CN114392395A - 一种复合人间充质干细胞培养上清成分的脱细胞基质微粒及其制备方法与应用 - Google Patents

一种复合人间充质干细胞培养上清成分的脱细胞基质微粒及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种复合人间充质干细胞培养上清成分的脱细胞基质微粒及其制备方法与应用。本发明具体地公开了一种复合脱细胞基质微粒的制备方法，所述方法包括将人间充质干细胞培养上清液与脱细胞基质微粒按比例混合，经冻干获得复合脱细胞基质微粒的步骤。本发明针对脱细胞基质丢失细胞因子的问题，将脱细胞真皮基质在机械力的作用下成脱细胞真皮微粒，将浓缩的间充质干细胞上清液添加到脱细胞真皮微粒中，然后经冻干保存，不仅提高了间充质干细胞上清液中的细胞因子浓度，延长了其保存期限，还可以提高脱细胞真皮基质的细胞因子丰度，以脱细胞真皮基质为载体，更好的发挥细胞外基质及培养上清细胞因子的功能。

Description

一种复合人间充质干细胞培养上清成分的脱细胞基质微粒及 其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种复合人间充质干细胞培养上清成分的脱细胞基质微粒及其制备方法与应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是来源于早期中胚层的多能干细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能，在特定环境下，可以向多种组织如脂肪、骨、软骨、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞化。间充质干细胞主要来源于人体的间质组织，如脂肪、骨髓、脐带和胎盘等，由于其增殖能力强，免疫原性低等特性，越来越受人们关注，是组织工程立项的种子细胞来源。
间充质干细胞的培养上清中含有多种细胞因子，大量研究表明这些细胞因子能在一定程度上促进皮肤细胞生长、改善细胞生长微环境、促进伤口愈合、延缓衰老、改善皮肤生长状态等作用，因此间充质干细胞已被广泛应用于美容整形等领域，如去疤痕、填皱纹、增肤质、祛色斑、抗衰老和丰胸等，由于具有良好的美容效果和极小的副作用，间充质干细胞受到了人们的重视，是目前研究较多的一种干细胞美容技术。而这些因子对于皮肤伤口的愈合及细胞外基质的重建，胶原和弹性蛋白的稳定生产及分布具有重要作用。
目前，细胞因子是用普通培养瓶培养间充质干细胞，并收集合并多代细胞培养上清液，并对上清液进行过滤得到。该方法得到的细胞因子含量低，且该方法需要收集多代细胞培养基，效率低，且多代收集的方法制备细胞因子，产品均一性较难保证。此外，该方法制备所得细胞因子为液态，常温下易降解导致保存时间短，需低温保存，加大保存和运输难，这就阻碍了它的推广和应用。
脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix，ADM)是采用脱细胞技术，将异体组织经过生物学和化学的工艺方法处理，去表皮、脱细胞，保留了细胞外基质的形态、三维结构和成分，为宿主细胞提供了生长和代谢的场所，可诱导宿主细胞长入，促进自体成纤维细胞及血管内皮细胞在异体真皮支架中生长，从而完成对缺损组织的修复和重建。它具有良好的组织相容性和力学性能，能够长期存在，成为人体组织的一部分。在脱细胞异体真皮基质的制备过程中，彻底去除了皮肤中的细胞成分，仅保留真皮中的细胞外基质蛋白和胶原，而二者无免疫原性，移植后不会发生排斥反应。同时脱细胞真皮基质独有的三维结构为组织细胞提供了一个生长代谢的立体框架，细胞外基质蛋白可促进表皮细胞的附着和增生，从而完成了组织的生理性修复。而且脱细胞真皮基质具有优良的生物相容性和组织细胞的诱导功能，可作为组织工程新型载体材料推广使用。
ADM因其具有无毒性、无刺激性、无免疫排斥反应，有弹性、质地柔软、不断裂的组织工程学特性，主要应用于创面修复和组织缺损填充，其主要包含I型胶原、弹性蛋白、层粘连蛋白、位点特异性糖胺聚糖和一系列生长因子。得益于真皮胶原蛋白成分和一些来源生长因子的存在，以及其具有原位组织的立体支架结构，可诱导成纤维细胞、血管内皮细胞长入，具有诱导组织再生的作用，是治疗创面和组织缺损的有效方法。这种基质材料目前被广泛应用于临床多个领域的皮肤黏膜缺损修复及软组织填充。随着注射用整形美容外科材料的研究进展，微粒化ADM应运而生并被用于面部年轻化和软组织填充等领域。
