CN109303761A - 一种负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球组合物及其制备方法和应用。本发明将壳聚糖添加到干细胞活性因子溶液中使其溶解并制备成包埋活性因子的壳聚糖微球能有效降低角质层结构的紧密程度，还可影响角蛋白的微结构，使其结构松散并出现微细孔道，从而为干细胞活性因子的经皮吸收与传递疏通了通道，增强干细胞活性因子的利用率，使活性因子更容易进行真皮层，发挥其对皮肤的保护作用。该负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球组合物可广泛应用于化妆品中，有助于干细胞活性因子的经皮吸收和传递，由于微球的缓释作用，细胞因子可能将在机体内持续释放，维持持久的护肤效果。

Description

一种负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球组合物及其制备方 法和应用

技术领域

本发明涉及化妆品技术领域，特别涉及一种负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球组合物及其制备方法和应用。

背景技术

干细胞是一类能够自我复制且具有多向分化潜能的细胞，近几年在临床上拥有了非常广泛的应用。目前在国际临床试验注册网站上注册的神经干细胞治疗项目已达千余项，主要用于脑瘫、脑中风(如脑梗死、脑出血)后遗症、脊髓损伤、运动神经元病、小脑萎缩、共济推敲、帕金森病、视神经萎缩、老年痴呆等多种疾病的治疗。并且全球范围内已批准上市十余项干细胞产品，分布在韩国、美国、加拿大、欧洲、澳大利亚等国家和地区，包括间充质、造血干细胞等用于心肌、血液、关节、GVHD等多种疾病。

目前干细胞治疗疾病的机制仍未十分明确，主要有细胞替换、分泌细胞因子、抗炎、免疫调节等。其中科学家们普遍认为分泌细胞因子在疾病治疗中具有极为重要的作用。

干细胞分泌的活性因子是一类成分多上百种的混合物，目前研究认为其中主要包括以下有效成分：干细胞因子、表皮细胞生长因子、成纤维细胞生物因子、内皮细胞生物因子、肝细胞生长因子、神经干细胞生长因子、基质细胞衍生因子-1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白介素-6、白介素-8、单核细胞趋化蛋白-1、肿瘤坏死因子、干扰素等多种生物活性物质。与目前市场上往美容护肤品添加单一的或几个生长因子如bFGF、EGF相比，干细胞活性因子具有一定的优势，因为单一的生长因子只在某一方面刺激细胞的代谢和更新，而其它方面的一些配套未知的机制可能不会启动，因此可能会产生耐药性及依赖性，而干细胞活性因子是一个群体，它本身就能够维持细胞存活和更新，从各个方面对皮肤进行保护和促进代谢更新，具有可持续的保护作用。

目前干细胞活性因子的应用主要为制备成精华液面膜等护肤品施用于皮肤表面，但皮肤尤其是皮肤最外层由角层细胞和细胞间脂质组成的角质层天然屏障，极大的阻碍了大部分干细胞活性因子的经皮传递。因此必须借助适当辅助手段通过与皮肤中脂质或蛋白质等相互作用来促进干细胞活性因子的经皮吸收。有些美容师使用微针等将因子直接注射至皮下，然而这样将造成新的皮肤创伤且不便于客户使用，且具有感染风险；也有学者开发出脂质体介导干细胞活性因子的传递吸收，取得了进一步的效果，但制备工艺复杂，成本偏高。

发明内容

本发明目的是提供一种负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球组合物及其制备方法和应用，该组合物可作为活性成分添加到各种化妆品中制成多种含有壳聚糖包埋的干细胞活性因子人化妆品，以此来解决现有干细胞活性因子护肤品经皮吸收和传递效率低的问题。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

第一方面，本发明提供的一种负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)采用临床级无血清培养基对干细胞进行培养扩增，经定期换液、传代后收集培养上清液，去除细胞及细胞碎片后即得到干细胞活性因子溶液；

(2)步骤(1)所得的干细胞活性因子溶液中加入乳酸，随后加入低聚壳聚糖，经搅拌形成聚阳离子混合溶液，其中，所述乳酸与所述干细胞活性因子溶液的体积比为0.5～5:100，所述壳聚糖质量与所述干细胞活性因子溶液的体积的比例为0.5～1:100(g/mL)；

