CN108210441A - 一种用于美容保养的干细胞深层修复精华液 - Google Patents

Abstract

本发明涉及老化及损伤皮肤修复技术领域，尤其是一种含有丰富干细胞因子的肌肤深层修复精华液，所述肌肤深层修复精华液是在无血清培养基中培养脂肪间充质干细胞分离纯化浓缩而来，可以有效修复老化及损伤皮肤。

Description

一种用于美容保养的干细胞深层修复精华液

技术领域

本发明涉及老化及损伤皮肤修复技术领域，尤其是一种含有丰富干细胞因子的肌肤深层修复精华液。

背景技术

皮肤由于其特殊性，易遭受外界环境的影响而出现老化及损伤。随着生活质量及生活水平的提高，对于肌肤的保养也日益受到人们的关切和重视。由于目前化妆品市场中多数品种都含有铅、汞、酒精、防腐剂、激素及香料等有害物质，虽然短期内能够去除老化皮肤、使皮肤光亮嫩滑，但是长期使用容易使皮肤产生深层次及不可逆性损伤，严重的甚至产生过敏等症状。同时，残留时间过长的问题将导致对皮肤产生长期不利的影响。

本发明是采用生物技术手段，从干细胞培养液中精提各类生物活性成分，与羟基苯甲酸乙酯、维生素E、柠檬酸、透明质酸钠、及各类生物活性成分按照一定比例制成一种用于美容保养的干细胞深层修复精华液，在保持较好的生物活性的同时，具备较好的生物安全性，具有一定的推广及市场应用潜力。

发明内容

发明所需解决的问题

解决现有纯化精提技术不足及生物活性维持不足的问题，提供一种用于美容保养的干细胞深层修复精华液，同时通过合理的搭配，满足化妆品使用需求，达到优良的使用效果。

用于解决课题的方法

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

采用超声破碎、超滤及低温旋蒸技术，纯化到化妆品级使用要求，保持原有的生物活性；

一种用于美容保养的干细胞深层修复精华液，由以下含量的成分构成：

人源化干细胞活性成分提取液包含胶原蛋白(2～5mg/L)、抗炎因子(1～1.5mg/L)、转化生长因子(2～3mg/L)、白介素(1～1.5mg/L)、粒细胞集落刺激因子(2～5mg/L)、干细胞因子(3～4.5mg/L)、内皮细胞生长因子(2～5mg/L)、成纤维细胞生长因子(2～5mg/L)、表皮细胞生长因子(2～5mg/L)等。

本发明为了实现对人源化干细胞活性成分提取液的生产制备，采用的技术方案操作如下：

1)获取脂肪组织细胞：用含有青链霉素的磷酸盐缓冲液反复冲洗新鲜的脂肪组织3-5次，将脂肪组织剪成小块，将剪碎的块状组织均匀平铺在培养瓶中，37℃二氧化碳培养箱内静置贴壁4-6h，待组织块完全贴壁后，将含有青链霉素的无血清干细胞培养基加入到培养瓶内，然后继续培养；

2)脂肪组织细胞原代培养：待1)中脂肪组织块爬出细胞后，将组织块取出，用含有青链霉素的磷酸盐缓冲液冲洗贴壁细胞2-3次，倒掉缓冲液，加入适量胰酶，待细胞边缘微微翘起时，终止消化，取细胞，1500rpm离心，得细胞沉淀；用磷酸盐缓冲液二次重悬，再次1500rpm离心，得细胞沉淀；用含有青链霉素的无血清干细胞培养基重悬细胞，将细胞转移至新的培养瓶内，继续培养；

3)脂肪组织细胞传代：用胰酶消化原代培养的脂肪组织细胞，在细胞边缘微微翘起时，终止消化，取细胞，1500rpm离心，得细胞沉淀；用磷酸盐缓冲液二次重悬，再次1500rpm离心，得到细胞沉淀；用含有青链霉素的无血清干细胞培养基重悬细胞，将细胞按照1：3比例进行传代培养；

