CN113208998A - 一种含干细胞外泌体的抗皱精华液 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含干细胞外泌体的抗皱精华液，由包括间充质干细胞外泌体、鹿茸多肽以及至少一种可以皮肤外用的辅料组成，所述鹿茸多肽由分子量为1kDa‑3kDa、3kDa‑5kDa和5kDa‑10kDa的鹿茸多肽组成，且分子量为1kDa‑3kDa、3kDa‑5kDa和5kDa‑10kDa的鹿茸多肽的重量份数比为(1.5‑3):(1‑2):(1‑2.5)。本发明所述的含干细胞外泌体的抗皱精华液表现出更好的抗皮肤老化作用和抗皱效果。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品和生物医药技术领域，尤其是涉及一种含干细胞外泌体的抗皱精华液。
背景技术
皮肤衰老是随着年龄的增长逐步发生的细胞和结构损伤的积累过程。老化的皮肤表现为胶原蛋白纤维减少，弹性蛋白纤维的消失和无配向弹性蛋白纤维增加，蛋白多糖含量增多，皮下组织的脂肪细胞密度低下等，导致皱纹、褐斑等形成。
皮肤衰老的原因分为内在因素和外在因素。皮肤老化的内源性机理非常复杂，代表性学说主要有自由基学说，自由基是体内氧化代谢产生的带有不对称电子的中间体，健康机体中自由基的产生与清除处于平衡状态，过量自由基会攻击人体的细胞，当细胞受到不断的破坏性损伤时，衰老便随之发生。自由基对细胞的损伤是后天积累性的，当这种破坏达到临界点时，细胞活性不可恢复，导致细胞死亡。外在性因素是可控的且对皮肤衰老有不同程度的影响，主要包括阳光曝晒、吸烟、重力作用以及生活习惯等。其中，光老化(紫外线)是外在环境刺激中导致皮肤衰老的最常见、作用最强的外在因素，过度阳光照射会导致胶原蛋白分解，细胞新陈代谢降低，有毒物质积累，抑制抗氧化物活性等。
外泌体(Exosome)是细胞向胞外分泌的囊泡类小体，直径为30～150纳米，具有典型的脂质双分子层膜结构，可存在于细胞培养上清液、血浆、血清、唾液、尿液、羊水等生物体液中；其携带有母细胞的多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息，在细胞-细胞间的物质和信息传递中起重要作用。干细胞外泌体可以被成纤维细胞摄取，促进其迁移、增殖，并通过促进Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原合并，可以增加神经-钙黏素，增殖细胞核抗原和细胞周期蛋白D1的基因表达，以加速皮肤的修复和再生。
但是从已公开的外泌体在化妆品中的应用来看，其一方面研究还不是很充分，另外一方面效果仍有很大的提高空间。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种含干细胞外泌体的抗皱精华液。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种含干细胞外泌体的抗皱精华液，由包括间充质干细胞外泌体、鹿茸多肽以及至少一种可以皮肤外用的辅料组成，所述鹿茸多肽由分子量为1kDa-3kDa、3kDa-5kDa和5kDa-10kDa的鹿茸多肽组成，且分子量为1kDa-3kDa、3kDa-5kDa和5kDa-10kDa的鹿茸多肽的重量份数比为(1.5-3):(1-2):(1-2.5)。
进一步，所述间充质干细胞外泌体以蛋白质质量计的重量百分比用量为0.030-0.065％，所述鹿茸多肽的重量百分比用量为0.007-0.009％。
进一步，所述间充质干细胞外泌体以蛋白质质量计的重量百分比用量为0.048％，所述鹿茸多肽的重量百分比用量为0.008％。
进一步，分子量为1kDa-3kDa、3kDa-5kDa和5kDa-10kDa的鹿茸多肽的重量份数比为2.2:1.4:2。
进一步，所述间充质干细胞外泌体由包括如下步骤的方法制备得到：
1)将脐带间充质干细胞接种于基础培养基中，并在培养基中加入烟酰胺1.36～1.57mg/L,白藜芦醇6.8～7.3μmol/L,地塞米松0.87～0.94mmol/L,氢化可的松1.79～1.92mmol/L，维生素C 5～10mg/L；
