CN110604704A - 一种肽类组合物化妆品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种肽类组合物化妆品，包括0.5~50份酵母肽、0.01~20份寡肽‑1、0.01~20份寡肽‑3、0.01~10份血清白蛋白、1~10份海藻糖以及0~100份纯水。通过各组分的联合使用，增强各组分的功效，达到更好的修复皮肤创伤、淡化疤痕和抑制疤痕的形成，以及有效促进皮肤生长、达到减少细纹和抗衰老的作用。本发明肽类组合物化妆品的制备方法，简便易行，并且实现各组分纯度高，活性好，稳定性好，安全性高，用于制备得到的肽类组合物化妆品安全有效。

Description

一种肽类组合物化妆品及其制备方法

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种肽类组合物化妆品及其制备方法。

背景技术

皮肤覆盖全身，是人体最大的器官，它使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭。在日常生活中，皮肤自身容易受到外部和内部因素的影响，形成皮肤创伤或者皮肤衰老等问题。

近几年随着中国经济的快速增长，我国化妆品消费也迅速崛起，消费者越来越愿意使用化妆品维护自己的皮肤健康，保持一个良好皮肤状态，但是很多化妆品为了达到短期的效果，使用抗生素、激素和抗氧化剂类物质以及一些长期使用对皮肤有害的物质，不但不能修复皮肤的损伤，反而对皮肤造成了更大伤害，造成许多皮肤后遗症。

因此，有必要提供一种化妆品，可以安全有效的修复皮肤创伤、淡化疤痕和抑制疤痕的形成，以及有效促进皮肤生长、达到减少细纹和抗衰老的作用。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够安全有效的修复皮肤创伤、淡化疤痕和抑制疤痕的形成，以及促进皮肤生长、减少细纹和抗衰老的肽类组合物化妆品，以及提供一种肽类组合物化妆品的制备方法。

一种肽类组合物化妆品，包括包括0.5~50份酵母肽、0.01~20份寡肽-1、0.01~20份寡肽-3、0.01~10份血清白蛋白、1~10份海藻糖以及0~100份纯水。

一种制备方法，用于制备肽类组合物化妆品，包括以下步骤：

S1，培养酿酒酵母，得到合适的酵母肽，选取0.5~50份酵母肽待用；

S2，按照寡肽-1和寡肽-3的氨基酸序列，通过固相合成寡肽-1和寡肽-3，然后进行检测，得到符合纯度和效果要求的寡肽-1和寡肽-3，选取0.01~20份寡肽-1和0.01~20份寡肽-3待用；

S3，在无菌条件下，将S1得到的0.5~50份酵母肽、1~10份海藻糖和0~100份纯水混合搅拌均匀，待到充分溶解后，加入S2得到的寡肽-1和寡肽-3，再加入0.01~10份血清白蛋白，充分混合均匀；

S4，在层流超净工作台中经0.22μm滤膜除菌过滤，无菌分装；

S5，分装好的产品放置于-18℃~-30℃冻存。

在其中一个实施例中，所述S1中得到合适的酵母肽的方法，包括以下步骤：

S11，将酿酒酵母接种到YM培养基中，150rpm~170rpm，25 ºC ~30 ºC培养3d~4d，4200rpm~4800rpm离心收集菌体；

S12，菌体按照1:10（m/v）重悬于纯水中，高压均质破碎菌体，高压均质压力580 bar ~650bar，9800rpm~11000rpm，3ºC~4ºC离心收集离心上清液；

S13，在S12的离心上清液中加入2%~3%（w/v）酵母水解酶，60 ºC ~65 ºC酶解5h~6h，酶解后沸水浴10min~20min，9800rpm~11000rpm，离心20min~30min，收集离心上清液；

S14，离心上清液经3 KD超滤，超滤后的滤液喷雾干燥，Folin-酚法测定酵母肽的含量。

在其中一个实施例中，所述S2中检测符合纯度和效果要求的寡肽-1和寡肽-3的方法为反相高效液相色谱法，包括以下步骤：

S21，选择的色谱柱为C18，流动相A为20 mM磷酸缓冲液，流动相B为乙腈；

S22，设置仪器参数，检测波长为215 nm，梯度洗脱，流速为1.0 ml/min；

S23，得到色谱图，通过保留时间及峰面积计算得到纯度>95%的寡肽-1及寡肽-3。

在其中一个实施例中，所述血清白蛋白为重组血清白蛋白。

本发明一种肽类组合物化妆品及其制备方法的有益效果为：

1. 通过各组分的联合使用，增强各组分的功效，达到更好的修复皮肤创伤、淡化疤痕和抑制疤痕的形成，以及有效促进皮肤生长、达到减少细纹和抗衰老的作用。

2. 使用的血清白蛋白是通过基因工程技术，经工程菌发酵表达，并经蛋白纯化得来重组血清白蛋白，来源稳定、结构清晰、安全性高。

3. 寡肽-1、寡肽-3通过多肽固相合成方法制备，合成的寡肽-1、寡肽-3纯度高，活性好，稳定性好，特别适用于化妆品这类复杂混合物体系。

4. 酵母肽为通过筛选合适的酿酒酵母，通过发酵后纯化而来，安全性高，并且包含多种营养成分，可以提高细胞合成胶原蛋白，起到抗衰老效果，同时能有效保护组分内寡肽成分。