(3)在搅拌下，将聚阴离子溶液加入到步骤(2)所得的聚阳离子混合溶液中，经反应得到负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物。

优选的，所述步骤(2)具体包括：

在无菌条件下向步骤(1)所得的干细胞活性因子溶液中加入乳酸，并在50～200rpm的转速下磁力搅拌1～5min，随后加入低聚壳聚糖，在50～200rpm的转速下磁力搅拌5～20min使低聚壳聚糖溶解得到聚阳离子混合溶液。

优选的，所述步骤(3)中，所述聚阴离子溶液为三聚磷酸钠溶液。

进一步优选的，所述步骤(3)中，所述聚阳离子溶液中低聚壳聚糖与所述三聚磷酸钠溶液中三聚磷酸钠的质量比为1～10:1。

优选的，所述步骤(3)具体包括：在50～200rpm转速的搅拌条件下，在30～60min内使用微针将聚阴离子溶液匀速喷入步骤(2)所得的聚阳离子混合溶液中形成负载有活性细胞因子的壳聚糖微球，然后，继续搅拌20～40min使微球硬化，制备得到负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物。

优选的，所述步骤(3)中，所述“继续搅拌20～40min使微球硬化”的步骤之后，还包括：再加入冻干保护剂，恒温震荡混匀，然后进行分装，放入-70～-85℃超低温冰箱冷冻处理16～24h，冷冻冰干，在真空度1～10Pa、冷阱温度-60～-70℃的条件下抽真空时间18～36h，得到负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物。

进一步优选的，所述步骤(3)中，所述冻干保护剂由人白蛋白、甘露醇、右旋糖酐、丙二醇、维生素C组成，其中，所述人白蛋白与所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的质量比为0.5～1:100；所述甘露醇与所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的质量比为10～25:100；所述右旋糖酐与所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的质量比为3～5:100；所述丙二醇与所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的质量比为10～20:100；所述维生素C与所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的质量比为0.2～1:100。

第二方面，本发明提供的一种负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物为采用如第一方面所述的负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的制备方法制得。

第三方面，本发明提供的一种如第二方面所述的负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物在制备化妆品方面的应用。

第四方面，本发明提供的一种保湿抗衰老精华液由精华原液及如第二方面所述的负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物组成，其中，所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的添加量为5～50％。

第五方面，本发明提供的一种保湿抗衰老面膜由面膜原液及如第二方面所述的负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物组成，其中，所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的添加量为1～20％。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明将壳聚糖添加到干细胞活性因子溶液中使其溶解并制备成包埋活性因子的壳聚糖微球，比常规的干细胞活性因子上清液具有更好的护肤效果，可能是由于壳聚糖能与角蛋白相互作用，一方面有效降低角质层结构的紧密程度，另一方面可影响角蛋白的微结构，使其结构松散并出现微细孔道，从而为干细胞活性因子的经皮吸收与传递疏通了通道，增强干细胞活性因子的利用率，使活性因子更容易进行真皮层，发挥其对皮肤的保护作用。

(2)本发明选择壳聚糖作为干细胞活性因子载体，因为壳聚糖本身也具有抑菌、抗肿瘤、免疫调节等多种生理功能。在使用本发明提供的包埋壳干细胞活性因子的壳聚糖微球产品2周并停用1周后，皮肤粗糙程度仍得到改善。可能是因为载药壳聚糖微球进入体内，将发生复杂的药物释放机制，刚开始时溶液中及表面吸附的干细胞活性因子将发挥出一种突释效应，此时很大部分因子与机体接触发挥出其护肤效应，随后，随着壳聚糖微球缓慢溶解，壳聚糖微球包埋的干细胞因子将持续的缓慢释放，长时间保持机体内存在干细胞活性因子，为细胞代谢更新提供养份，发挥出一种长时间的持续的保护效应。