2)置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中，培养2-3d；之后吸除培养基，加入基础培养基，继续培养24h后收集上清液；
3)通过离心方法从上清液中提取外泌体，即得到间充质干细胞外泌体。
进一步，所述鹿茸多肽由包括如下步骤的方法制备得到：
1)将冷冻的鲜马鹿茸解冻后切片，用预先在4℃冷藏的蒸馏水将鹿茸片冲洗至没有血色，用冻干机冷冻后粉碎，过500目的标准筛，得到鹿茸粉；
2)将鹿茸粉浸泡在质量浓度为50-60％的乙醇溶液中，并同时用超声处理40-50min，其中鹿茸粉与乙醇溶液的料液比为1:10-15；
3)对提取液进行过滤提纯，并进行冻干粉碎处理得到鹿茸提多肽；
4)分别采用1kDa、3kDa、5kDa和10kDa的超滤膜对步骤3)得到的鹿茸多肽按分子量进行分离，分别收集1kDa-3kDa组分、3kDa-5kDa组分和5kDa-10kDa组分。
进一步，所述皮肤外用的辅料包括防腐剂、增稠剂、抗氧化剂、抗菌剂、神经酰胺、角鲨烷和植物提取物；所述防腐剂的重量百分比用量为0.1-0.2％，增稠剂的重量百分比用量为0.8-0.9％，抗氧化剂的重量百分比用量为0.5-0.7％，神经酰胺的重量百分比用量为0.2-0.3％、角鲨烷的重量百分比用量为0.1-0.2％和植物提取物0.3-0.35％。
进一步，所述植物提取物为芦荟提取物、绿茶提取物、玫瑰提取物、葡萄籽提取物中的一种或两种以上的混合物。
进一步，所述防腐剂为苯甲醇、苯甲酸、水杨酸、硼酸、山梨酸中的一种或两种以上的混合物；所述增稠剂为黄原胶、卡波940中的一种或两种；所述抗氧化剂为维生素C、生育酚、没食子酸丙酯、超氧化物歧化酶中的一种或两种以上的混合物。
相对于现有技术，本发明所述的含干细胞外泌体的抗皱精华液具有以下优势：
本发明所述的含干细胞外泌体的抗皱精华液采用间充质干细胞外泌体和鹿茸多肽，并对鹿茸多肽的分子量进行了限定，发现将分子量为1kDa-3kDa、3kDa-5kDa和5kDa-10kDa的鹿茸多肽以不同的配比使用时，对人成纤维细胞的促进生成作用不同，当按照本发明所提供的比例配合使用时，表现出更好的促进胶原分泌的效果，而且分泌的Ⅲ型胶原更多，Ⅰ、Ⅲ型胶原比例更接近人体正常皮肤的比例3:1。同时通过光老化实验和志愿者使用效果得知，本发明所提供的精华液表现出更好的抗皮肤老化作用和抗皱效果。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将结合实施例来详细说明本发明。
实施例1制备间充质干细胞外泌体
材料：脐带间充质干细胞接购自武汉普诺赛(Procell)生命科技有限公司；
MSCBM基础培养基购自深圳市达科为生物技术股份有限公司；
1)向MSCBM基础培养基中添加Helios的UltraGROTM混合成完全培养基，之后将脐带间充质干细胞接种于基础培养基中，并在培养基中加入烟酰胺1.36mg/L,白藜芦醇7.1μmol/L,地塞米松0.88mmol/L,氢化可的松1.80mmol/L，维生素C 8mg/L；
2)置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中，培养2d；之后吸除培养基，加入基础培养基，继续培养24h后收集上清液；
3)常温下，首先300g离心12min,吸取上清液；
然后2000g离心20min，吸取上清液；
再10000g高速离心30min，吸取上清液；
最后20000g超速离心60min，除去上清液，沉淀即为初选外泌体；
用PBS缓冲液冲洗沉淀并重悬后，120000g再次离心90min，生理盐水重悬沉淀，得到间充质干细胞外泌体。
实施例2制备鹿茸多肽
1)将冷冻的鲜马鹿茸解冻后切片，用预先在4℃冷藏的蒸馏水将鹿茸片冲洗至没有血色，用冻干机冷冻后粉碎，过500目的标准筛，得到鹿茸粉；
2)将鹿茸粉浸泡在质量浓度为50％的乙醇溶液中，并同时用超声处理50min，其中鹿茸粉与乙醇溶液的料液比为1:15；
3)对提取液进行过滤提纯，并进行冻干粉碎处理得到鹿茸提多肽；
4)分别采用1kDa、3kDa、5kDa和10kDa的超滤膜对步骤3)得到的鹿茸多肽按分子量进行分离，分别收集1kDa-3kDa组分、3kDa-5kDa组分和5kDa-10kDa组分；
