CN112516067A - 一种含脐带间充质干细胞外泌体的组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含脐带间充质干细胞外泌体的组合物，按质量百分比计，包括以下组分：脐带间充质干细胞外泌体：0.02‑0.6％；抗氧化剂：2.5‑5.0％；海藻多糖：1.5‑2.5％；保湿剂：5.6‑12.5％；烟酰胺：0.05‑0.6％；羟乙基纤维素：0.2‑0.8％；神经酰胺‑2：0.1‑0.5％；去离子水：余量。本发明的组合物，在添加有脐带间充质干细胞外泌体的基础上，配合保湿剂、抗氧化剂及海藻多糖，可加速皮肤细胞的新陈代谢，恢复基底细胞抗氧化及再生能力，防止皮肤老化，增加皮肤弹性和饱满度，缩小毛孔，提升光泽。
Description
技术领域
本发明涉及生物科技技术领域，更具体地说，它涉及一种含脐带间充质干细胞外泌体的组合物及其应用。
背景技术
皮肤覆于机体的表面，其作为第一道天然屏障直接与外界接触，能够防止微生物入侵、紫外线损伤等外部刺激。但随着化妆品的过度使用，很多人出现了脸部皮肤角质层变薄，容易出现过敏、红肿以及损伤等症状。
干细胞疗法在再生医学领域表现出巨大潜力，尤其是脐带间充质干细胞；由于其来源广泛，提取方便，低免疫原性等优势受到了越来越多人的关注。
但目前的脐带间充质干细胞多应用于治疗红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率；或用于治疗骨和肌肉衰退性疾病、心脑血管疾病、肝病、脑及脊髓神经损伤和老年痴呆等。脐带间充质干细胞外泌体并未涉及在抗皮肤衰老、皮肤修复等方面的研究。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供含脐带间充质干细胞外泌体的组合物及其应用，可加速皮肤细胞的新陈代谢，恢复基底细胞抗氧化及再生能力，防止皮肤老化，增加皮肤弹性和饱满度，缩小毛孔，提升光泽。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种含脐带间充质干细胞外泌体的组合物，按质量百分比计，包括以下组分：按质量百分比计，包括以下组分：
脐带间充质干细胞外泌体：0.02-0.6％；
抗氧化剂：2.5-5.0％；
海藻多糖：1.5-2.5％；
保湿剂：5.6-12.5％；
烟酰胺：0.05-0.6％；
羟乙基纤维素：0.2-0.8％；
神经酰胺-2：0.1-0.5％；
去离子水：余量。
进一步地，还包括积雪草提取物和马齿苋提取物；所述积雪草提取物与马齿苋提取物的质量比为1:1。
进一步地，所述抗氧化剂为花青素、白藜芦醇、维生素C、维生素E、类胡萝卜素中的至少一种。
进一步地，所述保湿剂为透明质酸钠、甘油、甘氨和精氨酸中的至少一种。
进一步地，所述保湿剂为明质酸钠、甘油、甘氨和精氨酸的组合物。
进一步地，所述海藻多糖为海蒿子多糖、裙带菜多糖、马尾藻多糖、珍珠菜多糖、石花菜多糖中的至少一种。
进一步地，所述脐带间充质干细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)、取新鲜脐带，在无菌条件下，将脐带剪成小段，用PBS缓冲液反复冲洗3次，去除动静脉获得沃顿胶，将沃顿胶剪碎得并加入胶原酶消化液进行消化；将消化好的悬液混匀后，用PBS稀释至不粘稠，并用细胞过滤器进行过滤，收集滤液，将滤液置于1100r/min条件下离心10min，弃去上清液得到细胞沉淀；用平衡盐缓冲液洗涤细胞沉淀3次，再用2倍体积的平衡盐缓冲液重悬细胞，利用密度梯度离心法纯化细胞悬液，得脐带间充质原代干细胞；
