CN116492511A - 一种脱细胞基质软组织填充修复材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种可注射的脱细胞基质软组织填充修复材料及其制备方法，其是将肝脏脱细胞基质与一定比例弹性蛋白复合，经酶解等工艺得到脱细胞基质软组织填充修复材料。脱细胞基质软组织填充修复材料不添加交联剂，具有温敏性，软组织内注射后可自主装为具3D网架结构的凝胶，发挥即刻填充作用，具有良好的软组织顺应性。同时，脱细胞基质软组织填充修复材料可以促进自体软组织成纤维细胞的增殖及细胞外基质的合成，从而发挥长期修复效果。制备的软组织填充修复材料用于可注射植入剂，用于软组织损伤修复及医学美容等领域中。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术与医学美容领域，具体涉及一种脱细胞基质软组织填充修复材料及其制备方法。
背景技术
随着生活水平的提高，人们越来越注重对于美的追求。注射美容术因为手术危险性低、并发症少，恢复时间短而备受推崇。注射美容术是将可注射材料直接注射于人体特定部位，使人体的容貌或体形有所改观，起到增进容貌美或同时改善功能的方法。注射美容材料多种多样，有神经肌肉毒素，即肉毒素；有软组织填充材料，如胶原蛋白、玻尿酸、自体细胞等；还有磷脂酰胆碱、生长激素、富血小板血浆等作用机制各异的材料。
其中，可注射的软组织填充剂因其简易性、成本相对低和最小的不适感，是一种理想的软组织填充材料。目前的软组织填充材料主要有生物性材料和人工合成材料。生物性可注射填充材料主要包括自体、同种异体及异种材料，如自体脂肪、动物源胶原蛋白、以及透明质酸钠凝胶等。上述生物性可注射填充材料均不可避免的面临持久性不佳与产生免疫反应等缺点。人工合成的可注射填充材料如聚甲基丙烯酸甲酯、聚己内酯PCL、生物塑化剂等具有较为长效的软组织填充效果，但也因其降解吸收缓慢，使其在注射后可见或可触及，易产生炎症反应，形成包膜、硬结，且注射失误时难以补救等问题。因此，亟需开发理想的可注射软组织充填材料，使其具备生物相容性好、无毒、无致癌性、无免疫原性、效果持久且效果完美无痕等特点。
近年来，器官与组织脱细胞策略的出现为医学美容领域开发具备上述特点的再生型软组织填充修复材料提供了新的途径。脱细胞基质支架材料由于保留了细胞外基质的天然成分和三维结构，如I型胶原、III型胶原、IV型胶原以及纤连蛋白、粘连蛋白、糖氨聚糖等，有利于细胞粘附、增殖、分化及其他生物学功能的发挥；不仅如此，由于细胞外基质成分在不同物种间的相对保守性，脱细胞基质支架材料几乎没有或仅有很小的免疫排斥性，因此，脱细胞基质在组织修复与再生中具有其他生物材料无法比拟的优势。目前，研究人员通过脱细胞技术已经成功获得了多种不同组织与器官来源的脱细胞基质材料，如皮肤、心包、小肠粘膜、膀胱等。
肝脏是哺乳动物最大的内脏器官，也是哺乳动物再生能力最强的内脏器官，因其具有来源广泛、取材容易、活性高的特点，使其在组织工程与再生医学领域中具有广泛的应用前景。肝脏脱细胞基质主要成分是胶原蛋白，还有蛋白聚糖、氨基聚糖以及多种天然生物活性物质，目前基于肝脏脱细胞基质的相关报道及产品主要用于肝细胞分化培养、肝脏修复、仿生肝脏制备、肝肿瘤类器官制备等方面。由于肝脏脱细胞基质相较于惰性组织源脱细胞基质具有更强活性，从而具有更好的软组织修复应用潜力。然而基于肝脏组织学特性，肝脏脱细胞基质中弹性蛋白比例明显低于软组织，这是限制肝脏脱细胞基质在软组织修复应用的原因之一。
弹性蛋白是组成皮肤等软组织的主要结构性蛋白之一，为软组织提供弹性，不同于胶原蛋白提供刚性，因此缺乏弹性蛋白的填充修复剂对软组织的顺应性较低。此外，弹性蛋白可激活软组织中成纤维细胞活性，促进成纤维细胞增殖，从而有助于增加软组织弹性，消除塌陷及皱纹。
因此，利用弹性蛋白对肝脏脱细胞基质材料进行复合优化后制备的脱细胞基质软组织填充修复材料既可以通过脱细胞基质的温敏成胶特性发挥填充功能，又具有良好的软组织顺应性，还通过复合肝脏脱细胞基质和弹性蛋白的生物学功能具有更好的针对软组织的修复功能，促进自体软组织成纤维细胞的增殖及细胞外基质的合成，效果持久且自然无痕，目前还未见利用可注射性肝脏脱细胞基质单独或联合弹性蛋白复合材料用于软组织填充修复的相关报道及产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可注射性的脱细胞基质软组织填充修复材料。该材料注射后能够自主装为具3D网架结构的凝胶，从而发挥即刻填充效果。同时脱细胞基质软组织填充修复材料有利于促进自身成纤维细胞的复制及自身细胞外基质中胶原蛋白、弹性蛋白等成分的合成，从而发挥长期修复效果。
