CN103393585B

CN103393585B - 一种用于美容保养的成纤维细胞液及其制备方法

Info

Publication number: CN103393585B
Application number: CN201310345593.0A
Authority: CN
Inventors: 丁彬彬
Original assignee: Aipuruisi (beijing) Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Aipuruisi (beijing) Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2013-08-09
Filing date: 2013-08-09
Publication date: 2015-02-04
Anticipated expiration: 2033-08-09
Also published as: CN103393585A

Abstract

本发明公开了一种用于美容保养的成纤维细胞液及其制备方法，该成纤维细胞液含有细胞培养液、胶原蛋白、细胞生长因子、氨基酸和维生素，其中细胞生长因子包括成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子和角质细胞生长因子；制备成纤维细胞液的方法包括获取脐带组织真皮细胞、原代培养脐带真皮组织细胞、传代培养脐带组织真皮细胞、收集细胞培养液、加入甘油和细胞因子制得成纤维细胞液等步骤。该成纤维细胞液具有促进表皮细胞新陈代谢，增强皮肤弹性，修复受伤表皮细胞，去除色斑等功效；该制备方法简便易操作，适于大规模生长制备干细胞液。

Description

一种用于美容保养的成纤维细胞液及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物化妆品及其制备方法，具体涉及一种用于美容保养的成纤维细胞液及其制备方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高，人们对于美容保养越来越重视，市场上的美容保养品种类繁多。但是现有的精细化工护肤品大都含有铅、汞、酒精、防腐剂、激素、香料等对肌肤有损害的物质，在使用美容保养品的同时，也对皮肤造成了较大的伤害，甚至会产生的色斑、红血丝、过敏等问题，对人们的生活质量和身体健康造成了极大的威胁。

现有的美容保养品，大都通过化工方法制得，其产品中的有害物质残留较多，长期使用会对皮肤产生不利影响。而且现有产品大都不具有生物活性物质，不能够有效促进表皮细胞的新陈代谢，改善皮肤的光泽。而且，化工护肤品中含有的部分物质会对人体产生过敏反应，不适合全体人群使用。

成纤维细胞培养液，是最近几年新发展起来的生物技术领域，利用细胞培养液中的生物成分，能够起到较好的护肤效果，而且其生产方法脱离了化工生产工艺，具有较好的安全性和更好的生物活性，具有较好的推广和应用前景。

发明内容

本发明需要解决的技术问题就在于克服现有技术的缺陷，提供一种用于美容保养的成纤维细胞液及其制备方法，该成纤维细胞液具有促进表皮细胞新陈代谢，增强皮肤弹性，修复受伤表皮细胞，去除色斑等功效。

为解决上述问题，本发明采用技术方案为：

一种用于美容保养的成纤维细胞液及其制备方法，其特征在于，该成纤维细胞液含有细胞培养液、胶原蛋白、细胞生长因子、氨基酸和维生素；制备成纤维细胞液的方法采用成纤维细胞培养基培养脐带组织真皮细胞得到细胞培养液，再向细胞培养液的上清液中加入医用甘油和细胞因子制得成纤维细胞液。

本发明为了能够制具有美容保养功能的备成纤维细胞液，较佳的技术方案有，制备用于美容保养的成纤维细胞液的方法，该方法的步骤包括获取脐带组织真皮细胞、原代培养脐带组织真皮细胞、传代培养脐带组织真皮细胞、收集细胞培养液、加入甘油和细胞因子制得成纤维细胞液；用成纤维细胞培养基培养脐带组织真皮细胞获得细胞培养液，其中含有多种生物活性物质，能够起到较好的美容效果；在细胞液中加入甘油和细胞因子，细胞因子能够促进皮肤细胞的新陈代谢，提高细胞活力，能够提高干细胞液的美容功效。

本发明为了实现对于成纤维细胞液的生产制备，较佳的技术方案还有，制备用于美容保养的成纤维细胞液的方法，该方法的操作步骤为：

①获取脐带组织细胞：用含有青链霉素的磷酸盐缓冲液冲洗脐带组织3次，将脐带组织剪成小块后真皮面朝下平铺于平皿中，向平皿中加入中性蛋白酶Ⅱ过夜培养；过夜后分离表皮与真皮，将真皮剪成小块接种于含有成纤维细胞培养基的培养皿中得到脐带组织细胞；脐带组织的真皮细胞为成纤维细胞，分离出真皮细胞后能够进行后续培养以获得细胞培养液；