总之，本发明使用低聚壳聚糖对干细胞活性因子进行吸附或包埋制备成壳聚糖微球，并应用于化妆品领域，一方面可能有助于干细胞活性因子的经皮吸收和传递，另一方面由于微球的缓释作用，细胞因子可能将在机体内持续释放，维持持久的护肤效果。

附图说明

图1为实施例1所得的干细胞活性因子的间充质干细胞表型图；

图2为实施例1所得的干细胞活性因子的间充质干细胞流式鉴定结果图；

图3为试验者在负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球精华液使用前的皮肤状态图；

图4为试验者在负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球精华液使用3周后试用者的皮肤状态图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

第一方面，本发明提供的一种负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)采用临床级无血清培养基对干细胞进行培养扩增，经定期换液、传代后收集培养上清液，去除细胞及细胞碎片后即得到干细胞活性因子溶液；

(2)步骤(1)所得的干细胞活性因子溶液中加入乳酸，随后加入低聚壳聚糖，经搅拌形成聚阳离子混合溶液，其中，所述乳酸与所述干细胞活性因子溶液的体积比为0.5～5:100，所述壳聚糖质量与所述干细胞活性因子溶液的体积的比例为0.5～1:100(g/mL)；

(3)在搅拌下，将聚阴离子溶液加入到步骤(2)所得的聚阳离子混合溶液中，经反应得到负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物。

在本发明实施方式中，所述步骤(1)中，所述干细胞选自胚胎干细胞、间充质干细胞、成纤维细胞、神经干细胞、iPS细胞中的一种或多种。

在本发明实施方式中，所述步骤(1)中，所述干细胞来源于人或动物的胚胎、脐带、胎盘、皮肤、脑组织中的一种或多种。

在本发明实施方式中，所述步骤(1)具体包括：

向干细胞中加入临床级无血清培养基重悬，然后放入T75培养瓶中于细胞培养箱中培养；原代细胞长至50～80％融合后进行传代，之后每2～3天传代一次传代培养到P5；P1-P5代细胞在每次传代之前收集细胞培养上清，混匀过滤或离心取上清后即为干细胞活性因子溶液。

在本发明实施方式中，所述步骤(1)中的干细胞为采用下述方法得到：

将人或动物组织置于培养皿，无菌条件下剥离外皮和血管，用DMEM培养基将剩余胶状物质洗去残血，在转入干净的培养皿中将组织剪碎；用DMEM培养基洗涤后得到干细胞。

在本发明实施方式中，所述步骤(2)具体包括：

在无菌条件下向步骤(1)所得的干细胞活性因子溶液中加入乳酸，并在50～200rpm的转速下磁力搅拌1～5min，随后加入低聚壳聚糖，在50～200rpm的转速下磁力搅拌5～20min使低聚壳聚糖溶解得到聚阳离子混合溶液。

在本发明实施方式中，所述步骤(3)中，所述聚阴离子溶液为三聚磷酸钠溶液。

进一步的，所述步骤(3)中，所述三聚磷酸钠溶液中三聚磷酸钠的质量浓度为0.1～5wt％。

进一步的，所述步骤(3)中，所述聚阳离子溶液中低聚壳聚糖与所述三聚磷酸钠溶液中三聚磷酸钠的质量比为1～10:1。

进一步的，所述步骤(3)中，所述聚阳离子溶液中低聚壳聚糖与所述三聚磷酸钠溶液中三聚磷酸钠的质量比为3～5:1。

在本发明实施方式中，所述步骤(3)具体包括：在50～200rpm转速的搅拌条件下，在30～60min内使用微针将聚阴离子溶液匀速喷入步骤(2)所得的聚阳离子混合溶液中形成负载有活性细胞因子的壳聚糖微球，然后，继续搅拌20～40min使微球硬化，制备得到负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物。

在本发明实施方式中，所述步骤(3)中，所述“继续搅拌20～40min使微球硬化”的步骤之后，还包括：再加入冻干保护剂，恒温震荡混匀，然后进行分装，放入-70～-85℃超低温冰箱冷冻处理16～24h，冷冻冰干，在真空度1～10Pa、冷阱温度-60～-70℃的条件下抽真空时间18～36h，得到负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物。

