CN113249312A - 人脐血间充质干细胞外泌体在皮肤修复中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了人脐血间充质干细胞外泌体在皮肤修复中的应用，人脐血间充质干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：(1)将胎盘分离出绒毛膜，洗去除红细胞，将绒毛膜剪成组织块，加入胶原酶消化液进行消化；(2)将消化后的组织块进行过滤得一次滤液，剩余组织加入用胰蛋白酶进行消化后，过滤得二次滤液，将一次滤液与二次滤液混合，然后离心，弃去上清，收集离心获得的细胞。本发明所述的人脐血间充质干细胞外泌体可提高皮肤的修复功能，人脐血间充质干细胞外泌体与玉郎伞提取物的结合可进一步促进皮肤的创面修复，贻贝粘蛋白将玉郎伞提取物与外泌体紧密的粘合起来，提高玉郎伞提取物与外泌体的作用效率，同时提高修复效果。

Description

人脐血间充质干细胞外泌体在皮肤修复中的应用
技术领域
本发明属于生物领域，尤其是涉及人脐血间充质干细胞外泌体在皮肤修复中的应用。
背景技术
间充质干细胞能促进组织修复和再生，改善创面愈合，一度是当下的热门研究领域之一。近期研究发现，间充质干细胞的疗效主要来源于其旁分泌的产物-外泌体(exosomes，EXOs)。间充质干细胞来源的外泌体能够避免干细胞治疗过程中的免疫原性、致瘤性、阻塞血管管腔等风险，且具有性质稳定，剂量和浓度易控制，具有生物归巢作用，易于储存等优势，成为近年研究的热点方向。外泌体是一种直径30-100nm的膜性脂质小囊泡，除了富含蛋白质、mRNA及miRNA外，还含有大量细胞因子、趋化因子、金属蛋白酶和磷脂酰丝氨酸等。其中间充质干细胞所分泌的外泌体包含的蛋白或RNA成分与受损细胞进行信息交流，可对靶细胞进行生物学功能调控，有效地修复如心肌缺血再灌注损伤、肝纤维化、急性肾损伤以及调节皮肤创面的愈合等。特别在调节皮肤创面愈合方面，间充质干细胞外泌体对皮肤成纤维细胞的调控功能具有促进伤口愈合与抑制瘢痕形成的双向调节作用。即在伤口愈合的早期通过促进胶原的合成来提高修复速度，晚期则减少胶原的合成而抑制瘢痕组织的形成，提升修复效果。
因此，针对目前已有技术的缺陷，需要进一步改良现有用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的生物材料制备体系。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出人脐血间充质干细胞外泌体在皮肤修复中的应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
人脐血间充质干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将胎盘分离出绒毛膜，洗去除红细胞，将绒毛膜剪成组织块，加入胶原酶消化液进行消化；
(2)将消化后的组织块进行过滤得一次滤液，剩余组织加入用胰蛋白酶进行消化后，过滤得二次滤液，将一次滤液与二次滤液混合，然后离心，弃去上清，收集离心获得的细胞；
(3)将所述的细胞置于培养皿中，当细胞融合达60-90％，清洗细胞，更换无外泌体血清的培养基，继续培养，收集细胞上清，离心去除细胞与细胞碎片，提取得到外泌体。
一种人脐血间充质干细胞外泌体，由所述的制备方法制得。
一种人脐血间充质干细胞外泌体在皮肤修复中的应用。
一种皮肤修复组合物，所述的组合物由包括如下重量份的原料制成：
人脐血间充质干细胞外泌体 0.01-1份，
玉郎伞提取物 1-10份，
贻贝粘蛋白 0.1-5份。
优选的，所述的组合物由包括如下重量份的原料制成：
人脐血间充质干细胞外泌体 0.05-0.2份，
玉郎伞提取物 3-10份，
贻贝粘蛋白 0.1-2份。
