JP2021153596A - 老化色素形成細胞の製造方法、その方法によって製造された細胞、及びその細胞を用いた老化改善物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
型変化から観察して確認することができる。
2日以上、3日以上、5日以上、7日以上、9日以上、11日以上、12日以上、13日以上、14日以上、15日以上、又は16日以上間培養させていてよい。
前記老化指標とメラニンの蓄積量がいずれも減少又は増加すると、皮膚老化改善と皮膚美白の効果とを併せ持つ物質と決めていてよい。
ヒト初代色素形成細胞(human primary melanocyte、Life Technologies、CA、USA)をヒト色素形成細胞成長補充物(human melanocyte growth supplement(HMGS)、Gibco BRL、NY、USA)を添加したM-254培地(Gibco BRL、NY
、USA)を利用して、常温、5%のCO2培養器で培養した後、細胞数が2×105になるように100mm培養皿に敷いて、一晩中細胞が器壁にくっ付くことを待った後、11mJ/cm2、20mJ/cm2、30mJ/cm2の強さの紫外線Bを24時間置きに2回照射した。
さらなる細胞増殖を誘導することなく、許容可能な生存率を示す紫外線Bの照射条件を見出すために、wst-1(Roche Applied Science、Germa
ny)溶液を用いて細胞の増殖及び生存率を調査した。実施例1の細胞と、紫外線Bを照射せずに培養した細胞(対照群)の48時間、1週間、2週間後の生存率を観察した(図1)。
enescent)細胞の特性である。
実施例1の条件で紫外線Bを照射した後、色素形成細胞の変化を光学顕微鏡で観察した。細胞の表現型は、培地中の生きている状態で、光学顕微鏡下で40倍拡大して観察された。
性とp53、p21タンパク質発現の調査
実施例1の条件で紫外線Bを照射した後、細胞の代表的老化指標であるβ-ガラクトシ
ダーゼ活性を測定した結果、照射した紫外線Bの強さに比例してその活性が増加することを確認した(図3a)。なお、11mJ/cm2の強さの紫外線Bを照射した場合、一部の細胞で老化による表現型の変化が確かに観察されるものの、正常細胞が多量で存在することから、β-ガラクトシダーゼの活性が対照群に比べて有意差がみられなかった。また
、図2で示された老化性表現型をみせる細胞は、正常細胞に比べて確然とβ-ガラクトシ
ダーゼ活性を示すことを発色実験から確認した(図3b)。
て細胞を壊し、13,500rpmで30分間遠心分離し、上層液を分離して、総タンパ
ク質を抽出した。p53特異的抗体(Dako、#M7001)とp21特異的抗体(c
ell signaling #2947)を用いてウェスタンブロットを行った結果、
20mJ/cm2の紫外線Bの照射後にp53とp21タンパク質の発現が増加したことを確認した(図3c)。
色素形成細胞にそれぞれ11mJ/cm2、20mJ/cm2、30mJ/cm2の強さの紫外線Bを2回照射し2週間培養した後、その細胞を培養皿から引き剥がしてその数を数え、次いで、同数の細胞をマイクロチューブに集めた後、RIPA溶解バッファー(Millipore、20-188)を入れて細胞を壊し、13,500rpmで30分
間遠心分離して、沈殿物を得た。沈殿物を1Nの水酸化ナトリウム(NaOH)に溶解させ、その色を比較し(図4a)、450nmにおける吸光度を測定して、メラニンの含有量を比較した(図4b)。
20mJ/cm2の強さの紫外線Bを24時間置きに2回照射してから2週後の細胞からRNAを収得してcDNAを製作し、p16、p21特異的プライマーを用いてQ-P
CR(Applied biosystems、7500Fast)にてmRNA量の変化を測定した。Q-PCRの実験では、95℃で15秒、60℃で60秒のサイクルを総
40回繰り返し行い、対照群に比べて当該遺伝子の発現がどの程度増加したかの相対的な値を測定した。用いたプライマーは、Applied Biosystems製の商品名TaqManであって、それぞれ次のとおりである:p16(製品番号:Hs00923894_m1)、p21(製品番号:Hs00355782_m1)
理後のメラニン含量変化の確認
