CN111956670A - 一种间充质干细胞及其活性因子复合物冻干品的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞及其活性因子复合物冻干品的制备方法，包括以下步骤：①使用脐带间充质干细胞培养基对间充质干细胞进行培养；②分别收集细胞和间充质干细胞条件培养液；③检测细胞数量和条件培养液蛋白浓度，同时进行细菌和病毒、内毒素检测；④在条件培养液中加入核苷酸化合物，并进行冷冻干燥；⑤得到间充质干细胞活性因子复合物冻干品，分装保存。本发明首次将人脐带来源的间充质干细胞分泌的活性因子与核苷酸类化合物结合应用于护肤品和表皮修复，能明显地增强细胞活力，达到修复与抗衰老效果。

Description

一种间充质干细胞及其活性因子复合物冻干品的制备方法
技术领域：
本发明涉及一类生物制品，是脐带间充质细胞干细胞及其分泌的生长因子等活性分子冻干品的制备方法，并用于皮肤损伤修复与抗衰老的应用，属于医学美容领域。
背景技术：
随着社会发展和人民生活水平的提高及对自身美的追求，人们尤其是女性对于日常生活护肤美容愈加重视，而目前市场上的化妆品产品鱼龙混杂，良荞不齐，消费者难以鉴别。
很多精细化工护肤品含有铅汞、乙醇、着色剂及矿物油等对人体肌肤有害的物质，消费者每天在使用这些护肤品的同时,不知不觉对自身皮肤造成了一定的损害，严重的还会造成皮炎及感染问题。而且现有市场出售的化妆品,大多是通过植物成分提取或精细化工制作工艺加工而成，其产品中的大分子物质不易被皮肤吸收，造成皮肤的额外负担。另外由于技术瓶颈和产能原因，目前阶段的化妆品产品基本都不具有生物活性，不能从根本上改善表皮细胞的生存环境和新陈代谢，对于外界因素造成的皮肤损害没有修复作用，尤其不适宜皮肤敏感或孕妇使用。
25岁以后，人自身的生理功能开始减退，衰老大于新生，而内在的根本原因，在细胞层面上实际上是干细胞的活性减退，其增殖分化的能力和调节分泌等功能活性下降。除了自然衰老，近年来环境污染、生存条件的恶化，再加上工作生活速度加快，生存压力上升，人体内干细胞的活性进一步下降，导致各种疾病和内外在损伤，最直观的是皮肤的衰老。皮肤衰老主要出现的症状为面部组织老化，细胞数量减少，皮肤变薄，失去弹性，造成皱纹增多、皮肤松软等。通过纯天然、安全有效的方式激活或促进皮肤干细胞的再生，增加胶原等含量，促进成皮肤纤维等细胞的分化，是目前抗衰老的有效途径，是这一领域的研究热点。非人类干细胞培养上清、人干细胞生长因子和羊膜间充质干细胞在抗衰老、延长寿命保健品或化妆品的应用已见报道。
间充质干细胞的来源中，脐带与骨髓、脂肪、羊膜、脐血等来源比较，取材便捷，无伦理争议，间充质干细胞含量丰富并且增殖活性较高，在一定条件下可向成骨、成脂、成软骨向分化，分泌的生长因子具有免疫调节和促进损伤组织修复的功能，比如治疗或改善脱发、糖尿病、心脏肝脏肾脏等组织脏器的炎症或退行性疾病等。
组织修复过程中涉及干细胞和新生细胞的迁移，这些细胞的功能也受外部环境的影响，通过与胞外基质中多种分子进行信息交流，细胞进行分化或迁移等。其中胶原蛋白是一类重要的胞外基质分子，可与细胞膜上的整合素等分子结合，提供细胞粘附和迁移的靶点，同时进行信息传递，生物医学工程研发和临床应用已开发多种类型的胶原基材料。
活性蛋白分子容易分解或变质，其储运一般使用低温或冻干后常温保存，冻干蛋白增加了生产流程和成本，但特别适用于不稳定珍贵蛋白的长期保存，储运更便捷。鉴于其优势，在血液制品等领域也不乏尝试，血小板、红细胞等冻干已见报道，干细胞冻干的报道较少。
NMN烟酰胺单核苷酸(简称NMN)是人体内合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(简称NAD+或辅酶I)的前体，可以间接或直接为皮肤组织和表皮细胞补充NAD+。据报道，NAD+是人体中数百个酶蛋白包括长寿酶蛋白不可或缺的辅酶成分，参与线粒体呼吸作用，调节细胞的新陈代谢，对人体健康发挥着根本性的影响，病对皮肤以及粘膜损伤修复起着重要的作用。但是随着年龄的增长NAD+在人体内的含量逐渐降低，线粒体和细胞核之间的交流受损，NAD+的减少也降低了细胞产生能量的能力。通过加入NMN或NAD+等核苷酸类活性物，能明显地增强细胞活力，从而达到修复与抗衰老效果。但是该类物质水溶液中不稳定，导致活性逐渐减弱，同时干细胞类复合NMN等核苷酸类化合物的应用未见报道。
发明内容：