根据本发明的一个方面，提供一种脱细胞基质软组织填充修复材料，所述材料包含由肝脏脱细胞基质制备而成的可注射脱细胞基质软组织填充修复材料，优选的，所述可注射脱细胞基质软组织填充修复材料为水凝胶。
在一实施方案中，所述修复材料中还进一步包含弹性蛋白。其中，在一实施方案中，所述肝脏脱细胞基质的含量为1.0-10.0 mg/mL，所述弹性蛋白的含量不大于6.0 mg/mL。
根据本发明的另一方面，提供一种上述的脱细胞基质软组织填充修复材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）将新鲜肝脏组织灭活后使用十二烷基磺酸钠和DNase进行脱细胞处理制备肝脏脱细胞基质；
（2）将步骤（1）制得的肝脏脱细胞基质冻干、粉碎，得到肝脏脱细胞基质颗粒；
（3）任选的，在步骤（2）制得的肝脏脱细胞基质颗粒中加入弹性蛋白得到复合脱细胞基质；
（4）将步骤（2）或（3）中获得的脱细胞基质颗粒或复合脱细胞基质在胃蛋白酶酸性溶液中充分搅拌至完全溶解进行消化，随后使用碱溶液调pH至中性终止消化；
（5）将步骤（4）制得的脱细胞基质或复合脱细胞基质冻干；
（6）将步骤（5）制得的脱细胞基质或复合脱细胞基质使用缓冲体系分散，再经过孵育自主交联，得到脱细胞基质软组织填充修复材料。
进一步的，步骤（1）中包括：将肝脏组织切片后用肝素化磷酸盐缓冲液反复洗涤，然后进行反复冻融。然后将制得的肝组织用过氧乙酸与酒精联合处理进行病菌灭活。之后将制得的肝组织使用Triton X-100溶液、十二烷基磺酸钠溶液、DNA酶溶液、磷酸盐缓冲液进行充分搅拌洗涤，得到肝脏脱细胞基质。
其中，在一实施方案中，所述步骤（1）中TritonX-100溶液的浓度为0.1%~5.0%（w/v），十二烷基磺酸钠溶液的浓度为0.1%~5.0%（w/v），DNA酶溶液的浓度为1000-5000U/L。
在一实施方案中，所述步骤（2）中将肝脏脱细胞基质进行冷冻干燥与粉碎。制备成直径小于5.0 mm的肝脏脱细胞基质颗粒。优选的，所述肝脏脱细胞基质颗粒直径小于1 mm。
在一实施方案中，所述步骤（4）中胃蛋白酶的浓度为0.5-2.0 mg/mL，所述酸性溶液用稀盐酸或醋酸配制，并调节pH为 2.0-3.0，所述碱溶液用氢氧化钠配制。
在一实施方案中，所述步骤（6）中脱细胞基质或复合脱细胞基质粉末的浓度为1.0-10.0 mg/mL。缓冲体系为pH5.0-7.0的0.01M的磷酸盐缓冲液；优选的，在不高于37℃的恒温恒湿环境中孵育；更优选的，在37℃的恒温恒湿孵箱中孵育。
在一实施方案中，所述步骤所述的肝脏来源于哺乳动物。优选的，所述哺乳动物选自猪、牛或羊。
根据本发明的另一方面，提供所述脱细胞基质软组织填充修复材料或采用上述方法获得的脱细胞基质软组织填充修复材料的用途，用于制备软组织损伤修复植入剂或医学美容领域的软组织植入剂。优选的，所述植入剂为注射剂。
本发明的方法建立的脱细胞基质软组织填充修复材料，与现有可注射性填充材料相比，既可以通过脱细胞基质的温敏成胶特性发挥填充功能，又具有良好的软组织顺应性，还通过结合肝脏脱细胞基质的活性和/或弹性蛋白的生物学功能具有更好的针对软组织的修复功能，促进自体软组织成纤维细胞的增殖及细胞外基质的合成，效果持久且自然无痕。本发明操作工艺简单、实施条件温和，制备的软组织填充修复材料用于可注射植入剂，在美容整形领域中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1 脱细胞基质软组织填充修复材料的大体观察。
图2 脱细胞基质软组织填充修复材料促进体外培养成纤维细胞增殖的CCK-8检测。
图3 脱细胞基质软组织填充修复材料促进自体成纤维细胞增殖的PCNA检测。
图4 脱细胞基质软组织填充修复材料促进皮肤组织细胞外基质中I型胶原蛋白高表达的RT-PCR检测。
图5 脱细胞基质软组织填充修复材料促进皮肤组织细胞外基质中弹性蛋白高表达的RT-PCR检测。
具体实施方式
