CN103421763A - 一种细胞光老化模型的体外构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学和细胞生物学领域，涉及一种细胞光老化模型的体外构建方法，包括如下步骤：（1）获取新生小鼠皮肤成纤维原代细胞，并在体外使用DMEM+10%FBS培养；（2）待小鼠皮肤成纤维细胞生长至80%时传代，允许细胞贴壁生长24小时；然后进行首次中波紫外线照射，随后每隔12小时，重复照射4次；最末次照射24-72h后得到小鼠皮肤成纤维细胞光老化模型。本发明应用小鼠来源细胞，一次取材即可获得大量原代细胞；避免了细胞系的反复冻存和活力不足的缺点；另外，体外培养时细胞活力好，在限定代次内不会对UVB诱导的衰老表型产生干扰；且造模所需时间短，仅需2天；效果稳定，末次照射后24小时即可观察到衰老表型。
Description
技术领域
本发明属于医学和细胞生物学领域，涉及一种细胞光老化模型的体外构建方法。
背景技术
皮肤的老化可分为两种类型，即自然老化和光老化。前者是指随年龄增大，由机体内在基因控制的衰老过程，只与时间相关，任何生物体均无法避免，表现为细小皱纹、均匀色素沉着、弹性缺失、皮肤松弛和下垂。而光老化则主要是外源性促衰老因素引起，包括吸烟、酗酒、环境污染、紫外线暴露等。皮肤长期暴露于这些环境因素后，可加速老化，并且表现出与内源性老化不同的特征，包括粗大皱纹、异常色素沉着，弹性明显缺失，皮肤质地粗糙。这些改变的根源在于真皮细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）的变化。
ECM主要由I型胶原纤维（80%）、弹性蛋白（4%）组成，前者作为最主要的填充物，为皮肤提供饱满的外观和适当的伸展性；后者则可保持皮肤的弹性。经过外源性促老化的因素作用后，I型胶原纤维多降解成不定形碎片，含量减少。而弹性蛋白则趋向于变性沉积，在光老化皮肤中可观察到大量变性弹性蛋白组织沉积于真皮内，因为缺乏有序结构，皮肤弹性缺失，大体上表现为皮肤下垂和粗糙质地。成纤维细胞（Fibroblast,FB）作为真皮中的主体细胞成分，司分泌ECM和调节局部微环境等功能，其不仅合成胶原纤维、弹性纤维等基质成分，还分泌细胞因子和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs），参与ECM重塑。因此，在衰老进程中FB的作用越来越受到重视。在生理情况下，成纤维细胞内嵌于ECM网架结构中，与角朊细胞、内皮细胞、巨噬细胞形成多细胞复合体，通过分泌基质成分和MMPs，对细胞因子作出反应，使ECM处于动态平衡之中。随着年龄增长，此平衡被打断。衰老的成纤维细胞出现形态和代谢上的变化，其特征是对细胞因子反应减弱，细胞内应激水平增高，分泌基质成分能力下降，同时产生更多MMPs至ECM中，参与ECM的降解。
在外源性促老化的因素中，紫外线暴露占80%。日光中的紫外线可分为3种，即长波（UVA）、中波（UVB）、短波（UVC）紫外线。UVA波长400～320nm，其生物学作用较弱，有明显的色素沉着作用。UVB波长320～275nm，是紫外线生物学效应最活跃部分，红斑反应的作用很强，可穿透表皮，到达真皮层，引起真皮成纤维细胞衰老。UVC波长275～180nm，红斑反应的作用明显，但穿透能力极弱，被臭氧层吸收而无法到达地球表面。体外实验证实，UVB可被色素细胞和光敏剂吸收，进而产生活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS)，损伤DNA，并激活细胞增殖、分化、衰老相关的一系列信号通路。
