CN113304322A

CN113304322A - 一种用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物及其制备方法

Info

Publication number: CN113304322A
Application number: CN202110651827.9A
Authority: CN
Inventors: 李志刚; 翟洪彪; 阮志; 黄宇; 唐雯
Original assignee: Beijing Zhongrui United Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Zhongrui United Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2021-08-27

Abstract

本发明公开了一种用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物及其制备方法，该制备方法包括如下步骤：使用还原法提取患者自身头发角蛋白，透析去除多余的离子，活性炭吸附去除内毒素，调整蛋白浓度为0.1‑20mg/ml，冷冻干燥后钴源照射灭菌，形成无菌角蛋白微球；人干细胞接种于微载体中，通过连续扩增，获得大量3D培养的含自身干细胞的角蛋白复合物。本发明的用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物对各类的临床的软骨修复有较大的临床使用价值和应用价值，因材料均来自于自体，无排斥，有较好的生物相容性，应用简单方便。

Description

一种用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及细胞生命科学技术领域，具体来说，涉及用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物及其制备方法。

背景技术

以蛋白为基础的生物材料，如胶原蛋白、弹性蛋白等，已被广泛用于构建组织工程支架。一般来说，蛋白基生物材料通过水解途径的酶解具有良好的生物相容性和生物降解性。它们还具有内在的生物活性，基于蛋白质的材质如果广泛临床，则会受到低成本大规模获得的挑战带来的限制。合成或重组肽低聚物或蛋白质作为支架材料尽管取得了一定的成功，但仍然是比较昂贵的。虽然从动物来源提取的蛋白质如胶原蛋白等可以大量获得，也存在潜在的安全问题，包括植入人体后外源性蛋白质可能传播疾病或引起严重的免疫反应。

人发中角蛋白含量约占总质量的65％～95％，而每年我国产生的人发废渣达几十万吨。角蛋白是一种多肽，独特的分子结构、高分子量使得它具有优良的生物学特性和良好的材料力学性能、机械性能，此外，其降解速率先慢后快，来源于机体本身、无异源性和任何免疫排斥反应，促进细胞的黏附和分化以及周围神经的快速再生，是临床移植等应用领域极具潜力的新型生物医用材料。

通过角蛋白微珠同自体间充质干细胞结后，大量扩增，获得角蛋白干细胞复合物，刺激干细胞向软骨分化，具有良好的软骨修复效果，对膝关节半月板等软骨损伤具有较好的修复作用，因材料完全来自于自体，无排斥，有较好的生物相容性和临床应用价值。

发明内容

针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物及其制备方法，能够克服现有技术的上述不足。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)使用还原法提取患者自身头发的角蛋白，获得含有巯基的角蛋白溶液，使用去氧纯净水通过8KD透析袋去除多余的盐离子，活性炭吸附去除内毒素，调整角蛋白溶液中的蛋白浓度为0.1-20mg/ml，使用喷雾的方式，把角蛋白溶液喷射到液氮中，速冻形成角蛋白微球，冷冻干燥过程中，还原性角蛋白通过新生二硫键形成稳定结构，钴源照射灭菌；

(2)将患者自体干细胞接种于角蛋白微球中，使用反应瓶进行搅拌，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养，通过连续扩增，获得大量3D培养的用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物(即含自身干细胞的角蛋白复合物)。

优选的，所述干细胞为自体脂肪、牙髓、脐带或骨髓来源的间充质干细胞。

优选的，所述角蛋白微球的粒径为10-10000um。

优选的，步骤(2)中干细胞的接种密度为1～5×10⁶cells/ml。

根据本发明的另一方面，提供了一种由上述制备方法得到的用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物。

本发明的有益效果：本发明的用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物及其制备方法获得还原性角蛋白，通过透析去除杂质，活性炭吸附去除内毒素，经钴源照射，可获得临床级别的角蛋白微球；采用还原法打开二硫键，通过后期缓慢冷冻干燥促使新的二硫键交联，形成稳定的角蛋白微球；角蛋白微球的三维结构，适于干细胞向软骨分化，高表达软骨基因，利于干细胞对软骨的修复，形成的角蛋白与干细胞复合物，不同于干细胞本身，利用于软骨损伤部位定植。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是角蛋白微球显微照片(放大倍数100X)，其中角蛋白浓度为：(a)0.01mg/ml；(b)0.1mg/ml；(c)1mg/ml；(d)2mg/ml；(e)7mg/ml；(f)11mg/ml；(g)22mg/ml；

图2是角蛋白SDS电泳实验结果；

图3是四种浓度的角蛋白微球与HUMSCs共存时Live/dead细胞染色图；

图4是角蛋白3D培养环境促进干细胞软骨基因表达结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

角蛋白分离提取

1)把头发在室温下简易清洗，除去宏观的杂质和尘土；再用无水乙醇浸泡30min后用蒸馏水除去乙醇，在干燥箱中干燥；采用甲醇溶液对干燥后的头发进行脱脂(在通风橱中操作)，不时搅拌，24h后用蒸馏水反复清洗，再在干燥箱中干燥，得到纯净的头发；

2)于烧杯中将脱脂的头发剪碎至5mm左右长度的碎发，取适量碎发于研钵中，加入适量的液氮(需戴上专业手套进行操作)对碎发进行短暂冰冻后，迅速进行研磨直至碎发成为微小颗粒，装袋备用；