根据本发明的一个方面，提供了脱细胞基质软组织填充修复材料的制备方法，其由肝脏脱细胞基质单独或与弹性蛋白混合制备而成。优选的，肝脏脱细胞基质的含量为1.0-10.0 mg/mL，所述弹性蛋白的含量不大于6.0 mg/mL。其中，在某些实施方案中，肝脏脱细胞基质与弹性蛋白添加质量的比例为10:0、10:2、10:4、10:6。
在某些实施方案中，肝脏脱细胞基质的制备包括使用含十二烷基硫酸钠与DNA酶的缓冲液浸泡肝脏组织进行脱细胞处理的步骤。
在某些实施方案中，脱细胞处理的步骤是分梯度进行的，所述梯度包括至少第一梯度和第二梯度。
在某些优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.5-3.5%（w/v），DNA酶的浓度为3500-4500 U/L，pH7.2-7.4。在某些更优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.5-2.5%（w/v），DNA酶的浓度为3600-4400 U/L。在某些更优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.8-2.2%（w/v），DNA酶的浓度为3800-4200 U/L。在最优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为2.0%（w/v），DNA酶的浓度为4000 U/L。
在某些优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.6-1.5%（w/v），DNA酶的浓度为2500-3500 U/L，pH7.2-7.4。在某些更优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.7-1.3%（w/v），DNA酶的浓度为2600-3400 U/L。在某些更优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.8-1.2%（w/v），DNA酶的浓度为2800-3200 U/L。在最优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.0%（w/v），DNA酶的浓度为3000 U/L。
在某些优选的实施方案中，所述梯度还包括第三梯度，其中在所述第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1-0.6%（w/v），DNA酶的浓度为1500-2500 U/L，pH7.2-7.4。在某些更优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.2-0.6%（w/v），DNA酶的浓度为1600-2400 U/L。在某些更优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.4-0.6%（w/v），DNA酶的浓度为1800-2200 U/L。在最优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.5%（w/v），DNA酶的浓度为2000 U/L。
根据本发明的另一方面，提供了脱细胞基质软组织填充修复材料的制备方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行：
（1）脱细胞液的配制
1）脱细胞液I：称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为1.5-3.5%（w/v），DNA酶在磷酸盐缓冲液中的浓度为3500-4500 U/L，pH7.2-7.4，过滤除菌；
2）脱细胞液II：称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.6-1.5%（w/v），DNA酶在磷酸盐缓冲液中的浓度为2500-3500 U/L，pH7.2-7.4，过滤除菌；
3）脱细胞液III：称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.1-0.6%（w/v），DNA酶在磷酸盐缓冲液中的浓度为1500-2500 U/L，pH7.2-7.4，过滤除菌；