②原代培养脐带组织细胞：将得到的脐带组织真皮细胞进行原代培养，每三天更换一次成纤维细胞培养液；培养获得的脐带组织真皮细胞，使其正常生长后，进行传代培养以获得更多的成纤维细胞来制取细胞培养液；

③传代培养脐带组织真皮细胞：用酶解液消化原代培养的脐带组织真皮细胞，酶解完成后加入成纤维细胞培养基终止酶解，再用吸管吹打细胞，然后按照1:3的比例进行传代培养；为了获得较多的细胞培养液，将脐带组织真皮细胞进行传代培养；

④收集细胞培养液：将传代至4~6代的培养皿中的细胞上清液收集起来得到细胞培养液；细胞生长至4~6代时生长旺盛，产生较多的对皮肤有利的生物活性物质，传代次数过多会产生较多的对生物组织有害的细胞代谢产物，故选择传代至4~6代的细胞提取细胞培养液为好；

⑤加入甘油和细胞因子制得成纤维细胞液：向细胞培养液中加入医用甘油和细胞因子制得成纤维细胞液；为了制得能够使用的美容化妆品细胞液，向所得的干细胞液中在添加甘油及细胞因子，使得干细胞液具有更好的美容保养功能，其中的生物因子包括多种细胞生长因子、维生素和氨基酸等皮肤所需的物质，促进皮肤细胞的新陈代谢，使肌肤更加美白和富有弹性。

本发明为了高效获取脐带组织真皮细胞，较佳的技术方案还有，第一步中将真皮剪成0.5~1mm³的小块，以便于真皮细胞快速生长，避免内部细胞死亡；第一步中过夜培养的条件为4℃过夜培养。

本发明为了保证原代培养真皮细胞操作中使其快速大量生长，较佳的技术方案还有，第二步中原代培养脐带组织真皮细胞的条件为，向培养皿中加入0.5ml成纤维细胞培养基于37℃恒温培养，培养箱中二氧化碳气体的体积分数为5%。

本发明为了充分酶解细胞以完成传代培养，较佳的技术方案还有，第三步传代培养脐带组织真皮细胞的操作中，酶解液为含有质量分数为0.25%的胰酶和质量分数为0.02%的乙二胺四乙酸的酶解液，酶解时间为1分钟；胰酶能够消化细胞之间的连接使其分散开，使细胞均匀飘散在酶解液中。

本发明为了提高干细胞液的护肤效果，促进皮肤表皮细胞的新陈代谢，较佳的技术方案还有，第五步加入甘油和细胞因子制得成纤维细胞液步骤中，每500ml细胞培养液中加入300g医用甘油，向细胞培养液中加入的细胞因子包括：成纤维细胞生长因子0.25~0.45 mg/L、表皮细胞生长因子2.5~4 mg/L、I型胶原蛋白0.5~3 mg/L、肝细胞生长因子0.5~3 mg/L、角质细胞生长因子3~6 mg/L、γ-氨基丁酸2~8.5 mg/L、维生素b12为0.3~1 mg/L。

本发明为了提高干细胞液的美容护肤效果，使皮肤表皮细胞加快代谢和去除色斑，较佳的技术方案还有，该方法制得的成纤维细胞液中细胞因子的含量为：成纤维细胞生长因子0.32 mg/L、表皮细胞生长因子3.35 mg/L、I型胶原蛋白1.71 mg/L、肝细胞生长因子1.71 mg/L、角质细胞生长因子4.31 mg/L、γ-氨基丁酸4.45 mg/L、维生素b12为0.68 mg/L。

本发明为了在脐带组织真皮细胞培养过程中获得较多的生物活性物质，较佳的技术方案还有，第三步中传代培养脐带组织真皮细胞的时间为15～25天，即可以获得较多的生物活性物质，又可以避免培养时间过长导致产生较多的有害代谢产物，提高了干细胞液的美容保养效果。

本发明为了在培养脐带组织真皮细胞过程中获得较好的培养效果，较佳的技术方案还有，成纤维细胞培养基采用美国coming cellgro公司的成纤维细胞培养基，该培养基缓冲体系为4-羟乙基哌嗪乙磺酸和重碳酸盐，成纤维细胞培养基包含：500 ml基础培养基，10ml胎牛血清，5ml成纤维细胞生长添加物和5 ml青霉素与链霉素溶液。

本发明的优点和有益效果为：

①本发明采用生物技术培养脐带组织表皮细胞的方法制得干细胞液，产品中均为生物活性物质，不含有化工制造化妆品中含有的重金属等有毒有害物质，确保了产品的使用安全性，不会产生过敏反应；