进一步的，所述步骤(3)中，所述冻干保护剂由人白蛋白、甘露醇、右旋糖酐、丙二醇、维生素C组成，其中，所述人白蛋白与所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的质量比为0.5～1:100；所述甘露醇与所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的质量比为10～25:100；所述右旋糖酐与所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的质量比为3～5:100；所述丙二醇与所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的质量比为10～20:100；所述维生素C与所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的质量比为0.2～1:100。

第二方面，本发明提供的一种负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物为采用如第一方面所述的负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的制备方法制得。

第三方面，本发明提供的一种如第二方面所述的负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物在制备化妆品方面的应用。

第四方面，本发明提供的一种保湿抗衰老精华液由精华原液及如第二方面所述的负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物组成，其中，所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的添加量为5～50％。

第五方面，本发明提供的一种保湿抗衰老面膜由面膜原液及如第二方面所述的负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物组成，其中，所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的添加量为1～20％。

可以理解的是，壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，自1859年，法国人Rouget首先得到壳聚糖后，这种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。目前在国内已经开发出多个壳聚糖保健食品用于提高人体免疫力及肿瘤预防和辅助治疗，它可以螯合分解排泄血液中的氯离子、重金属、自由基，具有清除血管壁垃圾，恢复血管弹性，护肝排毒等作用。本发明所采用的的低聚壳聚糖作为壳聚糖的降解产物具有较好的水溶性，易被人体吸收，具有抑菌、抗肿瘤、免疫调节等多种生理功能，其对药物经膜传递等有较高的增强作用。研究表明，壳聚糖溶液可明显破坏角蛋白表面致密均匀的结构，并使角蛋白二级结构中α螺旋结构含量减少，同时推动角蛋白α螺旋结构与β折叠结构和无规则卷曲结构转变。表明壳聚糖能与角蛋白相互作用，一方面有效降低角质层结构的紧密程度，另一方面可影响角蛋白的微结构，使其结构松散并出现微细孔道，从而为干细胞活性因子的经皮吸收与传递疏通了通道。壳聚糖具有良好的组织相容性，可作为一种基因治疗载体，将壳聚糖溶液与DNA自聚集的方式沉淀，将得到一种壳聚糖包裹DNA的微球，直径在150-250nm左右，这种微球具有较好的稳定性，研究结果显示壳聚糖包裹DNA的微球在水中的稳定性超过三个月，冷冻的微球在4周后仍携带DNA穿过细胞膜进入细胞内部，保持其转染细胞的能力。壳聚糖作为天然可生物降解高分子，壳聚糖载药微球进入体内后将产生复杂的释药方式，不仅药物可从壳聚糖基体中扩散出来，壳聚糖本身也不断发生降解，其主要通过表面释放、扩散释放和溶蚀释放三种方式将药物释放到机体，起到缓释作用。有学者对制备的黄体酮壳聚糖微球进行了体内释放研究，该微球肌注到兔体内后，其血药浓度将在5个月内维持在1-2ug/L的水平，另有学者制备的胰岛素壳聚糖微球能近似恒速地释放胰岛素达80h。

综上所述，虽然干细胞活性因子在美容化妆品行业具有非常广泛的应用，在美容护肤上具有极佳的效果，然而由于皮肤角质层天然屏障的存在，常规的使用方式难于高效的将细胞因子导入机体以达到深度保养的效果。本发明使用低聚壳聚糖对干细胞活性因子进行吸附或包埋制备成壳聚糖微球，并应用于化妆品领域，一方面可能有助于干细胞活性因子的经皮吸收和传递，另一方面由于微球的缓释作用，细胞因子可能将在机体内持续释放，维持持久的护肤效果。

实施例1制备脐带间充质干细胞活性因子溶液

(1)分离脐带间充质干细胞：将质量检测合格(无菌，传染病检测为阴性，外观较肥大)的脐带置于培养皿，无菌条件下剥离外皮和血管；用DMEM培养基将剩余胶状物质洗去残血，在转入干净的培养皿中将组织剪碎；用DMEM培养基洗涤后加入间充质干细胞无血清培养基重悬，加入T75培养瓶中于细胞培养箱中培养；