目前的脱细胞基质的制备方法需经历反复冻融、胰蛋白酶-EDTA消化、十二烷基硫酸钠、Triton X-100、核酸酶等系列步骤处理，并需要水相溶液反复洗涤以去除上述试剂，在此过程中大量的水溶性细胞因子丢失，进一步开发富含更多细胞因子、效果更优良的脱细胞基质微粒具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种复合人间充质干细胞培养上清成分的低免疫原性脱细胞基质微粒及其制备方法，解决现有技术中脱细胞基质制备过程水溶性细胞因子等丢失的问题。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种复合脱细胞基质微粒的制备方法，所述方法包括将人间充质干细胞培养上清液与脱细胞基质微粒按比例混合，经冻干获得复合脱细胞基质微粒(复合人间充质干细胞培养上清成分的脱细胞基质微粒)的步骤。
进一步地，所述复合脱细胞基质微粒可为人间充质干细胞培养上清液与脱细胞基质微粒组成的组合物。
进一步地，人间充质干细胞培养上清液可来自于脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或牙龈间充质干细胞等的培养上清液但不限于此。
上述方法中，所述人间充质干细胞培养上清液可为人间充质干细胞培养上清液浓缩液，所述浓缩液是所述人间充质干细胞培养上清液经浓缩和脱盐处理后获得的人间充质干细胞培养上清液浓缩液。上述方法中，所述方法包括如下步骤：
A1)将人间充质干细胞培养上清液浓缩液与脱细胞基质微粒按比例混合，于4℃孵育24小时，中途搅拌，得到混合物；所述按比例混合为蛋白质含量为0.5-5mg/ml的间充质干细胞培养上清液浓缩液0.5-5ml与1g脱细胞基质微粒混合；
A2)步骤A1)得到的混合物冰冻成型，再经低温冻干获得所述复合脱细胞基质微粒。
进一步地，所述按比例混合具体可为1mg/ml的间充质干细胞培养上清液浓缩液1ml与1g脱细胞基质微粒混合。
所述中途搅拌可为搅拌数次，使低免疫原性脱细胞基质微粒与浓缩液中的活性成分充分结合。
上述方法中，所述冰冻成型可为-80℃冰冻成型10小时，所述低温冻干时间可为24小时。
所述复合脱细胞基质微粒为海绵状结构，可直接使用、亦可添加生理盐水后可变成可注射复合微粒。
上述方法中，所述人间充质干细胞培养上清液浓缩液的制备步骤如下：将人间充质干细胞培养于细胞培养基中，每次更换培养基及传代均收集培养上清液，离心除去死细胞和细胞碎片，随后进行超滤浓缩，无菌水置换去除培养基中的酚红试剂并脱盐，得到所述人间充质干细胞培养上清液浓缩液。
进一步地，所述细胞培养基为无血清培养基。所述细胞培养基具体可为
Figure BDA0003464443810000031
MSC增生无血清培养基。
进一步地，所述进行超滤浓缩为用超滤管进行浓缩，所述超滤管截留分子量为1～5kDa，具体地，所述超滤管截留分子量具体可为3kDa。
上述方法中，所述脱细胞基质微粒可为低免疫原性脱细胞基质微粒，所述低免疫原性脱细胞基质微粒的制备步骤如下：
B1)对动物组织进行脱细胞处理；
B2)利用α-半乳糖苷酶清除α-Gal；
B3)真空冷冻干燥后碾磨得到所述低免疫原性脱细胞基质微粒。
所述α-半乳糖苷酶可为公开号为CN101845425B的专利中实施例2记载的α-半乳糖苷酶。
上述方法中，所述真空冷冻干燥条件为：真空度1Pa、冷冻温度-70℃。
所述脱细胞处理为采用胰酶-EDTA/Triton X-100处理24小时,无菌水反复洗涤5次，去除上述试剂。
所述胰酶-EDTA是指胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)在PBS缓冲液中的混合物，其中胰蛋白酶浓度为0.25％，EDTA的浓度为0.02％。Triton X-100是指溶解于PBS缓冲液中浓度为0.5％的试剂。
进一步地，所述低免疫原性脱细胞基质微粒可为来自于同种或异种真皮、肠系膜等经脱细胞后留下的细胞外支架，细胞外基质支架经冻干和研磨成基质微粒。
上述方法中，所述动物组织可来源于离体的皮肤、神经、脊髓、肌腱、肌肉、膀胱粘膜、小肠粘膜、心脏、肝脏、肾脏、骨和/或软骨。
进一步地，所述动物组织可来源为人、猪或牛。
本发明还提供了一种由上述任一所述方法制备得到的复合脱细胞基质微粒。
本发明还提供了所述复合脱细胞基质微粒在制备用于软组织修复或填充的产品中的应用。