(2)将脐带间充质原代干细胞以2×100/cm2的密度接种至含10％FBS的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2的饱和湿度下培养，每隔20min换液一次并去除未贴壁细胞；待细胞融合率达到80％～90％时，消化细胞进行传代培养；等扩增到所需数量时，离心去除细胞以及碎片等，收集上清，采用0.22μm无菌滤膜过滤至超滤离心管中浓缩，将浓缩液移至添加有质量浓度为300g/L蔗糖的超速离心管中离心，PBS缓冲液重悬沉淀，即得间充质干细胞外泌体，分装后在-80℃保存备用。
本发明还提供了上述含脐带间充质干细胞外泌体的组合物在制备皮肤修复化妆品中的应用。
进一步地，所述皮肤修复化妆品包括精华液、面膜和冻干粉。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.本发明的组合物，在添加有脐带间充质干细胞外泌体的基础上，配合保湿剂、抗氧化剂及海藻多糖，可加速皮肤细胞的新陈代谢，恢复基底细胞抗氧化及再生能力，防止皮肤老化，增加皮肤弹性和饱满度，缩小毛孔，提升光泽。
2.本申请的组合物，不添加无防腐剂和乳化剂，避免了防腐剂和乳化剂对人体和皮肤的伤害，使用过程中，皮肤不会发生过敏。
3.本申请采用的马齿苋提取物能具有屏蔽化学物质的刺激，避免皮肤干燥不紧绷，还可降低对敏感皮肤的刺激，减少过敏反应。
4.本申请采用的积雪草提取物可显著提高胶原蛋白和细胞层纤连蛋白的含量，而且能够刺激促成瘢痕成熟的I型胶原的生产，减少炎症反应的产生。此外，积雪草提取物还能减少前炎症介质的产生，提高和修复肌肤自身屏障功能。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1：
脐带间充质干细胞外泌体：0.02％；
花青素：0.5％；白藜芦醇：0.5％；维生素E：0.5％；类胡萝卜素：0.5％；
海蒿子多糖：0.6％；裙带菜多糖：0.6％；马尾藻多糖：0.6％；
透明质酸钠：2.0％；甘油：2.5％；甘氨：2.0％；精氨酸：2.5％；
烟酰胺：0.3％；羟乙基纤维素：0.3％；神经酰胺-2：0.2％；
去离子水：余量。
上述脐带间充质干细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)、取新鲜脐带，在无菌条件下，将脐带剪成小段，用PBS缓冲液反复冲洗3次，去除动静脉获得沃顿胶，将沃顿胶剪碎得并加入胶原酶消化液进行消化；将消化好的悬液混匀后，用PBS稀释至不粘稠，并用细胞过滤器进行过滤，收集滤液，将滤液置于1100r/min条件下离心10min，弃去上清液得到细胞沉淀；用平衡盐缓冲液洗涤细胞沉淀3次，再用2倍体积的平衡盐缓冲液重悬细胞，利用密度梯度离心法纯化细胞悬液，得脐带间充质原代干细胞；
(2)将脐带间充质原代干细胞以2×100/cm2的密度接种至含10％FBS的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2的饱和湿度下培养，每隔20min换液一次并去除未贴壁细胞；待细胞融合率达到80％～90％时，消化细胞进行传代培养；等扩增到所需数量时，离心去除细胞以及碎片等，收集上清，采用0.22μm无菌滤膜过滤至超滤离心管中浓缩，将浓缩液移至添加有质量浓度为300g/L蔗糖的超速离心管中离心，PBS缓冲液重悬沉淀，即得间充质干细胞外泌体，分装后在-80℃保存备用。
上述组合物的制备方法包括以下步骤：
1、准确称量配方中的各组分，将烟酰胺、羟乙基纤维素和神经酰胺-2加入到水中，混合后加热到30-35℃至溶解均匀，得到混合物A；
2、待冷却后，往混合物A中依次加入剩余的组分，每加入一个组分后，要搅拌均匀后再加入下一个组分，降温至常温后出料，得到实施例1的组合物。