(2)间充质干细胞扩增：原代细胞长至50～80％融合后进行传代，之后每2～3天传代一次传代培养到P5；

(3)收集干细胞活性因子上清液：P1-P5代细胞在每次传代之前收集细胞培养上清，混匀过滤(0.45um滤器)或离心(1000g，10min)取上清后即为间充质干细胞活性因子溶液；并置于-20℃或-80℃保存备用。

对所得的脐带间充质干细胞活性因子溶液机械进行质量检测：

(1)细胞鉴别：取P2代细胞，送第三方检测机构进行流式检测，检测结果如图1和图2所示，检测标志物包括阳性标志物CD29，CD44，CD73，CD90，CD105；阴性标志物CD19，CD34，CD45，CD133，HLA-DR，其中细胞阳性标志物阳性比例应大于90％，阴性标志物细胞比例应小于2％。

经分析可知制备因子用脐带间充质干细胞的形态：细胞边缘清析，立体结构明显，细胞核大而细胞质少；细胞生长旺盛，具有高度增殖能力的细胞；由间充质干细胞鉴定可知，流式检测结果表明，细胞高表达CD29，CD44，CD90，CD105，CD73(≥90％)，说明所培养细胞纯度很高，90％细胞均为间充质干细胞。

(2)干细胞活性因子检测：溶液混匀后取样，按下表所述的检测项目及检测方法进行检测，其质量标准及检测结果如表1所示。

表1间充质干细胞活性因子上清液的检测项目及结果

为了进一步说明本发明的有益效果，对实施例1所得产品的主要活性因子成分含量进行测定，测试结果参见表2。

表2实施例1所得产品的主要活性因子成分含量

实施例2

本实施例提供了一种负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球悬浮剂的制备方法，包括如下步骤：

按照实施例1的方法制得干细胞活性因子溶液，量取1L所得的干细胞活性因子溶液，在无菌条件下往所述干细胞活性因子溶液中加入10ml乳酸在100rpm的转速下磁力搅拌2min，随后加入5g低聚壳聚糖，在100rpm的转速下磁力搅拌10min使低聚壳聚糖溶解得到混合溶液；在100rpm转速的磁力搅拌条件下，在30～60min内使用微针将100ml的三聚磷酸钠溶液(质量浓度为1wt％)匀速喷入所得的混合溶液中，制备完成后继续搅拌30min使微球硬化，制备得到的溶液即为负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球悬浮剂，可冷冻保存。

实施例3～5

为了进一步说明本发明的有益效果，采用与实施例2类似的制备方法制备负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球悬浮剂，实施例与对比例1的区别仅在于三聚磷酸钠溶液(质量浓度为1wt％)的用量不同，具体如表3所示。

为了进一步说明本发明的有益效果，采用ELISA试剂盒检测对实施例2～5所得产品的主要活性因子成份含量进行测定，测试结果如表3所示。

表3主要活性因子成分含量的测定结果

实施例6

本实施例提供了一种负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球冻干粉的制备方法，包括如下步骤：

重复实施例2的步骤制得负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球悬浮剂，按照下述重量百分比取原料：人白蛋白1％、甘露醇20％、右旋糖酐3％、丙二醇12％、维生素C 0.5％、负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球悬浮剂余量，向实施例2所得的负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球悬浮剂中加入由人白蛋白、甘露醇、右旋糖酐、丙二醇和维生素C组成的冻干保护剂，恒温震荡混匀，然后进行分装，每瓶2～3ml，放入-80℃超低温冰箱冷冻处理16～24h，冷冻冰干，在真空度1～10Pa、冷阱温度-60～-70℃的条件下抽真空时间18～36h制得负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球冻干粉，将制备完成的冻干粉保存在4～8℃环境下。

实施例7～9

为了进一步说明本发明的有益效果，按照实施例6的制备方法制得负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球冻干粉，与实施例6的区别仅在于原料的配比不同，具体如下表4所示。