②本发明干细胞液中添加多种生物因子，成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、角质细胞生长因子能剌激外胚层和内胚层起源的各种细胞增殖迁移，加快皮肤细胞的新陈代谢，增加皮肤含水量，进而增加皮肤弹性，滋润肌肤，消除皱纹和预防色斑，具有很好的美容功效；

③本发明干细胞液中还添加γ-氨基丁酸、维生素b12、I型胶原蛋白，能够滋润皮肤，使表皮细胞能够快速健康生长，补充其生长所需的维生素等物质；

④本发明干细胞液的生产方法，操作简便，生产技术要求不高，适用于大规模生产干细胞液，能够在生物技术生产车间大规模长时间开展生产过程，制造成本较低，且产品功效很好，具有很高的实用价值。

具体实施方式

下列实施例将进一步说明本发明。

实施例1

本发明采用技术方案为：一种用于美容保养的成纤维细胞液及其制备方法，该成纤维细胞液含有细胞培养液、胶原蛋白、细胞生长因子、氨基酸和维生素；制备成纤维细胞液的方法，该方法的步骤包括获取脐带组织真皮细胞、原代培养脐带组织真皮细胞、传代培养脐带组织真皮细胞、收集细胞培养液、加入甘油和细胞因子制得成纤维细胞液。

实施例2

在实施例1的基础上，本发明为了实现对于成纤维细胞液的生产制备，较佳的实施方式还有，制备用于美容保养的成纤维细胞液的方法的操作步骤为：

①获取脐带组织细胞：用含有青链霉素的磷酸盐缓冲液冲洗脐带组织3次，将脐带组织剪成小块后真皮面朝下平铺于平皿中，向平皿中加入中性蛋白酶Ⅱ过夜培养；过夜后分离表皮与真皮，将真皮剪成小块接种于含有成纤维细胞培养基的培养皿中得到脐带组织细胞；

③传代培养脐带组织真皮细胞：用酶解液消化原代培养的脐带组织真皮细胞，酶解完成后加入成纤维细胞培养基终止酶解，再用吸管吹打细胞，然后按照1:3的比例进行传代培养；

④收集细胞培养液：将传代至5代的培养皿中的细胞上清液收集起来得到细胞培养液；细胞生长至5代时生长旺盛，产生较多的对皮肤有利的生物活性物质；

⑤加入甘油和细胞因子制得成纤维细胞液：向细胞培养液中加入医用甘油和细胞因子制得成纤维细胞液；

其他部分与实施例1完全相同。

实施例3

在实施例2的基础上，本发明为了高效获取脐带组织真皮细胞，较佳的实施方式还有，第一步中将真皮剪成1mm³的小块，以便于真皮细胞快速生长，避免内部细胞死亡；第一步中过夜培养的条件为4℃过夜培养；为了保证原代培养真皮细胞操作中使其快速大量生长，第二步中原代培养脐带组织真皮细胞的条件为，向培养皿中加入0.5ml成纤维细胞培养基于37℃恒温培养，培养箱中二氧化碳气体的体积分数为5%，其他部分与实施例2完全相同。

实施例4

在实施例3的基础上，本发明为了充分酶解细胞以完成传代培养，较佳的实施方式还有，第三步传代培养脐带组织真皮细胞的操作中，酶解液为含有质量分数为0.25%的胰酶和质量分数为0.02%的乙二胺四乙酸的酶解液，酶解时间为1分钟；胰酶能够消化细胞之间的连接使其分散开，使细胞均匀飘散在酶解液中，其他部分与实施例3完全相同。

实施例5

在实施例4的基础上，本发明为了提高干细胞液的护肤效果，促进皮肤表皮细胞的新陈代谢，较佳的实施方式还有，第五步加入甘油和细胞因子制得成纤维细胞液步骤中，每500ml细胞培养液中加入300g医用甘油，向细胞培养液中加入的细胞因子包括：成纤维细胞生长因子0.45 mg/L、表皮细胞生长因子2.8 mg/L、I型胶原蛋白2.4 mg/L、肝细胞生长因子1.3 mg/L、角质细胞生长因子5.8 mg/L、γ-氨基丁酸6.4 mg/L、维生素b12为0.9 mg/L，其他部分与实施例4完全相同。