实施例2：
脐带间充质干细胞外泌体：0.02％；
花青素：0.5％；白藜芦醇：0.5％；维生素E：0.5％；类胡萝卜素：0.5％；
积雪草提取物：1.5％；马齿苋提取物：1.5％；
海蒿子多糖：0.6％；裙带菜多糖：0.6％；马尾藻多糖：0.6％；
透明质酸钠：2.0％；甘油：2.5％；甘氨：2.0％；精氨酸：2.5％；
烟酰胺：0.3％；羟乙基纤维素：0.3％；神经酰胺-2：0.2％；
去离子水：余量。
脐带间充质干细胞外泌体以及组合物的制备方法与实施例1相同。
实施例3：
脐带间充质干细胞外泌体：0.3％；
花青素：0.8％；白藜芦醇：0.5％；维生素E：0.8％；类胡萝卜素：0.5％；
积雪草提取物：1.5％；马齿苋提取物：1.5％；
海蒿子多糖：0.5％；裙带菜多糖：0.8％；马尾藻多糖：0.7％；
透明质酸钠：2.5％；甘油：2.5％；甘氨：2.5％；精氨酸：2.5％；
烟酰胺：0.4％；羟乙基纤维素：0.4％；神经酰胺-2：0.4％；
去离子水：余量。
脐带间充质干细胞外泌体以及组合物的制备方法与实施例1相同。
实施例4：
脐带间充质干细胞外泌体：0.6％；
花青素：0.8％；白藜芦醇：0.5％；维生素E：0.8％；类胡萝卜素：0.5％；
积雪草提取物：2.0％；马齿苋提取物：2.0％；
海蒿子多糖：0.8％；裙带菜多糖：0.5％；马尾藻多糖：0.7％；
透明质酸钠：2.5％；甘油：2.5％；甘氨：2.5％；精氨酸：2.5％；
烟酰胺：0.6％；羟乙基纤维素：0.8％；神经酰胺-2：0.5％；
去离子水：余量。
脐带间充质干细胞外泌体以及组合物的制备方法与实施例1相同。
对比例1-3：
对比例1不添加脐带间充质干细胞外泌体，其它成分和制备方法与实施例4相同。
对比例2不添加烟酰胺，其它成分和制备方法与实施例4相同。
对比例3不添加神经酰胺-2，其它成分和制备方法与实施例4相同。
效果测试：
试验方法：筛选140例皮肤出现老化的女性志愿者，年龄35～50岁，平均年龄40岁。
选取标准：脸部皮肤干燥，皮肤弹性降低，出现皱纹、色素沉着等皮肤老化现象；在试验期间尽量避免日晒。且在试验期间不使用其他抗衰老产品。
将所有志愿者随机分为7组，每组20例，每组志愿者使用对应的组合物，所有志愿者均能够按规范使用产品，在试验过程中只使用指定的组合物，并配合工作人员按要求完成评价工作，具有一定表述能力，能真实反应使用后的感受。
使用方法：早、晚洁面后取适量的组合物涂抹在面部。
所有志愿者连续使用60天，并采用皮肤弹性测量仪采集使用后各志愿者的皮肤数据；包括使用前后的皮肤弹性、脸部皱纹、色素以及皮肤水分的改善情况。
测试结果如表1所示。
根据表1的测试数据可得，实施例1的组合物，在未添加有雪草提取物和马齿苋提取物时，其对皮肤弹性、脸部皱纹、色素以及皮肤水分的改善均有显著程度的提升；实施例2-4的组合物，进一步添加有积雪草提取物和马齿苋提取物时，与实施例1相比，其对皮肤弹性、脸部皱纹、色素以及皮肤水分的改善均有进一步地地提升，由此可知，在实施例1的基础上添加有积雪草提取物和马齿苋提取物，能大大提升组合物对皮肤修复的功效。对比例1的组合物，在不添加脐带间充质干细胞外泌体时，与实施例4的组合物相比，其对皮肤弹性、脸部皱纹、色素以及皮肤水分的改善均显著下降，由此可得，本申请的方案中，脐带间充质干细胞外泌体作为主要功效成分，可加速皮肤细胞的新陈代谢，恢复基底细胞抗氧化及再生能力，防止皮肤老化，增加皮肤弹性和饱满度，缩小毛孔，提升光泽。
对比例2-3的组合物，在缺少烟酰胺和神经酰胺-2时，其与实施例4的组合物相比，其对皮肤弹性、脸部皱纹、色素以及皮肤水分的改善也大大下降，由此可得，本申请的组合物，是多种组分协调作用的结构，并不是组分间的添加和替换。