4)收集干细胞培养液及干细胞：将传代3-5代的细胞离心收集上清液，并分离获取相应的干细胞；

5)超声破碎干细胞：将分离获取的干细胞进行低频超声破碎，频率调节到保证破碎细胞的同时，对于活性蛋白损伤降低到近似于零；

6)超滤提取人源化干细胞活性成分物质：将4)中收集的干细胞培养液进行超滤分离，得到纯度相对较高的有效细胞因子；将5)干细胞破碎物溶液也进行超滤分离，得到纯度相对较高的有效细胞因子；(这样做的目的是保证有效细胞因子提取的最大化)

7)低温旋蒸二次纯化：将6)中收集的两份有效细胞因子，采用不高于37℃的低温旋蒸工艺，在两次旋蒸后，得到适用于化妆品级且纯度较高的人源化干细胞活性成分提取液。

本发明除了上述方法外，为了高效获取脂肪组织原代细胞，较佳的技术方案还有，1)中将脂肪组织剪成近似1mm³的小块，便于快速贴壁和生长；

本发明为了保证脂肪组织原代培养能够高效/快捷，较佳的技术方案还有，2)中实验所需的培养环境调整为37℃且含有5％CO₂的细胞培养箱中培养；

本发明为了保证消化传代过程中对细胞损伤降至最低，较佳的技术方案还有，3)中实验所需的胰酶浓度是0.25％，并且含有0.05％的EDTA，酶消化时间控制在3分钟内，已贴壁细胞边缘翘起为限，及时用培养基终止消化，使细胞因胰酶造成的损伤降到最低；

本发明为了提高获取生物活性物质的产量，较佳的技术方案还有，5)中实验所需的超低频超声破碎细胞，其频率控制在20～25KHz，工作时间定为5min，间隙时间定为30s，超声时间单次30s，温度设为4℃；

本发明为了提高获取生物活性物质的纯度，较佳的技术方案还有，6)中实验所需的利用超滤的方式从培养基中提取有效成分，去除不合适的杂质和颗粒；超滤膜孔选择蛋白分子量大小的5－10倍；蛋白截留选择蛋白分子量的1/3-1/5；

本发明为了提高获取生物活性物质的浓度,较佳的技术方案还有，7)中实验所需的利用低温旋蒸二次纯化的方式从超滤后的培养基中浓缩生物活性物质，其低温控制在37℃±1～2℃，收集旋蒸浓缩液。

本发明除以上较佳技术方案外，还进一步优选精华液底层配料浓度，包括羟基苯甲酸乙酯、维生素E、柠檬酸、透明质酸钠，其浓度进一步优选为0.6-0.8％、0.6-0.8％、0.2-0.3％、0.2-0.3％，混合均匀。

本发明与其他技术比较，具有如下优点：针对细胞生长所需的营养要求，模拟细胞快速增殖的需要，按照符合人体细胞生长的合理环境，可以达到快速修复受损及老化皮肤，恢复皮肤原有的质量和光泽，改善人们的生活质量。

本发明除可以用于美容保养领域之外，还适用于整形、创伤修复等，具有巨大的市场价值和社会效益，针对改善生活质量，提高人们的健康指数发挥重要作用。

本发明所涉及的生产流程相对简单，具备大规模生产的条件和要求。

具体实施方式

下列实施例将进一步说明本发明。

实施例1

本发明采用技术方案为：一种用于美容保养的干细胞深层修复精华液，该干细胞深层修复精华液含有羟基苯甲酸乙酯、维生素E、柠檬酸、透明质酸钠、人源化干细胞活性成分提取液；为了实现对人源化干细胞活性成分提取液的生产制备，主要采用获取脂肪组织细胞、脂肪组织细胞原代培养、脂肪组织细胞传代、收集干细胞培养液及干细胞、超声破碎干细胞、超滤提取人源化干细胞活性成分物质、低温旋蒸二次纯化等。

实施例2

在实施例1的基础上，该干细胞深层修复精华液中含有70％医用甘油、0.5～1％羟基苯甲酸乙酯、0.5～1％维生素E、0.2～0.5％柠檬酸、0.2～0.5％透明质酸钠、及不低于200mg/L人源化干细胞活性成分提取液。本发明为了提高干细胞活性成分的护肤效果，较佳的实验方案还有添加了2mg/L胶原蛋白、1mg/L抗炎因子、2mg/L转化生长因子、1mg/L白介素(IL)、2mg/L粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、3mg/L干细胞因子(SCF)、2mg/L内皮细胞生长因子(VEGF)、2mg/L成纤维细胞生长因子(FGF)、2mg/L表皮细胞生长因子(EGF)等。