5)分别按照重量份数比为1.5:1:2、3:2:1、2.2:1.4:2、1:1:1、0:1.4:2、2.2:0:2、2.2:1.4:0、2.1:0:0、0:1:0、0:0:1对1kDa-3kDa组分、3kDa-5kDa组分和5kDa-10kDa组分进行分配，得到鹿茸多肽Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组、Ⅶ组、Ⅷ组、Ⅸ组、Ⅹ组。
实施例3制备抗皱精华液
表1实施例1-3的间充质干细胞外泌体和鹿茸多肽的含量表
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 间充质干细胞外泌体(％) | 0.030 | 0.065 | 0.048 |
| 鹿茸多肽(％) | 0.09；Ⅰ组 | 0.07；Ⅱ组 | 0.008；Ⅲ组 |
表2对比例1-9的间充质干细胞外泌体和鹿茸多肽的含量表
另外，实施例1-3和对比例1-9所制备的抗皱精华液还包括水杨酸0.05％、苯甲醇0.07％、卡波940 0.64％、黄原胶0.21％、生育酚0.15％、没食子酸丙酯0.12％、超氧化物歧化酶0.36％、神经酰胺0.28％、角鲨烷0.14％、绿茶提取物0.10％、玫瑰提取物0.08％、葡萄籽提取物0.17％和余量的蒸馏水。
将上述配方按照常规精华液制备方法进行制备。
药理实验：人成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白分泌影响实验
细胞培养孔板，每孔加1000个人皮肤成纤维细胞，加入MSCBM基础培养。每3d换液一次，待细胞附着后，各组分别加入10μL实施1-3和对比例1-9所配置的干细胞外泌体和鹿茸多肽的混合液，并设置空白对照组(采用等体积PBS缓冲液)，培养7d后，ELASA法测定Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量，并采用Excel对数据行统计学处理，分组及数据结果如下(means±s,n＝10)：
表3人成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白分泌量
有研究表明，1-3kDa的鹿茸多肽的抗氧化能力最好，3-5kDa的鹿茸多肽的促NIH/3T3细胞的增殖效果最好，5-10kDa的鹿茸多肽的促胶原蛋白分泌的效果最好。而这3种分子量范围的鹿茸多肽比例不同又会产生何种影响，与干细胞外泌体同时使用会起到什么效果。通过实验结果表明，当干细胞外泌体和鹿茸多肽同时存在，且分子量为1kDa-3kDa、3kDa-5kDa和5kDa-10kDa的鹿茸多肽的重量份数比在(1.5-3):(1-2):(1-2.5)之内，在同等浓度下不但表现出更好的促进胶原分泌的效果，而且分泌的Ⅲ型胶原更多，Ⅰ、Ⅲ型胶原比例更接近人体正常皮肤的比例3:1。通过对比例1与实施例1-3相比发现，当这三种多肽组分占比相同时，Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌反而不是最多的，1-3kDa的抗氧化能力、3-5kDa的增殖效果、5-10kDa的促胶原蛋白分泌并不能达到很好的协同效果。对比例2-7的鹿茸多肽缺少一种或两种分子量的组分，与对比例1和实施例1-3相比，其效果更弱一些，说明只有同时存在这3种分子量范围的多肽才更有利于胶原蛋白分泌。另外，通过实施3和对比例8-9相比，说明干细胞分泌体和鹿茸多肽之间存在协同效果，表现出更好的促进胶原分泌的效果。
药理实验-抗光老化对比动物实验
将5周龄雌性裸鼠，背部由中线分隔开，左边为基质区涂抹空包基质，右边为涂药区涂抹实施例或对比例的精华液(空白组右边不涂抹任何产品)，每日上午定时涂抹，涂抹1小时后，对裸鼠背部皮肤采用UVA(1.76J/cm2)和UVB(0.16J/cm2)持续照射5天，同时每天晚上涂抹同上午一样的供试品，于实验结束后检测裸鼠皮肤中MMPs和胶原蛋白的表达。分为空白组、实验组1-12，每组10只。