为了进一步说明本发明的有益效果，采用ELISA试剂盒检测对实施例6～9所得产品的主要活性因子成份含量进行测定，测试结果如表4所示。

表4实施例6～9所得产品的主要活性因子成分含量的测定结果

为了进一步说明本发明的有益效果，按照如下公式对实施例2～5所得的产品中各主要活性因子成分的包埋率及实施例6～9所得的产品中各主要活性因子成分的冻干复苏得率进行计算：

①包埋率(％)＝(干细胞活性因子溶液中因子浓度-壳聚糖微球混悬液因子浓度*稀释倍数)/干细胞活性因子溶液中因子浓度*100％；

②冻干复苏得率(％)＝冻干等体积复融因子浓度/壳聚糖微球混悬液因子浓度*100％；

计算结果如表5所示。

表5实施例6～9所得产品的主要活性因子成分的包埋率及冻干复苏得率

应用实施例1

为了进一步说明本发明的有益效果，分别按照实施例2～5的步骤制得4种负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球悬浮剂，分别标记为悬浮剂1、悬浮剂2、悬浮剂3、悬浮剂4，以上述悬浮剂为原料分别采用如下方法制得精华液(标记为精华液1、精华液2、精华液3、精华液4)：取悬浮剂100mL，加入到900mL精华液原液中，搅拌均匀后分装至10mL滴瓶中每瓶8mL，-20℃冷冻保存。使用前于4℃解冻后滴到皮肤表面涂抹均匀，剩余产品于4℃冷藏保存，解冻后1周内使用完毕。

按照实施例1的步骤制得干细胞活性因子，将上述步骤中的“悬浮剂”替换成“干细胞活性因子”，制得精华液5。

效果实施例1

皮肤粗糙度是客观反映皮肤状态及皮肤老化程度的一个重要指标，其前后结果的统计可以对化妆品的护肤性能做出科学的评价。选取75例试验者，分为5组，每组15例，在每个试验者左右侧脸部各选取一小块区域(左右对称)，选用如表6所示的精华液。每天睡前涂抹一次。连续使用两周，然后停止使用。在使用前、使用2周后，停止使用1周后对测量每个区域的皮肤粗糙程度，比较使用精华液2周及停止使用1周后皮肤粗糙程度的改变比例。

皮肤粗糙程度测量方法：将SILFLO硅胶轻涂于皮肤表面，待硅胶聚合凝固3～5min，然后轻轻揭起，得到皮肤结构的反相复制模型。将模型置于载玻片上，用DERMAPROFILE非接触性皮肤检测系统测量皮肤粗糙程度，每个模型样本选8个不同的小区域(3mm×3mm)测量粗糙参数取平均值，测试结果参见表6。

表6应用实施例1所得的精华液对皮肤的保护作用的测试结果

本发明还对试验者在负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球精华液(精华液2)使用前后的皮肤进行对比，如图3和图4所示，使用3周后皮肤明显变白、变光滑且富有光泽。

应用实施例2

为了进一步说明本发明的有益效果，分别按照实施例6～9的步骤制得4种负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球冻干粉，分别标记为冻干粉1、冻干粉2、冻干粉3、冻干粉4，以上述冻干粉为原料分别采用如下方法制得负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球精华液(标记为精华液6、精华液7、精华液8、精华液9)：取所得的负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球冻干粉1瓶(2mL)，另外将精华液原液(三重玻尿酸混合液)分装到与西林瓶(2mL每瓶)中；1瓶精华液原液与1瓶负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球冻干粉一起为一组精华液，可4℃或常温存放，使用前将两者混匀，涂抹于皮肤表面即可。

效果实施例2

皮肤粗糙度是客观反映皮肤状态及皮肤老化程度的一个重要指标，其前后结果的统计可以对化妆品的护肤性能做出科学的评价。选取60例试验者，分为4组，每组15例，在每个试验者左右侧脸部各选取一小块区域(左右对称)，选用如表7所示的精华液。每天睡前涂抹一次。连续使用两周，然后停止使用。在使用前、使用2周后，停止使用1周后对测量每个区域的皮肤粗糙程度，比较使用精华液2周及停止使用1周后皮肤粗糙程度的改变比例。