综上所述，本申请的组合物，在添加有脐带间充质干细胞外泌体的基础上，配合保湿剂、抗氧化剂及海藻多糖，可加速皮肤细胞的新陈代谢，恢复基底细胞抗氧化及再生能力，防止皮肤老化，增加皮肤弹性和饱满度，缩小毛孔，提升光泽。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种含脐带间充质干细胞外泌体的组合物，其特征在于，按质量百分比计，包括以下组分：
脐带间充质干细胞外泌体：0.02-0.6％；
抗氧化剂：2.5-5.0％；
海藻多糖：1.5-2.5％；
保湿剂：5.6-12.5％；
烟酰胺：0.05-0.6％；
羟乙基纤维素：0.2-0.8％；
神经酰胺-2：0.1-0.5％；
去离子水：余量。
2.根据权利要求1所述的含脐带间充质干细胞外泌体的组合物，还包括积雪草提取物和马齿苋提取物；所述积雪草提取物与马齿苋提取物的质量比为1:1。
3.根据权利要求1所述的含脐带间充质干细胞外泌体的组合物，其特征在于，所述抗氧化剂为花青素、白藜芦醇、维生素C、维生素E、类胡萝卜素中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的含脐带间充质干细胞外泌体的组合物，其特征在于，所述保湿剂为透明质酸钠、甘油、甘氨和精氨酸中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的含脐带间充质干细胞外泌体的组合物，其特征在于，所述保湿剂为明质酸钠、甘油、甘氨和精氨酸的组合物。
6.根据权利要求1所述的含脐带间充质干细胞外泌体的组合物，其特征在于，所述海藻多糖为海蒿子多糖、裙带菜多糖、马尾藻多糖、珍珠菜多糖、石花菜多糖中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的含脐带间充质干细胞外泌体的组合物，其特征在于，所述脐带间充质干细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)、取新鲜脐带，在无菌条件下，将脐带剪成小段，用PBS缓冲液反复冲洗3次，去除动静脉获得沃顿胶，将沃顿胶剪碎得并加入胶原酶消化液进行消化；将消化好的悬液混匀后，用PBS稀释至不粘稠，并用细胞过滤器进行过滤，收集滤液，将滤液置于1100r/min条件下离心10min，弃去上清液得到细胞沉淀；用平衡盐缓冲液洗涤细胞沉淀3次，再用2倍体积的平衡盐缓冲液重悬细胞，利用密度梯度离心法纯化细胞悬液，得脐带间充质原代干细胞；
(2)将脐带间充质原代干细胞以2×100/cm2的密度接种至含10％FBS的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2的饱和湿度下培养，每隔20min换液一次并去除未贴壁细胞；待细胞融合率达到80％～90％时，消化细胞进行传代培养；等扩增到所需数量时，离心去除细胞以及碎片等，收集上清，采用0.22μm无菌滤膜过滤至超滤离心管中浓缩，将浓缩液移至添加有质量浓度为300g/L蔗糖的超速离心管中离心，PBS缓冲液重悬沉淀，即得间充质干细胞外泌体，分装后在-80℃保存备用。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的含脐带间充质干细胞外泌体的组合物在制备皮肤修复化妆品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述皮肤修复化妆品包括精华液、面膜和冻干粉。
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