为了研究UVB引起光老化的机制，此前有许多作者都采用在体外培养FB，并用UVB照射的方法，来模拟日常生活中的紫外线暴露。Straface等人通过在体外培养人WI-38成纤维细胞系，并采用单次UVB暴露法，诱导光老化模型。然而依据此前的报道，单次照射剂量难以控制，且极大程度依赖于细胞状态。剂量过高时，细胞则启动凋亡程序，不呈现衰老状态；剂量过低时，细胞可通过自身的修复机制，从而恢复至正常状态。在我们的探索中，也出现了类似问题，难以通过单次照射获得稳定的衰老表型。同时，光老化的原因在于长期的紫外线暴露，这与单次照射获得的效果不同。单次照射更趋向于急性损伤，正如临床上所观察到的皮肤红斑效应一样，并不会导致光老化。所谓光老化，其要点在于累积效应，即长期、反复暴露于UVB。基于此观念，此前Debacq-Chainlaux等利用人AG04431成纤维细胞系反复暴露于UVB，成功诱导了诸多衰老表型。此法较难推广的原因在于，一是细胞系在长期运输中细胞活力容易产生波动，反复冻存和复苏也会改变细胞活力状态；二是此类细胞系均属有限细胞系，在反复传代中，容易出现端粒缩短，自身将随着传代出现衰老表型，从而干扰了紫外线诱导的衰老表型的鉴定。
发明内容
本发明的目的在于为克服上述现有技术的缺陷而提供一种细胞光老化模型的体外构建方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种细胞光老化模型的体外构建方法，包括如下步骤：
（1）获取新生小鼠皮肤成纤维原代细胞，并在体外使用DMEM+10%胎牛血清（FBS）培养；
（2）待小鼠皮肤成纤维细胞生长至80%时传代，允许细胞贴壁生长24小时；然后进行首次中波紫外照射，随后每隔12小时，重复照射4次；最末次照射24-72h后得到小鼠皮肤成纤维细胞光老化模型。
其中，所述的步骤（1）中，小鼠皮肤成纤维细胞取自新生小鼠背部皮肤，小鼠品系为C57BL/6，出生18-24小时。
所述的步骤（2）中，小鼠皮肤成纤维细胞传代次数为1-3代，照射前无明显衰老表型。
所述的步骤（2）中，所述的步骤（2）中，第1-3次照射完毕后改用含1%FBS的培养液继续培养；末次照射（第4次照射）后的小鼠成纤维细胞用含DMEM+10%FBS的培养皿培养。
所述的步骤（2）中，照射方法为将细胞培养液吸去，覆盖以薄层无色缓冲液，置于UVB灯管30cm下方，其中UVB灯管发射中波波长紫外线，发射峰值为311nm。
所述的步骤（2）中，照射剂量为60～120mJ/cm2，优选90-120mJ/cm2；照射剂量不能超过150mJ/cm2,否则将会造成细胞死亡。
所述的步骤（2）中，小鼠皮肤成纤维细胞融合度大于等于50%时开始照射。
“原代细胞”，相对应于细胞系，是指从动物体内新鲜获取并在体外培养的细胞（此前文献报道采用的是人的成纤维细胞系。
应用本发明确定的方法，可以成功构建细胞光老化模型，细胞来源广泛，活力良好，构建方法具有稳定和高效的特点，此外，该模型尤其适用于研究光老化的机制和测试光老化药物有效性的工具。
因此，应用MDFs构建的细胞光老化模型可大大促进光老化的机制探索和临床药物有效性的前期验证。
在实验工作中，本申请发明人发现MDFs获取容易，可从少量皮肤获取大量原代细胞，1cm×1cm即可获得5×106个细胞，其活力好，扩增能力强，在代数较少的情况下，活力无明显改变。更重要的是通过此法获取细胞最短仅需7小时，大大减少了反复冻存和原代培养所需的时间。在接受UVB不同剂量照射后，细胞出现剂量依赖性的变化，确定亚细胞毒剂量后，发明人选定120mJ/cm2作为造模剂量，发现细胞经作用后出现早期ROS升高，呈现开口向下的抛物线式变化，峰值在照射后30分钟出现，同时反复的UVB暴露可导致细胞线粒体膜电位改变，提示细胞线粒体受损，无法提供细胞所需的能量。随后，发明人对UVB照射4次后细胞周期的变化进行检测，发现此法未引起细胞凋亡，而是细胞周期阻滞，符合衰老特征。本发明人进而按照光老化皮肤的特征变化，检测此模型，发现光老化细胞分泌ECM的功能下降，表现在I型胶原和弹性蛋白原下降，而降解ECM的MMP-1表达增多，符合光老化特征。在此基础上，发明人进行了更加严谨的大规模验证，完成了本发明。