实施例6

在实施例5的基础上，本发明为了提高干细胞液的美容护肤效果，使皮肤表皮细胞加快代谢和去除色斑，较佳的实施方式还有，成纤维细胞液中细胞因子的含量为：成纤维细胞生长因子0.32 mg/L、表皮细胞生长因子3.35 mg/L、I型胶原蛋白1.71 mg/L、肝细胞生长因子1.71 mg/L、角质细胞生长因子4.31 mg/L、γ-氨基丁酸4.45 mg/L、维生素b12为0.68 mg/L，其他部分与实施例5完全相同。

实施例7

在实施例6的基础上，本发明为了在脐带组织真皮细胞培养过程中获得较多的生物活性物质，较佳的实施方式还有，第三步中传代培养脐带组织真皮细胞的时间为20天；为了在培养脐带组织真皮细胞过程中获得较好的培养效果，成纤维细胞培养基采用美国coming cellgro公司的成纤维细胞培养基，该培养基缓冲体系为4-羟乙基哌嗪乙磺酸和重碳酸盐，成纤维细胞培养基包含：500 ml基础培养基，10ml胎牛血清，5 ml青霉素与链霉素溶液，其他部分与实施例6完全相同。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims

1.一种用于美容保养的成纤维细胞液的制备方法，其特征在于，该成纤维细胞液含有细胞培养液、胶原蛋白、细胞生长因子、氨基酸和维生素；制备成纤维细胞液的方法采用成纤维细胞培养基培养脐带组织真皮细胞得到细胞培养液，再向细胞培养液的上清液中加入医用甘油和细胞因子制得成纤维细胞液；

该方法的步骤包括获取脐带组织真皮细胞、原代培养脐带组织真皮细胞、传代培养脐带组织真皮细胞、收集细胞培养液的上清液、加入甘油和细胞因子制得成纤维细胞液；

该方法的步骤为：

①获取脐带组织真皮细胞：用含有青链霉素的磷酸盐缓冲液冲洗脐带组织3次，将脐带组织剪成小块后真皮面朝下平铺于平皿中，向平皿中加入中性蛋白酶Ⅱ过夜培养；过夜后分离表皮与真皮，将真皮剪成小块接种于含有成纤维细胞培养基的培养皿中得到脐带组织真皮细胞；

该步骤中将真皮剪成0.5~1mm³的小块；过夜培养的条件为4℃过夜培养；

②原代培养脐带组织真皮细胞：将得到的脐带组织真皮细胞进行原代培养，每三天更换一次成纤维细胞培养液；

该步骤中原代培养脐带组织真皮细胞的条件为，向培养皿中加入0.5ml成纤维细胞培养基于37℃恒温培养，二氧化碳气体的体积分数为5%；

该步骤中传代培养脐带组织真皮细胞的操作中，酶解液为含有质量分数为0.25%的胰酶和质量分数为0.02%的乙二胺四乙酸的酶解液，酶解时间为1分钟；

④收集细胞培养液：将传代至4~6代的培养皿中的细胞上清液收集起来得到细胞培养液；

该步骤加入甘油和细胞因子制得成纤维细胞液步骤中，每500ml细胞培养液中加入300g医用甘油，向细胞培养液中加入的细胞因子包括：成纤维细胞生长因子0.25~0.45 mg/L、表皮细胞生长因子2.5~4 mg/L、I型胶原蛋白0.5~3 mg/L、肝细胞生长因子0.5~3 mg/L、角质细胞生长因子3~6 mg/L、γ-氨基丁酸2~8.5 mg/L、维生素b12为0.3~1 mg/L。

2.如权利要求1所述的成纤维细胞液的制备方法，其特征在于，该方法制得的成纤维细胞液中细胞因子的含量为：成纤维细胞生长因子0.32 mg/L、表皮细胞生长因子3.35 mg/L、I型胶原蛋白1.71 mg/L、肝细胞生长因子1.71 mg/L、角质细胞生长因子4.31 mg/L、γ-氨基丁酸4.45 mg/L、维生素b12为0.68 mg/L。

3.如权利要求2所述的成纤维细胞液的制备方法，其特征在于，第三步中传代培养脐带组织真皮细胞的时间为15～25天。

4.如权利要求3所述的成纤维细胞液的制备方法，其特征在于，成纤维细胞培养基采用美国coming cellgro公司的成纤维细胞培养基，该培养基缓冲体系为4-羟乙基哌嗪乙磺酸和重碳酸盐，成纤维细胞培养基成分为：500 ml基础培养基，10ml胎牛血清，5ml成纤维细胞生长添加物和5 ml青霉素与链霉素溶液。