该发明的目的在于克服现有技术或产品的不足，提供人间充质干细胞条件培养液与NMN复合物冻干品在皮肤损伤修复与抗衰老中的应用。该间充质干细胞条件培养液抗衰老、促损伤修复效果好，能明显减少细纹、提高皮肤光滑度、改善皮肤弹性改善、皮肤泛红、难愈合的溃疡、淡斑美白、脱皮和炎症的状况，减少皮肤过敏的发生。活性因子冻干有利于常温储运，与液体形式比较，延长保存期限。其制备方法简单，可以进行大规模推广形成产业化生产加工。
本发明是通过以下技术方案实现的：
①使用脐带间充质干细胞培养基对间充质干细胞进行培养；
②分别收集细胞和间充质干细胞条件培养液；
或培养瓶预铺生物材料，使细胞粘附生长于生物材料表面，然后分别收集含有细胞的生物材料和间充质干细胞条件培养液；
③检测细胞数量和条件培养液蛋白浓度，同时进行细菌和病毒、内毒素检测；
④在条件培养液中加入核苷酸化合物，并进行冷冻干燥；
⑤得到间充质干细胞生活性因子复合物冻干品，分装保存。
所述的脐带间充质干细胞培养基即通过商业渠道可获得的适合脐带组织来源的间充质干细胞培养的培养基即可，如：美国StemRD公司的名称为StemRDMgro-500MesenGroChemicallyDefinedMediumforMSC的间充质干细胞无血清培养基。该培养基经过优化，支持人类间充质干细胞的扩增，而且成分明确，无任何动物源性成分，无异种蛋白。
所述的间充质干细胞来源于脐带华通胶，可通过下述方式获得：使用含有链霉素青霉素的PBS或生理盐水冲洗新鲜的脐带组织；剥离羊膜和血管，分离获得华通胶；将华通胶组织剪成小块铺于培养皿中，加入间充质干细胞培养基进行培养；观察组织块周围爬出的细胞。
所述对间充质干细胞进行培养，包括原代培养和传代培养，以获得更多的细胞条件培养液。所述传代培养的方法采用现行常规方法，如：在37℃、3-5％的CO2条件下进行培养，每3-6天细胞生长至80％融合状态时传代，传代时用0.05％的胰酶-EDTA消化1-3分钟，使细胞脱离瓶底，将细胞悬浮液离心弃上清，用少量培养液重悬细胞沉淀，按照1:3-6的比例分装入新的培养瓶进行培养。
所述的条件培养液的收集，优选传代3-10代的细胞培养所得，3代前，细胞中可能混有杂细胞，而10代之后有可能发生基因或染色体变异，因此3-10代细胞纯度最高，活性最好。
所述的条件培养液的收集，优选细胞融合度60％-80％时间内培养两天的培养液，此时细胞处于对数生长期，细胞活力最高，此时分泌的细胞因子最丰富且其配比及浓度科学合理，抗衰老和促修复的效果最高。
所述条件培养液包含人源生长因子，包括：内皮生长因子(VEGF)、成纤维生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)、胶原、胰岛素生长因子(IGF-1)，蛋白总浓度为110-500μg/ml。
所述加入核苷酸化合物并进行冷冻干燥包括以下步骤：加入核苷酸类化合物，在-80℃的条件下预冻4小时，然后在真空条件下冻干，冷阱温度为-80℃，样品温度由-80℃升温到20±5℃，含水量为3％-20％。
所述核苷酸类化合物包括烟酰胺单核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸锂、钠、钾盐的一种或几种；所述核苷酸类化合物加入比例为5-50％。
所述的间充质干细胞活性因子复合物冻干品，含有质量浓度为110-500ppm的人脐带来源间充质干细胞分泌的完整谱系的活性因子。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及结果：
本发明首次将人脐带来源的间充质干细胞分泌的活性因子与核苷酸类化合物结合应用于护肤品和表皮修复，含有未稀释的体外模拟生理条件下脐带间充质干细胞分泌的全谱系的活性物质和间充质干细胞内部所含的丰富的为分泌的活性物质，核苷酸类化合物调节细胞新陈代谢，两者互补，全面保留了干细胞的活性物质，充分发挥其功能。
本发明脐带来源间充质干细胞及其条件培养液具有激活促进皮肤上皮细胞分裂增殖、抗辐射抗氧化、去自由基和改善炎症等作用，因此具有显著的护肤美容和抗损伤促修复效果；能明显减少细纹、提高皮肤光滑度和弹性且无不良反应，在美容护肤保健品市场具有巨大的发展空间。
本发明中加入核苷酸类化合物可以协同干细胞活性因子作用于皮肤以及粘膜细胞，提高细胞代谢，增强细胞活力，显著促进损伤以及炎症修复并且发挥显著的抗衰老作用。