皮肤粗糙程度测量方法：将SILFLO硅胶轻涂于皮肤表面，待硅胶聚合凝固3～5min，然后轻轻揭起，得到皮肤结构的反相复制模型。将模型置于载玻片上，用DERMAPROFILE非接触性皮肤检测系统测量皮肤粗糙程度，每个模型样本选8个不同的小区域(3mm×3mm)测量粗糙参数取平均值，测试结果参见表7。

表7应用实施例2所得的精华液对皮肤的保护作用的测试结果

应用实施例3

本应用实施例提供了一种负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球面膜的制备方法，包括如下步骤：

取实施例2中制备的负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球悬浮剂100mL，加入到900mL面膜原液中，搅拌均匀，将无妨布面膜纸浸入上述混合液中取出于密封袋，并置于-20℃冷冻保存，使用前于4℃解冻。

应用实施例4

本应用实施例提供了一种负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球面膜的制备方法，包括如下步骤：

取实施例6中制备的负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球冻干粉1瓶，小型注射器1支，分装的25mL的面膜原液，无妨布面膜纸为一套组合产品包装；使用时用注射器吸取面膜原液加到冻干粉瓶中溶解冻干粉后吸加面膜原液中混匀，再将面膜纸浸入，完成后取出使用。

以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采用临床级无血清培养基对干细胞进行培养扩增，经定期换液、传代后收集培养上清液，去除细胞及细胞碎片后即得到干细胞活性因子溶液；

(2)步骤(1)所得的干细胞活性因子溶液中加入乳酸，随后加入低聚壳聚糖，经搅拌形成聚阳离子混合溶液，其中，所述乳酸与所述干细胞活性因子溶液的体积比为0.5～5:100，所述壳聚糖质量与所述干细胞活性因子溶液的体积的比例为0.5～1:100(g/mL)；

(3)在搅拌下，将聚阴离子溶液加入到步骤(2)所得的聚阳离子混合溶液中，经反应得到负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物。

2.根据权利要求1所述的负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：

在无菌条件下向步骤(1)所得的干细胞活性因子溶液中加入乳酸，并在50～200rpm的转速下磁力搅拌1～5min，随后加入低聚壳聚糖，在50～200rpm的转速下磁力搅拌5～20min使低聚壳聚糖溶解得到聚阳离子混合溶液。

3.根据权利要求1所述的负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述聚阴离子溶液为三聚磷酸钠溶液；所述聚阳离子溶液中低聚壳聚糖与所述三聚磷酸钠溶液中三聚磷酸钠的质量比为1～10:1。

4.根据权利要求1所述的负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：在50～200rpm转速的搅拌条件下，在30～60min内使用微针将聚阴离子溶液匀速喷入步骤(2)所得的聚阳离子混合溶液中形成负载有活性细胞因子的壳聚糖微球，然后，继续搅拌20～40min使微球硬化，制备得到负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物。

5.根据权利要求1所述的负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述“继续搅拌20～40min使微球硬化”的步骤之后，还包括：再加入冻干保护剂，恒温震荡混匀，然后进行分装，放入-70～-85℃超低温冰箱冷冻处理16～24h，冷冻冰干，在真空度1～10Pa、冷阱温度-60～-70℃的条件下抽真空时间18～36h，得到负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物。

6.根据权利要求5所述的负载有干细胞活性因子的壳聚糖微球组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述冻干保护剂由人白蛋白、甘露醇、右旋糖酐、丙二醇、维生素C组成，其中，所述人白蛋白与所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的质量比为0.5～1:100；所述甘露醇与所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的质量比为10～25:100；所述右旋糖酐与所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的质量比为3～5:100；所述丙二醇与所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的质量比为10～20:100；所述维生素C与所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的质量比为0.2～1:100。

7.一种负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物为采用如权利要求1～6中任一项所述的负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的制备方法制得。

8.一种如权利要求6所述的负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物在制备化妆品方面的应用。

9.一种保湿抗衰老精华液由精华原液及如权利要求6所述的负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物组成，其中，所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的添加量为5～50％。

10.一种保湿抗衰老面膜由面膜原液及如权利要求6所述的负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物组成，其中，所述负载有活性细胞因子的壳聚糖微球组合物的添加量为1～20％。