术语
术语“MDFs的分离”是指从新生小鼠背部皮肤将成纤维细胞消化并分离的过程。
术语“UVB照射”是指用发射中波紫外线的灯管对无遮盖的细胞进行照射的过程。
术语“ROS”是指活性氧类，是正常氧代谢的副产物，UVB作用后导致的ROS过剩会对细胞和基因结构造成损坏。
术语“线粒体膜电位”是指正常线粒体膜通透性正常，维持内外一定的电势差，当通透性受到破坏时，其膜电位下降，是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一。
术语“细胞周期阻滞”是指细胞在某种因素作用下，停滞于细胞周期的某一阶段，如G1期、S期等，无法进入正常的细胞周期循环。
MDFs
本发明中的MDFs指新生小鼠背部皮肤消化所得的成纤维细胞。
分离获得MDFs的方法是文献多次报道的公认方法。一种优选的方法是取出生18-24小时的C57BL/6近交系小鼠，乙醚处死后，取背部皮肤约1cm×1cm，氯霉素冲洗后立即置入2%中性蛋白酶中，于37℃恒温4小时或4℃过夜。将皮肤取出，分离表皮和真皮，将真皮剪碎后移至1%胶原酶中，37℃恒温摇床消化2小时，1500rpm离心并弃上清，沉淀加入适量培养液（DMEM）和10%FBS，吹打均匀后以约2×105/cm2的密度接种于培养皿，于37℃、5%CO2、100%饱和湿度的条件下培养。48小时后细胞生长即接近融合，以PBS冲洗3次，以0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化，以1×104/cm2的密度接种进行细胞传代。在传代时可使用40μm滤网滤去杂质。优选第1-3代用于建立模型。
UVB
本发明中的UVB指可发射中波紫外线（280-320nm）的紫外灯管，包括但不限于：
Philips TL20w/01RS lamp
Philips TL20w/12RS lamp
Philips TL40w/12RS lamp
Philips TL100w/01lamp
Philips TL100w/10RS lamp
Philips TL100w/12lamp
若使用同时可发射其他波长的紫外灯管，应使用滤波片去除长波和短波紫外线的干扰。
照射方法
本发明的模型建立方法简便，诱导时间仅需2天。
细胞传代后生长至融合度约为50%时，即可覆以薄层PBS溶液，加强透光性，并移去培养皿盖子，置于UVB灯管正下方30cm处，照射剂量控制在120mJ/cm2。照射完毕后，更换至DMEM+1%FBS，控制细胞生长速度。
每间隔12小时照射1次，共需4次。末次照射后使用DMEM+10%FBS继续培养24小时，即可观察到衰老表型。
本发明基于小鼠皮肤成纤维细胞（Mouse dermal fibroblasts,MDFs）可在体外反复暴露于UVB而产生一系列衰老表型。
本发明的主要优点在于：
（1）应用小鼠来源细胞，一次取材即可获得大量原代细胞；
（2）避免了细胞系的反复冻存和活力不足的缺点；
（3）体外培养时细胞活力好，在限定代次内不会对UVB诱导的衰老表型产生干扰；
（4）造模所需时间短，仅需2天；
（5）效果稳定，末次照射后24-72小时即可观察到衰老表型。
附图说明
图1A为本发明实施例中UVB不同剂量照射24小时后在40倍和100倍镜下的细胞形态和密度；
图1B为本发明实施例中UVB不同剂量照射24小时后CCK-8检测发现细胞活性与UVB剂量的关系示意图。
图2A为本发明实施例中UVB单次照射120mJ/cm2对细胞活性氧产生的影响；
图2B为本发明实施例中UVB剂量120mJ/cm2照射4次后对线粒体膜电位变化的影响；
图3A为本发明实施例中UVB剂量120mJ/cm2照射4次后对细胞各周期阻滞的影响；
图3B为本发明实施例中UVB剂量120mJ/cm2照射4次后对细胞合成DNA功能的影响的定性描述；
图3C为本发明实施例中UVB剂量120mJ/cm2照射4次后对细胞合成DNA功能的影响的定量描述；