所述应用具体可为如乳房重塑、肌腱韧带修复、促进毛发再生等应用但不限于此。
进一步地，所述应用可为直接使用或添加生理盐水后制备成可注射复合微粒后使用。
进一步地，所述直接使用是指可直接放于清创后的创面、软组织、骨或软骨的缺损处、依靠身体的组织液浸润海绵；
所述添加生理盐水后制备成可注射复合微粒后使用是指冻干后的海绵分装于注射器中，添加一定比例生理盐水后可制备成可注射型复合微粒，用于皮下等场景的使用。
本文所述人间充质干细胞包括人脐带来源间充质干细胞、人骨髓来源间充质干细胞、人牙髓来源的间充质肝细胞或人脂肪来源间充质干细胞但不限于此。
本文所述低免疫原性脱细胞基质微粒包括但不限于取自人、猪、牛等动物的皮肤、神经、脊髓、肌腱、肌肉、膀胱粘膜、小肠粘膜、心脏、肝脏、肾脏、骨或软骨组织等的脱细胞基质。
进一步地，所述脱细胞基质经冻干后，于液氮粉碎仪中制作成低免疫原性脱细胞基质微粒，所述真空冷冻是在真空度1Pa、冷冻温度-70℃的真空冷冻机中进行。
本发明针对脱细胞基质丢失细胞因子的问题，提供了一种复合人间充质干细胞培养上清成分的低免疫原性脱细胞基质微粒及其制备方法。所述复合人间充质干细胞培养上清成分的低免疫原性脱细胞基质微粒包括人间充质干细胞培养上清成分和低免疫原性脱细胞基质微粒。将脱细胞真皮基质在机械力的作用下成脱细胞真皮微粒，将浓缩的间充质干细胞上清液添加到脱细胞真皮微粒中，然后经冻干保存，不仅提高了间充质干细胞上清液中的细胞因子浓度，延长了其保存期限，还可以提高脱细胞真皮基质的细胞因子丰度，以脱细胞真皮基质为载体，发挥两者的优势，达到优势互补的目的，可在医疗美容、多种组织损伤、缺损的修复中应用。本发明复合微粒的优势是补充了脱细胞基质制备过程，水溶性细胞因子等的丢失，更好的发挥细胞外基质及培养上清细胞因子的功能。
附图说明
图1为浓缩前后的间充质干细胞培养上清的蛋白浓度。
图2为猪脱细胞真皮基质微粒(图2中A)和冻干后的复合人间充质干细胞培养上清成分的低免疫原性脱细胞基质微粒(图2中B)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的新鲜脐带来源于解放军总医院第五医学中心捐赠。
实施例1 复合人间充质干细胞培养上清成分的脱细胞基质微粒的制备
1、间充质干细胞培养上清浓缩液获取
1.1、获取人间充质干细胞：(以脐带间充质干细胞为例)将离体的人新鲜脐带剪成2cm左右的小段，纵向剖开脐带，剥离并剔除动脉和静脉，并收集华通氏胶(SWJ)，使用0.9％氯化钠注射液清干净，将华通氏胶再剪成约1mm3大小的组织块，取适量放入培养皿中，均匀铺开，然后添加间充质干细胞培养基(
Figure BDA0003464443810000051
MSC增生无血清培养基(ME000-N023)，依科赛生物科技)在37℃，5％CO2的培养箱中培养约10天，去掉所有组织块获取原代人间充质干细胞并进行细胞计数。
1.2、将步骤1.1制备的原代人间充质干细胞按活细胞7000个/cm2的接种密度接种到20cm培养皿中，加适量
Figure BDA0003464443810000052
MSC增生无血清培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中扩增培养，P1代细胞可冻存或传代，细胞用
Figure BDA0003464443810000053
MSC增生无血清培养基传代培养。
1.3、分别收集所述步骤1.2各代培养上清液，即每次更换培养基及传代均收集培养上清液，离心除去死细胞和细胞碎片，经浓缩、脱盐后，即得人间充质干细胞培养上清液浓缩液。具体操作步骤为：收集步骤1.2各代培养上清液，在无菌环境下将人间充质干细胞培养上清液置于截留分子量为3kDa的超滤离心管中，4500rpm离心，浓缩20倍后得到间充质干细胞培养上清浓缩液；在无菌环境下打开离心管，用无菌枪头吸出离心管中的上清液至截留分子量为3kDa透析袋中，在4℃条件下，将透析袋埋入PEG20000中脱水4小时(无菌水置换去除酚红试剂)，脱盐，最终得到间充质干细胞培养上清液浓缩液；最后对上清液进行BCA法蛋白定量；
1.4、间充质干细胞上清液浓缩前后蛋白质定量
取浓缩前后的间充质干细胞培养上清20微升于96孔板，各5个复孔，按照BCA试剂盒(thermo公司)说明书进行定量分析，于Ensight仪器进行检测，测定浓缩前后蛋白浓度，结果如图1所示，浓缩后浓缩液的蛋白含量较原上清液增加。