3)β-巯基乙醇、尿素、SDS溶入蒸馏水中，浴比1：100，加入头发短棒或头发颗粒后先静置溶胀2h，在50℃震荡反应12h，反应后过滤分别收集未溶物及溶液，再以4000RPM在室温下离心20min除去小颗粒未溶物，至此收集较纯的角蛋白还原溶液；

4)将角蛋白还原溶液透析36h，前12h每2h更换一次去氧蒸馏水透析液，之后每4h更换一次，以除去残余的SDS、β-巯基乙醇和尿素；

角蛋白SDS电泳实验结果如图2所示。

实施例2

角蛋白微球制备

1)角蛋白溶液中添加活性炭，使其质量比达到0.5-1.0％，室温混匀20min；

3)4000RPM室温离心30min除活性炭颗粒，5um滤器过滤进一步去除活性炭颗粒；

4)使用无菌纯水调整角蛋白浓度在0.1-20mg/ml；

5)使用喷雾的方式，把角蛋白喷射到液氮中，速冻形成10-10000um角蛋白球珠(即角蛋白微球)；

6)去除多余液氮，把蛋白球珠置于冷冻干仪器中；

7)冷冻干燥去除多余的水分及液氮，得到角蛋白球珠，分装钴源照射除菌。

各浓度冻干角蛋白微观结构如图1所示。

实施例3

角蛋白材料与细胞复合物获取

1)按照正常酶消化法消化脂肪组织，分离后的第4-6天，可以看到有较多脂肪干细胞单克隆生长，待细胞融合度达到80％左右时，可以进行第一次传代；收集P3-P4代细胞；

2)取角蛋白球珠，放置于培养瓶或者反应瓶中，使用角蛋白微球覆盖培养瓶底部；

3)P3-P4代脂肪细胞，调整细胞浓度5000-10000/cm²接种至培养瓶或者反应瓶，脂肪干细胞贴附到角蛋白球珠上；

4)细胞培养72小时后，半量换液，增加细胞代谢营养，共培养5-7天；

5)5-7天的培养过程中，干细胞贴附到角蛋白球珠上，形成3D仿生培养，如图3-4所示，在角蛋白刺激下，干细胞开始高表达软骨基因，形成角蛋白材料与细胞复合物(即角蛋白球珠与细胞复合物)，实现干细胞50-200倍扩增。

实施例4

角蛋白材料与细胞复合物收集

1)使用细胞刮刀，沿培养皿底部，刮起角蛋白材料与细胞复合物；

2)使用移液管轻吹液体，分散角蛋白球珠；

3)1200RPM室温离心10min，去除多余培养基，生理盐水清洗2遍；

4)使用含1％白蛋白的生理盐水重悬角蛋白材料与细胞复合物；

5)后期可以根据需要，进行冻存扩增或临床应用研究。

实施例5

角蛋白材料与细胞复合物的应用

使用实施例4制备的自体角蛋白材料及细胞复合物悬液对膝关节软骨损伤进行调理收集实验数据，角蛋白材料及细胞复合物悬液中角蛋白含量在20mg/mL，脂肪干细胞数量保持在5×10⁶个/mL，采用膝关节腔注射，每60天注射一次，3次注射为一个疗程，每次4mL。

效果如表1所示，在使用本发明的角蛋白材料与细胞复合物调理之前，受者膝关节酸胀、活动摩擦感明显，运动有疼痛、休息疼，每日运动步数比较有限。经过一个疗程后调理后，多数受者反馈出现效果明显，每日运动步数明显增加，运动有疼痛、休息疼、活动摩擦感指标均有好转。

表1.角蛋白材料与细胞复合物治疗膝关节软骨损伤的实验数据

综上所述，借助于本发明的上述技术方案，本发明的用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物及其制备方法通过采用角蛋白形成微载体球体，同干细胞进行3D仿生培养下，形成角蛋白材料与细胞复合物，刺激干细胞向软骨分化，高表达软骨寡聚基质蛋白(COMP)基因，可以对软骨组织进行很好的修复。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）使用还原法提取患者自身头发的角蛋白，获得含有巯基的角蛋白溶液，使用去氧纯净水通过8KD透析袋去除多余的盐离子，活性炭吸附去除内毒素，调整角蛋白溶液中的蛋白浓度为0.1-20mg/ml，使用喷雾的方式，把角蛋白溶液喷射到液氮中，速冻形成角蛋白微球，冷冻干燥过程中，还原性角蛋白通过新生二硫键形成稳定结构，钴源照射灭菌；

（2）将患者自体干细胞接种于角蛋白微球中，使用反应瓶进行搅拌，37℃、5％ CO₂、饱和湿度条件下培养，通过连续扩增，获得用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物。

2.根据权利要求1所述的用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物的制备方法，其特征在于，所述干细胞为自体脂肪、牙髓、脐带或骨髓来源的间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物的制备方法，其特征在于，所述角蛋白微球的粒径为10-10000um。

4.根据权利要求1所述的用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中干细胞的接种密度为1~5×10⁶cells/ml。

5.一种由权利要求1-4任意一项所述的制备方法得到的用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物。