（2）脱细胞基质消化液的制备
将胃蛋白酶以1.0-2.0 mg/mL的比例溶于稀盐酸或醋酸等酸性溶液中，调解pH2.0-3.0，获得脱细胞基质消化液。
（3）肝脏脱细胞基质制备
1）取新鲜的肝脏组织，于磷酸盐缓冲液中清洗，将清洗后的组织震荡浸泡于所述脱细胞液I中处理，浸泡时间为4-12 h，震荡频率为50-300 r/min；
2）将经脱细胞液I处理后的所述肝脏组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于脱细胞液II中处理，浸泡时间为4-12 h，震荡频率为50-300 r/min；
3）将经脱细胞液II处理后的肝脏组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于所述脱细胞液III中处理，浸泡时间为4-12 h，震荡频率为50-300 r/min；
4）用磷酸盐缓冲液洗净，获得肝脏脱细胞基质。
（4）脱细胞基质软组织填充修复材料
将清洗并冻干磨碎的肝脏脱细胞基质添加不同比例的弹性蛋白后，加入到含有上述消化液的消化瓶中，每100毫升消化液加入10-20克肝脏脱细胞基质，加盖后放在磁力搅拌器上进行搅动，转速为50-300 rpm，于37℃，5% CO2的孵箱中消化36-96小时（消化时间根据消化酶浓度不同适当调节），然后将pH调节到7.0终止消化。收集消化液，将脱细胞基质浓度调整为1.0-10.0 mg/mL，室温孵育5 h，得到脱细胞基质软组织填充修复材料。
在某些实施方案中，新鲜的肝脏组织来源于猪、牛、羊等哺乳类动物。
在本发明中，肝脏组织是可商购的，可以购自例如屠宰场，弹性蛋白是可商购的。
根据本发明的另一方面，提供了根据上述方法获得的脱细胞基质软组织填充修复材料。
现将通过以下实施例对本发明做详细描述，然而以下实施例仅是作为例证，并不对本发明构成任何限制。
以下实施例中使用的肝脏脱细胞处理及其鉴定所需试剂的配制：
1）磷酸盐缓冲液：称取8 g NaCl，0.2 g KCl，3.491 g Na2HPO4•12H2O，0.2 gKH2PO4，溶解于1 L超纯水中，调节pH至7.2-7.4，121℃高压蒸汽灭菌20 min，4℃保存。
2）脱细胞液I：称取20 g十二烷基磺酸钠溶解于磷酸盐缓冲液中，添加DNA酶并定容至1 L，使DNA酶浓度达到4000 U/L，调节pH至7.2-7.4，过滤除菌后常温保存。
3）脱细胞液II：称取10 g十二烷基磺酸钠溶解于磷酸盐缓冲液中，添加DNA酶并定容至1 L，使DNA酶浓度达到3000 U/L，调节pH至7.2-7.4，过滤除菌后常温保存。
4）脱细胞液III：称取5 g十二烷基磺酸钠溶解于磷酸盐缓冲液中，添加DNA酶并定容于1 L，使DNA酶浓度达到2000 U/L，调节pH至7.2-7.4，过滤除菌后常温保存。
5）脱细胞基质消化液：将胃蛋白酶0.1 g溶解于100 mL醋酸溶液中，调节pH至2.0，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。使用前现配制，用于脱细胞基质的消化。
6）消化瓶：200 mL有盖柱形玻璃瓶，内置一个的磁力搅拌器用转子（直径×长：6×20mm）。
实施例1猪肝脏组织的脱细胞处理
取新鲜的猪肝脏组织（购自屠宰场），切片后于磷酸盐缓冲液中清洗3遍，用过氧乙酸和酒精进行病菌灭活。将灭活后的组织震荡浸泡于2 L脱脂溶液中处理24 h，震荡频率为300 r/min。随后，将去除脂肪的肝脏组织于磷酸盐缓冲液中清洗3遍，并震荡浸泡于2 L脱细胞液I中处理8 h，震荡频率为300 r/min。随后，将经脱细胞液I处理后的肝脏组织于磷酸盐缓冲液中清洗3遍，并震荡浸泡于2 L脱细胞液II中处理8 h，震荡频率300 r/min。随后，将经脱细胞液II处理后的肝脏组织于磷酸盐缓冲液中清洗3遍，并震荡浸泡于2 L脱细胞液III中处理8 h，震荡频率为300 r/min。最后，将经脱细胞液III处理后的肝脏组织经磷酸盐缓冲液洗净，4℃保存。
实施例2脱细胞基质软组织填充修复材料
