되었음을 확인하였다(도 6; *, p<0.05, **, p<0.01). 특히, 일반 색소 침착 유도 조건에서는 미백 효능을 보이지 않는 물질 C를 처리한 경우도 미백 효과가 관찰되었는데, 이는 상기 노화성 색소 침착 모델 세포가 색소 세포 노화에 기인한 색소 침착을 스크리닝하는데 효과적임을 보여준다.

Claims (17)

  1. 노화된 멜라노사이트를 제조하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    자외선을, 10 내지 30 mJ/㎠의 세기로, 1 내지 12회 계대배양한 인간 1차 멜라노사이트(human primary melanocyte)에 2회 이상 조사하는 단계를 포함하는, 노화된 멜라노사이트 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 자외선 조사된 멜라노사이트를 24시간 이상 배양시키는 단계를 더 포함하는, 노화된 멜라노사이트 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 자외선 조사된 멜라노사이트를 7일 이상 배양시키는 것인, 노화된 멜라노사이트 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 자외선은, 자외선B인, 노화된 멜라노사이트 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 자외선 세기는,
    15 내지 25 mJ/㎠인, 노화된 멜라노사이트 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 자외선 조사는, 18 내지 30시간 간격으로 실시하는, 노화된 멜라노사이트 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 자외선 조사는, 2회 실시하는, 노화된 멜라노사이트 제조방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된, 분리된, 노화된 멜라노사이트.
  9. 제1항의 세포에, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질 처리 전후의 노화 지표 또는 미백 지표를 검출하는 단계를 포함하는, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질의 스크리닝 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 후보물질의 처리 후에 노화 지표 또는 미백 지표의 발현양이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 감소 또는 증가하면, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질로 결정하는 단계를 더 포함하는, 스크리닝 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 노화 지표 및 미백 지표의 발현양이 모두 감소 또는 증가하면, 피부 노화개선과 피부 미백의 효과를 동시에 갖는 물질로 결정하는, 스크리닝 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 노화 지표는 베타-갈락토시다아제(β- galactosidase), p16, p21 및 p53으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 스크리닝 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 미백 지표는 멜라닌인, 스크리닝 방법.
  14. 제8항의 세포; 및
    지시서를 포함하며,
    상기 지시서에는, 후보 물질 처리 전후의 노화 지표 또는 미백 지표를 측정하여, 발현양이 후보 물질 처리 후에 후보 물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 감소 또는 증가한 경우, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질로 판단하는 내용을 포함하는, 피부 노화 개선용 또는 피부 미백용 물질의 스크린용 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 세포는 냉동보존 또는 담체 보존된 상태인, 키트.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 노화 지표는 베타-갈락토시다아제(β- galactosidase), p16, p21 및 p53으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 키트.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 미백 지표는, 멜라닌인, 키트.
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