羟脯氨酸(Hyp)是机体中胶原蛋白的专属氨基酸，约占哺乳类动物胶原蛋白的13.4％，胶原蛋白的含量可通过Hyp的含量计算可得，其计算公式为：胶原蛋白含量(μg/mgprot)＝Hyp含量(μg/mgprot)×7.46，于末次给药24h后进行颈椎脱臼处死，分别于涂基质区和涂供试品去取样，采用Hyp试剂盒测定Hyp的含量，并计算胶原蛋白的含量，以涂基质区胶原蛋白含量为100％，计算涂药区胶原蛋白含量相对值。
MMPs(基质金属蛋白酶，matrix metalloproteinase)，尤其是MMP-1和MMP-3，是降解胶原的主要酶类，可引起皮肤松弛。其中以MMP-1试剂盒和MMP-3试剂盒分别检测MMP-1和MMP-3含量，以涂基质区MMPs含量为100％，计算涂药区的MMPs含量相对值。
实验数据采用平均数±标准差的方式记录，分组、给药与实验结果见下表(n＝10，means±s)
表4胶原蛋白含量和MMPs含量相对值
| 编号 | 给药 | 胶原％ | MMP-1％ | MMP-3％ |
| 实验组1 | 实施例1 | 138.3±2.6 | 73.1±1.8 | 72.8±1.5 |
| 实验组2 | 实施例2 | 136.1±2.3 | 70.2±2.0 | 69.6±1.7 |
| 实验组3 | 实施例3 | 143.5±1.9 | 69.4±1.6 | 68.7±1.8 |
| 实验组4 | 对比例1 | 129.8±2.1 | 79.3±2.1 | 78.5±2.2 |
| 实验组5 | 对比例2 | 126.2±2.4 | 82.5±1.5 | 81.3±1.9 |
| 实验组6 | 对比例3 | 125.0±1.7 | 82.4±2.4 | 82.2±2.5 |
| 实验组7 | 对比例4 | 126.9±3.1 | 84.9±2.1 | 83.6±2.3 |
| 实验组8 | 对比例5 | 120.5±2.1 | 89.7±1.9 | 88.8±2.7 |
| 实验组9 | 对比例6 | 122.2±2.5 | 92.4±2.3 | 90.5±1.6 |
| 实验组10 | 对比例7 | 123.8±2.3 | 91.0±1.7 | 89.4±1.9 |
| 实验组11 | 对比例8 | 118.4±2.8 | 95.6±2.5 | 93.3±2.0 |
| 实验组12 | 对比例9 | 116.6±2.7 | 97.1±1.8 | 95.4±2.8 |
| 空白组 | 93.7±2.2 | 107.6±1.7 | 108.3±2.0 |
实验结果表明，采用实施例1-3所制备的精华液的实验动物，皮肤中MMPs含量明显低于采用空白基质的实验动物，而胶原蛋白含量则明显高于采用空白基质的实验动物，说明采用本发明提供的精华液，能够显著抑制模拟阳光的紫外线照射对实验动物皮肤造成的损伤，体现出较好的护肤效果。且与对比例是实验数据相比，优选的鹿茸多肽的比例能够更好的发挥抗皮肤老化作用。
精华效用测评
选取130名志愿者，随机分成13组，每组10名，均为同一写字楼内的女性职员，年龄在22-40岁之间，身体健康，皮肤无过敏史且无皮肤病，能够按照使用要求使用精华液，并配合给予相应的评价，真实反映自身感受。
让每组志愿者分别单独使用上述制备的实施例1-3和对比例1-9的精华液以及一种市面上已知的抗皱净化，使用方法为取5-6滴精华液，轻轻拍打涂抹与清洁后脸部直至完全吸收，早晚各一次，使用一周后，给出相应的使用感受并进行评分。评分标准：5分为非常满意，3分为满意，1分为一般，统计结果见表5。
表5使用后感受评分结果
使用美国Visia皮肤测试仪检测上述志愿者皮肤皱纹、平整度，统计结果见表6。
表6统计结果
| 皱纹改善率％ | 平整度改善率％ | |
| 实施例1 | 27.8 | 26.8 |
| 实施例2 | 27.1 | 27.0 |
| 实施例3 | 28.9 | 28.1 |
| 对比例1 | 25.6 | 24.3 |
| 对比例2 | 23.4 | 23.9 |
| 对比例3 | 24.1 | 24.5 |
| 对比例4 | 23.7 | 22.8 |
| 对比例5 | 22.5 | 23.4 |
| 对比例6 | 20.3 | 22.2 |