优选的，所述的组合物由包括如下重量份的原料制成：
人脐血间充质干细胞外泌体 0.05-0.1份，
玉郎伞提取物 3-8份，
贻贝粘蛋白 0.5-1份。
所述的皮肤修复组合物的制备方法，包括如下步骤：将玉郎伞提取物与贻贝粘蛋白混合均匀，得到预混料，将预混料在超声的条件下加入人脐血间充质干细胞外泌体混合均匀后即成。
进一步，所述的超声步骤的温度为35-55℃。
进一步，所述的玉郎伞提取物由包括如下步骤的方法制成：将玉郎伞洗净、干燥、粉碎后在蒸馏水中浸泡2-5小时，然后取出加入至10-30倍量的水中浸提1-3次，每次浸提1-5小时，混合浸提液后浓缩即得。
进一步，所述的玉郎伞提取物与玉郎伞的质量比为1：10-500。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的人脐血间充质干细胞外泌体可提高皮肤的修复功能，人脐血间充质干细胞外泌体与玉郎伞提取物的结合可进一步促进皮肤的创面修复，提高皮肤成纤维细胞的增殖、迁移能力，使创面加速愈合；贻贝粘蛋白将玉郎伞提取物与外泌体紧密的粘合起来，提高玉郎伞提取物与外泌体的作用效率，同时提高修复效果。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1人脐血间充质干细胞外泌体的制备
将胎盘分离出绒毛膜，洗去除红细胞，将绒毛膜剪成10-50mm2的组织块，加入胶原酶消化液进行消化；
将消化后的组织块进行过滤得一次滤液，剩余组织加入用胰蛋白酶进行消化后，过滤得二次滤液，将一次滤液与二次滤液混合，然后离心，弃去上清，收集离心2小时后获得的细胞，传代培养；
将第5代细胞置于培养皿的中，当细胞融合达70-80％，清洗细胞，更换无外泌体血清的培养基，继续培养培养48-72h后，收集细胞上清，离心后去除细胞或者细胞碎片。使用Norgen Biotek品牌的Plasma/Serum Exosome Purification迷你试剂盒，分离提取间充质干细胞外泌体。
实施例2皮肤修复组合物的制备
称取500g玉郎伞洗净、干燥、粉碎后在蒸馏水中浸泡3小时，然后取出加入至20倍量的水中浸提3次，每次浸提2小时，混合浸提液后浓缩得到5g玉郎伞提取物。
称取4mg玉郎伞提取物与0.8mg贻贝粘蛋白混合均匀，得到预混料，将预混料在40℃超声的条件下加入50μg人脐血间充质干细胞外泌体混合均匀后得到组合物A。
称取1mg玉郎伞提取物与5mg贻贝粘蛋白混合均匀，得到预混料，将预混料在40℃超声的条件下加入50μg人脐血间充质干细胞外泌体混合均匀后得到组合物B。
称取4mg玉郎伞提取物与0.8mg贻贝粘蛋白混合均匀，得到预混料，将预混料在40℃超声的条件下加入1000μg人脐血间充质干细胞外泌体混合均匀后得到组合物C。
称取0.2mg玉郎伞提取物与0.8mg贻贝粘蛋白混合均匀，得到预混料，将预混料在40℃超声的条件下加入50μg人脐血间充质干细胞外泌体混合均匀后得到组合物D。
称取4mg玉郎伞提取物在40℃超声的条件下加入50μg人脐血间充质干细胞外泌体混合均匀后得到组合物E。
称取50μg人脐血间充质干细胞外泌体作为组合物F。
各皮肤修复组合物的具体配比如表1所示。
表1各组合物的成分配比
Figure BDA0003043483530000061
实施例3小鼠模型
I型糖尿病足溃疡大鼠模型的制备方法如下：取140只150-200g的大鼠，适应性喂养7天，大鼠按照60mg/kg空腹腹腔注射STZ溶液，缓冲液制备：称取2.1g柠檬酸加入双蒸水100mL充分溶解中配成A液；称取2.94g柠檬酸钠加入双蒸水100mL充分溶解中配成B液；将A、B液按比例混合(1：1.32)，pH计测定并调节pH＝4.2-4.5，用0.22μm滤膜过滤除杂后制得STZ的柠檬酸缓冲液，使用得到的柠檬酸缓冲液溶解STZ，其终浓度为10mg/mL，正常对照组空腹腹腔注射等量的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，1周后测外周空腹血糖≥16.7mmol/L，即为大鼠糖尿病造模成功。在糖尿病大鼠的双后足背部做3mm×6mm的全层矩形皮肤缺损，视为足部溃疡造模成功，并记为第0天。