前記実施例を通じて、最も適合した老化状態を保持すると判断された細胞、すなわち、色素形成細胞に20mJ/cm2の強さの紫外線Bを24時間置きに2回照射して得た細胞を、紫外線の照射後48時間から代表的美白機能素材である物質A(melasolv、30μM)を含む培地で3日置きに該培地を交換しながら培養した(総4回)。2週後、β-ガラクトシダーゼの活性とメラニン含量を対照群(ビヒクル(DMSO)処理)と
比較した(図5)。その結果、紫外線Bの処理によって増加していたβ-ガラクトシダー
ゼの活性が減少する(図5a;*、p<0.05)とともに、メラニン含量が物質Aの処
理によって対照群の水準に確然と減少することを確認した(図5b;*、p<0.05)
。このことから、前記老化細胞は、色素形成細胞の老化に起因した色素沈着を改善する物質を有用にスクリーニングすることができることを確認した。
色素形成細胞に20mJ/cm2の強さの紫外線Bを24時間置きに2回照射して得た細胞に、既存に美白効果があると報告された物質A、物質B、物質Cを、紫外線Bの最終照射後48時間から2週間、3日置きに、総4回処理したとき、増加していた前記遺伝子発現が顕著に抑え込まれることを確認した(図6;*、p<0.05、**、p<0.01
)。特に、一般の色素沈着誘導条件では美白効能を示さなかった物質Cを処理した場合でも美白効果が観察されたが、これは、前記老化性色素沈着モデル細胞が色素細胞老化に起因した色素沈着をスクリーニングするのに有効であることを示す。
Claims (17)
- 老化したメラノサイトを製造する方法であって、
当該方法は、
紫外線を、10〜30mJ/cm2の強さで、1〜12回継代培養したヒト初代メラノサイト(human primary melanocyte)に2回以上照射する段階を含む、老化したメラノサイトの製造方法。 - 前記紫外線が照射されたメラノサイトを24時間以上培養させる段階をさらに含む、請求項1に記載の老化したメラノサイトの製造方法。
- 前記紫外線が照射されたメラノサイトを7日以上培養させる、請求項2に記載の老化したメラノサイトの製造方法。
- 前記紫外線は、紫外線Bである、請求項1に記載の老化したメラノサイトの製造方法。
- 前記紫外線の強さは、15〜25mJ/cm2である、請求項1に記載の老化したメラノサイトの製造方法。
- 前記紫外線の照射は、18〜30時間置きに実施する、請求項1に記載の老化したメラノサイトの製造方法。
- 前記紫外線の照射は、2回実施する、請求項1に記載の老化したメラノサイトの製造方法。
- 請求項1〜7の何れか一項に記載の方法によって製造された、分離された、老化したメラノサイト。
- 請求項1に記載の細胞に、皮膚老化改善用又は皮膚美白用候補物質を処理する段階;及び前記候補物質の処理前後の老化指標又は美白指標を検出する段階を含む、皮膚老化改善用又は皮膚美白用物質のスクリーニング方法。
- 前記候補物質の処理後における老化指標又は美白指標の発現量が、候補物質を処理していない対照群に比べて減少又は増加すると、皮膚老化改善用又は皮膚美白用物質と決める段階をさらに含む、請求項9に記載のスクリーニング方法。
- 前記老化指標及び美白指標の発現量がいずれも減少又は増加すると、皮膚老化改善と皮膚美白の効果とを併せ持つ物質と決める、請求項10に記載のスクリーニング方法。
- 前記老化指標は、β-ガラクトシダーゼ(β-galactosidase)、p16、p21、及びp53からなる群から選択された一つ以上である、請求項9に記載のスクリーニング方法。
- 前記美白指標はメラニンである、請求項9に記載のスクリーニング方法。
- 請求項8に記載の細胞;及び
指示書を含み、
前記指示書には、候補物質の処理前後の老化指標又は美白指標を測定して、発現量が、候補物質の処理後において候補物質を処理していない対照群に比べて減少又は増加した場合、皮膚老化改善用又は皮膚美白用物質と判断する内容を含む、皮膚老化改善用又は皮膚
美白用物質のスクリーン用キット。 - 前記細胞は、冷凍保存又は担体保存した状態のものである、請求項14に記載のキット。
- 前記老化指標は、β-ガラクトシダーゼ(β-galactosidase)、p16、p21、及びp53からなる群から選択された一つ以上である、請求項14に記載のキット。
- 前記美白指標は、メラニンである、請求項14に記載のキット。
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