| 对比例7 | 21.2 | 20.7 |
| 对比例8 | 20.4 | 19.9 |
| 对比例9 | 19.8 | 18.3 |
| 对照组 | 23.5 | 21.6 |
从表5和表6可以看出，实施例所提供的抗皱精华液有明显的抗皱效果，证明本发明所提供的抗皱精华液对肌肤抗皱有一定的实际功效。使用实施例的精华液后，志愿者的皮肤弹性和皱纹深度的改善情况均优于对比例和市售抗皱产品。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种含干细胞外泌体的抗皱精华液，其特征在于：由包括间充质干细胞外泌体、鹿茸多肽以及至少一种可以皮肤外用的辅料组成，所述鹿茸多肽由分子量为1kDa-3kDa、3kDa-5kDa和5kDa-10kDa的鹿茸多肽组成，且分子量为1kDa-3kDa、3kDa-5kDa和5kDa-10kDa的鹿茸多肽的重量份数比为(1.5-3):(1-2):(1-2.5)。
2.根据权利要求1所述的含干细胞外泌体的抗皱精华液，其特征在于：所述间充质干细胞外泌体以蛋白质质量计的重量百分比用量为0.030-0.065％，所述鹿茸多肽的重量百分比用量为0.007-0.009％。
3.根据权利要求2所述的含干细胞外泌体的抗皱精华液，其特征在于：所述间充质干细胞外泌体以蛋白质质量计的重量百分比用量为0.048％，所述鹿茸多肽的重量百分比用量为0.008％。
4.根据权利要求1所述的含干细胞外泌体的抗皱精华液，其特征在于：分子量为1kDa-3kDa、3kDa-5kDa和5kDa-10kDa的鹿茸多肽的重量份数比为2.2:1.4:2。
5.根据权利要求1所述的含干细胞外泌体的抗皱精华液，其特征在于：所述间充质干细胞外泌体由包括如下步骤的方法制备得到：
1)将脐带间充质干细胞接种于基础培养基中，并在培养基中加入烟酰胺1.36～1.57mg/L,白藜芦醇6.8～7.3μmol/L,地塞米松0.87～0.94mmol/L,氢化可的松1.79～1.92mmol/L，维生素C 5～10mg/L；
2)置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中，培养2-3d；之后吸除培养基，加入基础培养基，继续培养24h后收集上清液；
3)通过离心方法从上清液中提取外泌体，即得到间充质干细胞外泌体。
6.根据权利要求1所述的含干细胞外泌体的抗皱精华液，其特征在于：所述鹿茸多肽由包括如下步骤的方法制备得到：
1)将冷冻的鲜马鹿茸解冻后切片，用预先在4℃冷藏的蒸馏水将鹿茸片冲洗至没有血色，用冻干机冷冻后粉碎，过500目的标准筛，得到鹿茸粉；
2)将鹿茸粉浸泡在质量浓度为50-60％的乙醇溶液中，并同时用超声处理40-50min，其中鹿茸粉与乙醇溶液的料液比为1:10-15；
3)对提取液进行过滤提纯，并进行冻干粉碎处理得到鹿茸提多肽；
4)分别采用1kDa、3kDa、5kDa和10kDa的超滤膜对步骤3)得到的鹿茸多肽按分子量进行分离，分别收集1kDa-3kDa组分、3kDa-5kDa组分和5kDa-10kDa组分。
7.根据权利要求1所述的含干细胞外泌体的抗皱精华液，其特征在于：所述皮肤外用的辅料包括防腐剂、增稠剂、抗氧化剂、抗菌剂、神经酰胺、角鲨烷和植物提取物；所述防腐剂的重量百分比用量为0.1-0.2％，增稠剂的重量百分比用量为0.8-0.9％，抗氧化剂的重量百分比用量为0.5-0.7％，神经酰胺的重量百分比用量为0.2-0.3％、角鲨烷的重量百分比用量为0.1-0.2％和植物提取物0.3-0.35％。
8.根据权利要求7所述的含干细胞外泌体的抗皱精华液，其特征在于：所述植物提取物为芦荟提取物、绿茶提取物、玫瑰提取物、葡萄籽提取物中的一种或两种以上的混合物。
9.根据权利要求7所述的含干细胞外泌体的抗皱精华液，其特征在于：所述防腐剂为苯甲醇、苯甲酸、水杨酸、硼酸、山梨酸中的一种或两种以上的混合物；所述增稠剂为黄原胶、卡波940中的一种或两种；所述抗氧化剂为维生素C、生育酚、没食子酸丙酯、超氧化物歧化酶中的一种或两种以上的混合物。
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