图4A为本发明实施例中UVB剂量120mJ/cm2照射4次后，ECM相关蛋白mRNA表达的定量研究；
图4B为本发明实施例中UVB剂量120mJ/cm2照射4次后，ECM相关蛋白的蛋白质印迹结果；
图4C为本发明实施例中UVB剂量120mJ/cm2照射4次后，免疫荧光显示弹性蛋白原的表达情况；
图4D为本发明实施例中UVB剂量120mJ/cm2照射4次后，ELISA检测细胞内MMP-1的表达变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Debacq-Chainlaux等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
MDFs的分离和培养
细胞取自新生18-24小时的C57BL/6近交系小鼠，应选择肤色红润、蠕动正常的小鼠。
（1）分离背部皮肤：乙醚麻醉处死后，将小鼠浸泡于75%乙醇中约10分钟，将用DMEM洗去残留乙醇，置于培养皿中，剪刀分离背部皮肤，剪下皮肤组织块约1cm×1cm，立即置于2%中性蛋白酶中，37℃恒温消化4小时；
（2）皮肤的消化：将皮肤取出，镊子分离表皮和真皮，将真皮剪碎后，置于0.1%胶原酶中，37℃恒温摇床消化2小时，至组织块基本消失。1500rpm离心5分钟收集沉淀；
（3）接种：弃上清，细胞以含有10%FBS，L-谷氨酰胺300ug/ml，青、链霉素各100U/ml的DMEM(Gibco,Gland Island,NY,USA)培养液制成细胞悬液，吹打均匀后以约2×105/cm2的密度接种于培养皿，于37℃、5%CO2、100%饱和湿度的条件下培养）；
（4）传代：48小时后P0细胞生长即接近80%融合，以PBS冲洗3次，以0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化，以1×104/cm2的密度接种进行细胞传代，此时为P1代，允许在DMEM+10%FBS中贴壁生长24小时后，可开始第一次照射。在传代时可使用40μm滤网滤去杂质。优选第1-3代用于建立模型。
倒置显微镜下观察，MDFs呈短梭形或多角形，原代细胞多呈克隆样生长，传代后可形成单层，细胞接近会合时排列呈旋涡形。
实施例2
UVB照射
（1）UVB灯管的准备：UVB灯管使用75%乙醇擦拭，并预先置于超净台中消毒30分钟。
（2）UVB照射剂量的测定：灯管两侧垫以离心管架，使之距离超净台平面30cm，用Lutron UV light meter(Lutron,Taiwan)测定UVB剂量（仪器显示单位为mJ/cm2·s），根据测得数据计算所需的照射时间（照射时间=120/UVB测定剂量（计算数值单位为秒））；
（3）UVB照射：实施例1制备的传代1-3代的小鼠皮肤成纤维细胞的融合度细胞融合度（其中，图为P2代）为50%时，移去培养液，覆盖薄层PBS，打开盖子，置于UVB灯管正下方，进行首次照射，照射剂量为120mJ/cm2。照射完毕后，吸去PBS，加入10ml DMEM+1%FBS继续培养，即每隔12小时照射一次，共4次，每次照射完毕后改用含1%FBS的培养液继续培养；末次照射完成后改成DMEM+10%FBS培养。
（4）衰老表型检测：末次照射后24-72小时可检测衰老表型。
(a)UVB对细胞的毒性作用呈剂量依赖性
不同剂量照射MDFs后，其增殖速度随着照射剂量的增加而减缓，在120mJ/cm2时细胞活力与对照组有显著性差异。剂量达150mJ/cm2或以上时，可观察到凋亡细胞数量增多，细胞密度明显减低（图1A和图1B）。由此，我们选定了120mJ/cm2作为诱导模型的剂量。
(b)生化指标的检测