将清洗并冻干磨碎的肝脏脱细胞基质与弹性蛋白粉末，分别按10:0、10:2、10:4、10:6比例混合均匀后，加入到含有上述消化液的消化瓶中，每100毫升消化液加入10.0克脱细胞复合基质，加盖后放在磁力搅拌器上进行搅动，转速为100 rpm，于37℃，5% CO2的孵箱中消化36-96小时（消化时间根据消化酶浓度不同适当调节）至脱细胞复合基质完全溶解，然后将pH调节到7.0终止消化。收集消化液，将脱细胞复合基质浓度调整为4.0 mg/mL，于37℃孵箱中孵育交联，得到脱细胞基质软组织填充修复材料（图1）。
实施例3脱细胞基质软组织填充修复材料促进体外培养成纤维细胞增殖的鉴定
在本实验中，我们设置成纤维细胞与不同规格（肝脏脱细胞基质:弹性蛋白10:0、10:2、10:4、10:6）脱细胞基质软组织填充修复材料共培养组、不同组织来源的脱细胞基质填充修复材料共培养组和常规培养组（Control），通过对比检测各组的细胞活力来评估脱细胞基质软组织填充修复材料对成纤维细胞增殖的促进能力。
在超净工作台内，根据不同实验需要选用肝脏脱细胞基质:弹性蛋白10:0、10:2、10:4、10:6的脱细胞基质软组织填充修复材料或不同组织来源的脱细胞基质软组织填充修复材料涂布96孔板放在潮湿的37℃细胞培养中使其凝胶化，将处于指数生长期的成纤维细胞消化并铺于96孔板。每孔培养基体积为100 µL，约5000个细胞。培养3天后更换培养基，每孔加入10 µL的CCK-8试剂，反应2 h后检测450 nm的吸光度值。
结果显示，除肝脏外，其他组织来源的脱细胞基质材料制作的水凝胶与对照组相比均无显著差异，本发明制备的脱细胞基质软组织填充修复材料能够显著提高成纤维细胞增殖能力。其中，肝脏脱细胞基质:弹性蛋白粉末为10:0-10:4范围内显示出剂量依赖性（图2；***p＜0.001 vs. Control）。
实施例4脱细胞基质软组织填充修复材料动物皮下注射后的降解试验
实验动物（SD大鼠）用3％的戊巴比妥腹腔注射（40.0 mg/kg）麻醉后，背部皮肤碘酒、乙醇消毒。用1 mL注射器将不同规格（肝脏脱细胞基质:弹性蛋白10:0、10:2、10:4、10:6）脱细胞基质软组织填充修复材料缓慢注射到大鼠背部皮下组织中，注射剂量500 μL。在注射后第2、4、6、8周对各组动物随机分三批无菌条件下取取注射位点皮下组织及其周边组织，固定于4%多聚甲醛中。1周后，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片。然后脱蜡复水，用Harris苏木素染色，0.5%盐酸乙醇分色，95%乙醇伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察观察注射部位植入剂的吸收降解情况。结果表明，脱细胞基质软组织填充修复材料在注射后6周完全降解，且不同肝脏脱细胞基质与弹性蛋白配比的具有相对稳定的降解时间，说明其具有相同的物理填充效果，具有良好的生物安全性（表1）。
表1.脱细胞基质软组织填充修复材料降解时间
实施例5脱细胞基质软组织填充修复材料促进自体成纤维细胞增殖试验
实验动物（SD大鼠）用3％的戊巴比妥腹腔注射（40.0 mg/kg）麻醉后，背部皮肤碘酒、乙醇消毒。用1 mL注射器将不同规格（肝脏脱细胞基质:弹性蛋白10:0、10:2、10:4、10:6）脱细胞基质软组织填充修复材料/磷酸盐缓冲液（Control）缓慢注射到大鼠背部皮下组织中，分两点注射，每个位点注射500 μL。在注射后第2、4、8周对各组动物随机分三批无菌条件下取取注射位点皮下组织及其周边组织，固定于4%多聚甲醛中。1周后，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片。
增殖细胞核抗原（Proliferative cell nuclear antigen，PCNA）是一种DNA聚合酶辅助因子，直接参与DNA合成，是增殖细胞的特异性标记。对切片进行PCNA免疫组化染色并计数阳性细胞比例步骤如下：对切片进行脱蜡、水化，用磷酸盐缓冲液充分冲洗，用3%的过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，用磷酸盐缓冲液充分冲洗，抗原修复，用羊血清封闭非特异性蛋白，加入已稀释的兔抗大鼠PCNA一抗，放入湿盒中4℃过夜后常温复温30 min，用磷酸盐缓冲液充分冲洗，加入已稀释的羊抗兔二抗后放入湿盒中常温1 h，用磷酸盐缓冲液充分冲洗，加入SP后放入常温30 min，用磷酸盐缓冲液充分冲洗，加入DAB显色时间控制在3-10 min由镜下观察颜色控制时间，复染、脱水、透明、封片，在显微镜下计数PCNA阳性细胞占比。