将大鼠随机均为7组：模型组、组合物A组、组合物B组、组合物C组、组合物D组、组合物E组、组合物F组，给组合物A组-组合物F组的大鼠涂抹对应的组合物，每日涂抹2次，模型组每日涂抹碘伏一次。实验期间，各组大鼠予普通饲料喂养，自由饮水，组间各因素无差异。分别在第1日、第2日、第7日计算大鼠的创面愈合率，结果如表2所示。
创面愈合率(％)＝(原始创面面积-当前测量面积)/原始创面面积*100％
表2大鼠创面愈合率
Figure BDA0003043483530000071
由表2可知，与模型组相比，单独使用人脐血间充质干细胞外泌体对创面的修复有一定的促进效果，人脐血间充质干细胞外泌体与玉郎伞提取物结合能起到更好的修复效果，而人脐血间充质干细胞外泌体与玉郎伞提取物通过贻贝粘蛋白的粘合后可进一步促进皮肤的创面修复，提高皮肤成纤维细胞的增殖、迁移能力，使创面加速愈合，而没有贻贝粘蛋白的加入，会使组合物的修复效果降低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.人脐血间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将胎盘分离出绒毛膜，洗去除红细胞，将绒毛膜剪成组织块，加入胶原酶消化液进行消化；
(2)将消化后的组织块进行过滤得一次滤液，剩余组织加入用胰蛋白酶进行消化后，过滤得二次滤液，将一次滤液与二次滤液混合，然后离心，弃去上清，收集离心获得的细胞；
(3)将所述的细胞置于培养皿中，当细胞融合达60-90％，清洗细胞，更换无外泌体血清的培养基，继续培养，收集细胞上清，离心去除细胞与细胞碎片，提取得到外泌体。
2.一种人脐血间充质干细胞外泌体，其特征在于：由权利要求1所述的制备方法制得。
3.一种人脐血间充质干细胞外泌体在皮肤修复中的应用。
4.一种皮肤修复组合物，其特征在于：所述的组合物由包括如下重量份的原料制成：
人脐血间充质干细胞外泌体 0.01-1份，
玉郎伞提取物 1-10份，
贻贝粘蛋白 0.1-5份。
5.根据权利要求4所述的皮肤修复组合物，其特征在于：所述的组合物由包括如下重量份的原料制成：
人脐血间充质干细胞外泌体 0.05-0.2份，
玉郎伞提取物 3-10份，
贻贝粘蛋白 0.1-2份。
6.根据权利要求5所述的皮肤修复组合物，其特征在于：所述的组合物由包括如下重量份的原料制成：
人脐血间充质干细胞外泌体 0.05-0.1份，
玉郎伞提取物 3-8份，
贻贝粘蛋白 0.5-1份。
7.权利要求4-6中任一项所述的皮肤修复组合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：将玉郎伞提取物与贻贝粘蛋白混合均匀，得到预混料，将预混料在超声的条件下加入人脐血间充质干细胞外泌体混合均匀后即成。
8.根据权利要求7所述的皮肤修复组合物的制备方法，其特征在于：所述的超声步骤的温度为35-55℃。
9.根据权利要求7所述的皮肤修复组合物的制备方法，其特征在于：所述的玉郎伞提取物由包括如下步骤的方法制成：将玉郎伞洗净、干燥、粉碎后在蒸馏水中浸泡2-5小时，然后取出加入至10-30倍量的水中浸提1-3次，每次浸提1-5小时，混合浸提液后浓缩即得。
10.根据权利要求9所述的皮肤修复组合物的制备方法，其特征在于：所述的玉郎伞提取物与玉郎伞的质量比为1：10-500。
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