本发明中间充质干细胞的冻干品，可长期保存于低温(0℃-4℃)，使用时室温保存即可，室温3个月内仍可检测到人干细胞活性因子抗衰老的活性。
本发明使用脐带来源间充质干细胞条件培养液，摆脱了传统植物成分萃取和精细化工生产工艺，采用细胞生物学的方法，模拟生理微环境，用成分明确的培养基体外培养人脐带组织来源的间充质干细胞，获得无动物源成分、无异种蛋白、含有亲人体皮肤的有益活性蛋白分子的间充质干细胞条件培养液，不添加化工添加物，如乙醇、铅汞、矿物油等致敏毒素，最大程度保证了产品持续使用的安全性。
本发明脐带来源间充质干细胞条件培养液含有完整的干细胞存活增殖的有效成分，配方成分全天然完整无缺失，得以实现相当于高活性的新生儿干细胞所需的营养条件的最佳的皮肤激活保养抗衰的效果。
本发明脐带来源间充质干细胞及其条件培养液可复合生物材料如胶原或纱布冻干或直接使用，方法简单，使用时更便捷，无需预先处理，另外可以进行大规模推广，形成产业化。
本发明活性因子复合物冻干品可直接使用或加适量水后使用，也可作为主要有效成分或组分添加其它辅剂如甘油等开发其它形式或用途的保存期限更长的护肤美容产品，复合纱布后可直接外用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为下肢难愈合溃疡在使用本发明后的结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明，但并不是对本发明保护范围的限制。
【实施例1】
一种间充质干细胞及其活性因子复合物冻干品的制备方法如下：
1.使用含有链霉素青霉素的PBS冲洗新鲜的脐带组织；剥离羊膜和血管，分离获得华通胶；将华通胶组织剪成小块铺于培养皿中，加入间充质干细胞培养基进行培养；观察组织块周围爬出的细胞。
2.对组织块周围的细胞进行传代培养：在37℃、5％的CO2条件下进行培养，每3-6天细胞生长至80％融合状态时传代，传代时用0.05％的胰酶-EDTA消化3分钟，使细胞脱离瓶底，将细胞悬浮液离心弃上清，用少量培养液重悬细胞沉淀，按照1:5的比例分装入新的培养瓶进行培养。
3.收集细胞融合度60％-80％时间内培养两天、传代3-10代的细胞培养所得的条件培养液以及细胞。
4.检测细胞数量和条件培养液蛋白浓度，同时进行细菌和病毒、内毒素检测；
5.在收集的条件培养液内加入核苷酸化合物，比例为30％，然后在-80℃下预冻4小时，然后进行真空条件下冻干，冷阱温度为-80℃，样品温度由-80℃升温到20℃，含水量15％。
6.得到间充质干细胞活性因子复合物冻干品，分装保存。
【实施例2】
一种间充质干细胞及其活性因子复合物冻干品的制备方法如下：
1.使用生理盐水冲洗新鲜的脐带组织；剥离羊膜和血管，分离获得华通胶；将华通胶组织剪成小块铺于培养皿中，加入间充质干细胞培养基进行培养；观察组织块周围爬出的细胞。
2.对组织块周围的细胞进行传代培养：在37℃、3％的CO2条件下进行培养，每3-6天细胞生长至80％融合状态时传代，传代时用0.05％的胰酶-EDTA消化1分钟，使细胞脱离瓶底，将细胞悬浮液离心弃上清，用少量培养液重悬细胞沉淀，按照1:3的比例分装入新的培养瓶进行培养。
3.收集细胞融合度60％-80％时间内培养两天、传代3-10代的细胞培养所得的条件培养液以及细胞。
4.检测细胞数量和条件培养液蛋白浓度，同时进行细菌和病毒、内毒素检测；
5.在收集的条件培养液内加入核苷酸化合物，比例为10％，然后在-80℃下预冻4小时，然后进行真空条件下冻干，冷阱温度为-80℃，样品温度由-80℃升温到18℃，含水量7％。
6.得到间充质干细胞活性因子复合物冻干品，分装保存。
【实施例3】
一种间充质干细胞及其活性因子复合物冻干品的制备方法如下：
1.使用含有链霉素青霉素的PBS冲洗新鲜的脐带组织；剥离羊膜和血管，分离获得华通胶；在培养瓶预铺生物材料，将华通胶组织剪成小块铺于培养皿中，使细胞粘附生长于生物材料表面。
2.对细胞进行传代培养：在37℃、4％的CO2条件下进行培养，每3-6天细胞生长至80％融合状态时传代，传代时用0.05％的胰酶-EDTA消化2分钟，使细胞脱离瓶底，将细胞悬浮液离心弃上清，用少量培养液重悬细胞沉淀，按照1:6的比例分装入新的培养瓶进行培养。
3.收集细胞融合度60％-80％时间内培养两天、传代3-10代的细胞培养所得的条件培养液以及细胞。
4.检测细胞数量和条件培养液蛋白浓度，同时进行细菌和病毒、内毒素检测；