结果显示，本发明制备的软组织填充修复材料皮下注射后可提高自身成纤维细胞PCNA的阳性率（图3；*p＜0.05，***p＜0.001 vs. Control），肝脏脱细胞基质:弹性蛋白粉末为10:0-10:4范围内显示出剂量依赖性，且在材料完全降解一段时间后，不再继续促进机体自身成纤维细胞增殖，具有良好的生物安全性。
实施例6脱细胞基质软组织填充修复材料促进自体皮下组织细胞外基质中胶原蛋白、弹性蛋白表达试验
实验动物（SD大鼠）用3％的戊巴比妥腹腔注射（40.0 mg/kg）麻醉后，背部皮肤碘酒、乙醇消毒。用1 mL注射器将不同规格（肝脏脱细胞基质:弹性蛋白10:0、10:2、10:4、10:6）脱细胞基质软组织填充修复材料/磷酸盐缓冲液（Control）缓慢注射到大鼠背部皮下组织中，分两点注射，每个位点注射500 μL。在注射后第2、4、8周对各组动物随机分三批无菌条件下取取注射位点皮下组织及其周边组织，进行RNA提取、反转录cDNA后各组的胶原蛋白、弹性蛋白等细胞外基质主要蛋白的基因表达水平进行RT-qPCR检测。结果显示，本发明制备的软组织填充修复材料皮下注射后可促进自身胶原蛋白、弹性蛋白等细胞外基质主要蛋白的基因表达（图4、图5；**p＜0.01，***p＜0.001 vs. Control），且在材料完全降解一段时间后，不再继续促进机体自身胶原蛋白、弹性蛋白等细胞外基质主要蛋白的基因表达，具有良好的生物安全性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (9)
1.一种脱细胞基质软组织填充修复材料，其特征在于：所述材料包含由肝脏脱细胞基质制备而成的可注射脱细胞基质软组织填充修复材料。
2.根据权利要求1所述的脱细胞基质软组织填充修复材料，其特征在于：所述修复材料中还进一步包含弹性蛋白。
3.根据权利要求2所述的脱细胞基质软组织填充修复材料，其特征在于：所述肝脏脱细胞基质的含量为1.0-10.0 mg/mL，所述弹性蛋白的含量为不大于6.0 mg/mL。
4.一种权利要求1-3中任意一项所述的脱细胞基质软组织填充修复材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）将新鲜肝脏组织灭活后使用十二烷基磺酸钠和DNase进行脱细胞处理制备肝脏脱细胞基质；
（2）将步骤（1）制得的肝脏脱细胞基质冻干、粉碎，得到肝脏脱细胞基质颗粒；
（3）任选的，在步骤（2）制得的肝脏脱细胞基质颗粒中加入弹性蛋白得到复合脱细胞基质；
（4）将步骤（2）或（3）中获得的脱细胞基质颗粒或复合脱细胞基质在胃蛋白酶酸性溶液中充分搅拌至完全溶解进行消化，随后使用碱溶液调pH至中性终止消化；
（5）将步骤（4）制得的脱细胞基质或复合脱细胞基质冻干；
（6）将步骤（5）制得的脱细胞基质或复合脱细胞基质使用缓冲体系分散，得到脱细胞基质软组织填充修复材料。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中将肝脏脱细胞基质进行冷冻干燥与粉碎，制备成直径小于5.0 mm的颗粒。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中胃蛋白酶的浓度为0.5-2.0 mg/mL，所述酸性溶液用稀盐酸或醋酸配制，并调节pH为2.0-3.0，所述碱溶液用氢氧化钠配制。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（6）中脱细胞基质或复合脱细胞基质的浓度为1.0-10.0 mg/mL；缓冲体系为pH5.0-7.0的0.01 M的磷酸盐缓冲液；优选的，在不高于37℃的恒温恒湿环境中孵育。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的肝脏组织来源于哺乳动物。
9.一种如权利要求1-3中任一权利要求所述的脱细胞基质软组织填充修复材料或权利要求4-8中任一项所述制备方法获得的脱细胞基质软组织填充修复材料的用途，其特征在于，用于制备软组织损伤修复植入剂或医学美容领域的软组织植入剂。
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