实施例3

在实施例1的基础上，本发明为了提高干细胞活性成分的深层修复作用，较佳的实验方案还有，添加了3.15mg/L的Ⅱ型胶原蛋白、1.35mg/L的抗炎因子、3mg/L的转化生长因子、1.4mg/L的白介素(IL)、2.58mg/L的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、3.12mg/L的干细胞因子(SCF)、4.25mg/L的内皮细胞生长因子(VEGF)、4.67mg/L的成纤维细胞生长因子(FGF)、4.89mg/L的表皮细胞生长因子(EGF)等。

实施例4

在实施例1的基础上，本发明为了实现对人源化干细胞活性成分提取的生产制备，其中较佳的实施方式还有，制备用于美容保养的干细胞深层修复精华液的方法的操作步骤为：

1)获取脂肪组织干细胞：用含有青链霉素的磷酸盐缓冲液反复冲洗新鲜的脂肪组织3-5次，将脂肪组织转移至2mL Eppendorf管中，然后用剪刀将管中的脂肪组织剪碎，然后加入1mL1％的Ⅰ型胶原酶，继续用剪刀剪碎组织，待无法进一步剪碎为止，盖上盖子放入漩涡震荡器中充分震荡2min，然后放入37℃二氧化碳培养箱中孵育30min，期间每隔10分钟拿出来漩涡震荡2min。待孵育结束后，用0.45um的过滤器过滤细胞，将滤得的细胞液转移至新的Eppendorf管内，加入等体积1x PBS，反复吹打混匀，1200rpm离心3min，离心结束后将上清液倒掉，加入1ml干细胞无血清培养基至管内，充分混匀，将其转移至25cm2细胞培养瓶内，添加5-8ml新鲜干细胞无血清培养基充分混匀后，放入37℃二氧化碳培养箱中静置培养。

2)脂肪组织细胞原代培养：1)中静置培养第二天，将旧的培养基倒掉，加入等体积新的培养，然后每隔2-3d换一次液，待1)脂肪细胞铺满瓶底80-90％时，倒掉上清培养基，用等体积1x PBS冲洗瓶内细胞(不可直接剧烈冲洗细胞，防止细胞破碎)1-2次，用0.25％胰酶消化细胞1min，待细胞边缘微微翘起时，终止消化，用吸管反复吹打细胞，待细胞彻底悬浮后，将其转入15ml离心管内，1500rpm离心3min，离心结束后，倒掉上清液，加入新的培养基，吹打混匀细胞，将混匀后的细胞悬液转移至75cm2培养瓶中，继续37℃二氧化碳培养箱静置培养。

其他部分与实施例1完全相同。

最终说明：，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种用于美容保养的干细胞深层修复精华液，其特征在于该修复液中包含人源化干细胞活性成分提取液，所述提取液是从体外培养的干细胞中提取所得。

2.根据权利要求1所述的一种用于美容保养的干细胞深层修复精华液，其特征在于所述的修复液中还含有0.5～1％精华液质量的对羟基苯甲酸乙酯。

3.根据权利要求1所述的一种用于美容保养的干细胞深层修复精华液，其特征在于所述的修复液中还含有0.5％～1％精华液质量的维生素E。

4.根据权利要求1所述的一种用于美容保养的干细胞深层修复精华液，其特征在于所述的修复液中还含有0.2％～0.5％精华液质量的柠檬酸。

5.根据权利要求1所述的一种用于美容保养的干细胞深层修复精华液，其特征在于所述的修复液中还含有0.2％～0.5％精华液质量的透明质酸钠。

6.根据权利要求1所述的一种用于美容保养的干细胞深层修复精华液，其特征在于所述的人源干细胞活性成分提取液中还含有胶原蛋白、抗炎因子、转化生长因子、白介素(IL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干细胞因子(SCF)、内皮细胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮细胞生长因子(EGF)。

7.根据权利要求1所述的一种用于美容保养的干细胞深层修复精华液，其特征在于所述的体外培养的干细胞来自于脂肪组织。