5.在条件培养液内加入核苷酸化合物，比例为45％，然后在-80℃下预冻4小时，然后进行真空条件下冻干，冷阱温度为-80℃，样品温度由-80℃升温到25℃，含水量20％。
6.得到间充质干细胞活性因子复合物冻干品，分装保存。
使用实施例1制备的冻干品，24小时后炎症灶浸润退缩，中间位置出现干结，随后炎症灶面逐步缩小并分离，5天后70％面积愈合，8天后基本痊愈。使用实施例2制备的冻干品，24小时后炎症灶浸润退缩，中间位置出现干结，随后炎症灶面逐步缩小并分离，5天后60％面积愈合，10天后基本痊愈。使用实施例3制备的冻干品，24小时后炎症灶浸润退缩，中间位置出现干结，随后炎症灶面逐步缩小并分离，5天后65％面积愈合，9天后基本痊愈。图1为下肢静脉曲张引起的长时间难愈合溃疡面使用实施例1制备的冻干品的炎症灶照片。
上面虽然结合实施例对本发明作了详细的说明，但是所述技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，在权利要求保护范围之内，还可以对上述实施例进行变更或改变等。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞及其活性因子复合物冻干品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①使用脐带间充质干细胞培养基对间充质干细胞进行培养；
②分别收集细胞和间充质干细胞条件培养液；
或培养瓶预铺生物材料，使细胞粘附生长于生物材料表面，然后分别收集含有细胞的生物材料和间充质干细胞条件培养液；
③检测细胞数量和条件培养液蛋白浓度，同时进行细菌和病毒、内毒素检测；
④在条件培养液中加入核苷酸化合物，并进行冷冻干燥；
⑤得到间充质干细胞活性因子复合物冻干品，分装保存。
2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞及其活性因子复合物冻干品的制备方法，其特征在于，所述的使用脐带间充质干细胞培养基对间充质干细胞进行培养，包括原代培养和传代培养，以获得更多的细胞条件培养液；所述的条件培养液的收集，优选传代3-10代的细胞培养所得。
3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞及其活性因子复合物冻干品的制备方法，其特征在于，所述的条件培养液的收集，优选细胞融合度60％-80％时间内培养两天的培养液。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种间充质干细胞及其活性因子复合物冻干品的制备方法，其特征在于，所述条件培养液包含人源生长因子。
5.根据权利要求4所述的一种间充质干细胞及其活性因子复合物冻干品的制备方法，其特征在于，所述人源生长因子包括：内皮生长因子(VEGF)、成纤维生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)、胶原、胰岛素生长因子(IGF-1)。
6.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞及其活性因子复合物冻干品的制备方法，其特征在于，所述的加入核苷酸化合物进行冷冻干燥，包括以下步骤：加入核苷酸类化合物，在-80℃的条件下预冻4小时，然后在真空条件下冻干，冷阱温度为-80℃，样品温度由-80℃升温到20±5℃，含水量为3％-20％。
7.根据权利要求6所述的一种间充质干细胞及其活性因子复合物冻干品的制备方法，其特征在于，所述核苷酸类化合物包括烟酰胺单核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸锂、钠、钾盐的一种或几种；所述核苷酸类化合物加入比例为5-50％。
8.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞及其活性因子复合物冻干品的制备方法，其特征在于，所述的冻干品，含有质量浓度为110-500ppm的人脐带来源间充质干细胞分泌的完整谱系的活性因子。
9.一种间充质干细胞，其特征在于，根据权利要求1-8任一项所述的一种间充质干细胞及其活性因子复合物冻干品的制备方法，收集细胞后冷冻得到。
10.一种根据权利要求1-8任一项所述的方法制备的间充质干细胞活性因子复合物冻干品。
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