2、低免疫原性脱细胞基质微粒制备
脱细胞细胞外基质制备(以猪真皮脱细胞基质为例)，离体的大白猪猪皮清洗后去除多余脂肪和毛发，采用胰酶-EDTA/Triton X-100(均购自sigma公司)等试剂进行脱细胞处理：胰酶-EDTA/Triton X-100处理24小时,无菌水反复洗涤5次，去除上述试剂，利用本实验室专利产品α-半乳糖苷酶(记载于如下专利中：一种α-半乳糖苷酶及其表达、纯化方法，公开号为CN101845425B，实施例2)清除α-Gal，获得低免疫原性脱细胞猪基质，真空冻干(真空冷冻是在真空度1Pa、冷冻温度-70℃的真空冷冻机中进行)后于液氮研磨仪(Freezermill 6870)中碾磨成猪低免疫原性脱细胞基质微粒，过200目细胞筛。猪低免疫原性脱细胞基质微粒的颗粒直径小于74μm。
3、复合人间充质干细胞培养上清成分的低免疫原性脱细胞基质微粒的制备
将步骤1制备的间充质干细胞培养上清液浓缩液与步骤2制备的低免疫原性脱细胞基质微粒按比例混合(比例为：蛋白质含量为1mg/mL的间充质干细胞培养上清液浓缩液1ml与1g低免疫原性脱细胞基质微粒混合)，于4℃孵育24小时，中途搅拌数次，使低免疫原性脱细胞基质微粒与浓缩液中的活性成分充分结合，再于-80℃冰冻成型(-80℃冰冻成型时间为10小时)，再经低温冻干(冻干时间为24小时)即获得复合人间充质干细胞培养上清成分的低免疫原性脱细胞基质微粒(本文中简称复合微粒，如图2所示)，所述复合微粒为海绵状结构，可直接使用，也可以使用时添加生理盐水后可变成可注射复合微粒。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种复合脱细胞基质微粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括将人间充质干细胞培养上清液与脱细胞基质微粒按比例混合，经冻干获得复合脱细胞基质微粒的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人间充质干细胞培养上清液为人间充质干细胞培养上清液浓缩液，所述浓缩液是所述人间充质干细胞培养上清液经浓缩和脱盐处理后获得的人间充质干细胞培养上清液浓缩液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A1)将人间充质干细胞培养上清液浓缩液与脱细胞基质微粒按比例混合，于4℃孵育24小时，得到混合物；所述按比例混合为蛋白质含量为0.5-5mg/mL的间充质干细胞培养上清液浓缩液0.5-5ml与1g脱细胞基质微粒混合；
A2)步骤A1)得到的混合物冰冻成型，再经低温冻干获得所述复合脱细胞基质微粒。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述冰冻成型为-80℃冰冻10小时，所述低温冻干时间为24小时。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，特征在于，所述人间充质干细胞培养上清液浓缩液的制备步骤如下：将人间充质干细胞培养于细胞培养基中，每次更换培养基及传代均收集培养上清液，离心除去死细胞和细胞碎片，随后行超滤浓缩，得到所述人间充质干细胞培养上清液浓缩液。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，特征在于，所述脱细胞基质微粒为低免疫原性脱细胞基质微粒，所述低免疫原性脱细胞基质微粒的制备步骤如下：
B1)对动物组织进行脱细胞处理；
B2)利用α-半乳糖苷酶清除α-Gal；
B3)真空冷冻干燥后碾磨得到所述低免疫原性脱细胞基质微粒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥条件为：真空度1Pa、冷冻温度-70℃。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述动物组织来源于离体的皮肤、神经、脊髓、肌腱、肌肉、膀胱粘膜、小肠粘膜、心脏、肝脏、肾脏、骨和/或软骨。
9.一种由权利要求1-8中任一所述方法制备得到的复合脱细胞基质微粒。
10.权利要求9所述的复合脱细胞基质微粒在制备用于软组织修复或填充的产品中的应用。
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