ROS和线粒体膜电位：如图2A所示，细胞在接受UVB照射后15分钟即可观察到ROS的产生，在30分钟时达到峰值，随后逐渐消失，在1小时以后无法检测到。线粒体膜电位的改变最早出现在末次照射12小时后（图2B），与对照组相比有明显下降，提示线粒体功能受损，无法提供细胞所需的能量。在随后24小时和48小时检测，线粒体膜电位与12小时相比，仍有轻度下降，提示该变化较为稳定，不会因细胞自我修复而消失。
细胞周期：如图3A所示，流式细胞仪检测发现细胞照射后处于分裂期（G2/M期）显著减少，而DNA合成期（S期）显著增多，提示可能存在细胞周期阻滞。进一步的EdU实验证实细胞出现了S期阻滞，即合成DNA减少，无法进入下一周期（图3B和图3C）。
ECM的分泌和降解：如图4A所示，实时定量PCR证实此模型I型胶原、弹性蛋白原的mRNA表达量均显著降低，而降解ECM的MMP-1则出现了2倍的增加。Western blot（图4B）、ELISA（图4D）和免疫荧光（图4C，箭头所示可见细胞形态铺展，荧光强度弱）进一步从蛋白水平证实了PCR的结果，二者相互验证。
通过上述实例可以证实，经UVB剂量120mJ/cm2反复照射4次后，细胞可出现稳定的衰老表型，包括ROS增多、线粒体膜电位下降、细胞周期阻滞、分泌功能下降等，符合光老化时成纤维细胞相应改变。以上结果说明，通过反复的亚细胞毒剂量UVB照射，可有效避免单次照射的缺点，如剂量过高导致的细胞死亡，或剂量过低，细胞可自身修复而恢复至正常状态。同时，采用MDFs也可避免有限细胞系在运输和冻存中出现的细胞活力下降和难以购买的问题，MDFs易于获取，体外扩增方便，仅需7小时即可获得原代细胞。经过本方法诱导的模型，可稳定表达一系列衰老表型，诱导时间短，仅需2天，可大大加快实验进程。
本发明为应用细胞光老化模型提供了一个确实可行的技术体系。使用这种技术提供的简便方法。可以有效地在体外构建细胞光老化模型。本发明人认为ROS的产生是一系列衰老表型的基础，由于ROS的不断产生，从而导致氧化和抗氧化系统的失衡，进一步引起细胞器和DNA损失，因而在反复照射后，出现了线粒体膜电位下降，细胞周期阻滞等变化，也证实了此观点。本发明提供的模型还可用来研究UVB引起光老化的机制，例如UVB通过何种方式产生ROS，何种信号通路引起最终的衰老表型；也可用于测试抗光老化药物的有效性。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种细胞光老化模型的体外构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）获取新生小鼠皮肤成纤维原代细胞，并在体外使用DMEM+10%胎牛血清培养；
（2）待小鼠皮肤成纤维细胞生长至80%时传代，允许细胞贴壁生长24小时；然后进行首次中波紫外线照射，随后每隔12小时，重复照射4次；最末次照射24-72h后得到小鼠皮肤成纤维细胞光老化模型。
2.根据权利要求1所述的体外构建方法，其特征在于：所述的步骤（1）中，小鼠皮肤成纤维细胞取自新生小鼠背部皮肤，小鼠品系为C57BL/6，出生18-24小时。
3.根据权利要求1所述的体外构建方法，其特征在于：所述的步骤（2）中，小鼠皮肤成纤维细胞传代次数为1-3代，照射前无明显衰老表型。
4.根据权利要求1所述的体外构建方法，其特征在于：所述的步骤（2）中，第1-3次照射完毕后改用含1%FBS的培养液继续培养；末次照射后的小鼠成纤维细胞用含DMEM+10%FBS的培养皿培养。
5.根据权利要求1所述的体外构建方法，其特征在于：所述的步骤（2）中，照射方法为将细胞培养液吸去，覆盖以薄层无色缓冲液，置于UVB灯管30cm下方，其中UVB灯管发射中波波长紫外线，发射峰值为311nm。
6.根据权利要求1所述的体外构建方法，其特征在于：所述的步骤（2）中，照射剂量为60～120mJ/cm2。
7.根据权利要求1所述的体外构建方法，其特征在于：所述的步骤（2）中，小鼠皮肤成纤维细胞融合度大于等于50%时开始照射。
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