5. 肽类组合物化妆品的制备方法，简便易行，并且实现各组分纯度高，活性好，稳定性好，安全性高，用于制备得到的肽类组合物化妆品安全有效。

附图说明

图1为试验1的促细胞增值活性柱状图；

图2为试验3的MMP-1蛋白表达的相对强度值柱状图；

图3为试验4的BALB/c 3T3细胞的胶原蛋白含量柱状图。

具体实施方式

说明书中的实施方式仅用于对本发明进行说明，其并不对本发明的保护范围起到限定作用。本发明的保护范围仅由权利要求限定，在本发明公开的实施方式的基础上所做的任何省略、替换或修改将落入本发明的保护范围。

参选以下的优选实施方法的详述以及包括的实施例，可更容易地理解本发明的内容，除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。

如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

本发明一种肽类组合物化妆品，包括包括0.5~50份酵母肽、0.01~20份寡肽-1、0.01~20份寡肽-3、0.01~10份血清白蛋白、1~10份海藻糖以及0~100份纯水。

酵母肽有抗衰老，加速皮肤细胞更新的功效；寡肽-1有祛除肌肤瘢痕，改善皮肤干松粗糙、无光泽、老化等问题；寡肽-3具有抗皱、祛疤和能改善肤质的作用；海藻糖具有保护活性肽的功效，加上纯水作为溶剂制备成的肽类组合物化妆品，不但具有上述各成分的功效，并且各组分联合使用时可以增强各成分的功效，对皮肤达到更好的作用。

这样，酵母肽、寡肽-1、寡肽-3和海藻糖，通过纯水作为溶剂制备得到的肽类组合物化妆品，不但可以保持原有各组分的功效，而且通过各组分联合使用，增强各组分的功效，达到更好的修复皮肤创伤、淡化疤痕和抑制疤痕的形成，以及有效促进皮肤生长、达到减少细纹和抗衰老的作用。

下面详述肽类组合物化妆品本发明的九大肽冻干粉特定成分的理化作用：

寡肽-1能高亲和力结合，抑制创伤后的急性炎症及疤痕形成过程，可以促进伤疤外部大量胶原蛋白集聚物的降解，促进皮肤正常细胞外基质生成，促进不同皮肤细胞的生长，同时是寡肽-1是一种信号肽能促进纤维细胞生成天然保湿因子。应用于化妆品时，能抑制炎症因子的分泌及疤痕的形成，祛除肌肤瘢痕，补充皮肤天然保湿因子，改善干松粗糙、无光泽、老化等不健康的皮肤状况，使皮肤更加光滑、湿润、细嫩。

寡肽-3能促进新皮肤细胞生成，减少和防止细纹、皱纹生成，增加肌肤活力和能量，提亮肤色，促进新皮肤细胞生成，淡化疤痕，促进细胞生长、细胞迁移、细胞存活和细胞外基质的表达上升。用于化妆品时，寡肽-3可达到抗皱、祛疤、祛痘的效果，能改善肤质，紧致皮肤，具有面部、眼周抗衰老护理效果。

酵母肽是由酿酒酵母发酵后经分离得到，包含皮肤细胞更新必需的各种营养成分，能够促进肌肤细胞活性，促进细胞新陈代谢，激发细胞生成胶原蛋白，以及抑制基质金属蛋白酶的活性，从而获得抗衰老，加速皮肤细胞更新的功效。

血清白蛋白是人体所需的一种重要的蛋白质，本产品所用的血清白蛋白是通过基因工程技术，并通过工程菌表达纯化所得，具有结构单一清晰，稳定性好的优点，降低人体来源的不可靠性和风险性。其用于日用化学品中，能够将脂肪酸携带至肌肤内部，构成细胞周围和细胞内所有的生物膜，因而能够促进细胞再生，促使真皮层中纤维母细胞制造弹力蛋白。

海藻糖来源于天然植物，通过发酵纯化得到，海藻糖也被誉为“生命之糖”，在极限条件下，对维持生物基本生命活动具有不可替代的作用。同时，海藻糖兼具保护活性肽的功效，避免活性肽活性损失。

以下列举一些具体实施例，但需注意，下列实施例并没有穷举所有可能的情况。并且下述实施例中所用的材料如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种肽类组合物化妆品，包括0.5份酵母肽、0.01份寡肽-1、0.01份寡肽-3、0.01份血清白蛋白、1份海藻糖以及3份纯水。

实施例2

一种肽类组合物化妆品，包括25份酵母肽、10份寡肽-1、10份寡肽-3、5份血清白蛋白、5份海藻糖以及50份纯水。

实施例3

一种肽类组合物化妆品，包括50份酵母肽、20份寡肽-1、0.01~20份寡肽-3、10份血清白蛋白、10份海藻糖以及95份纯水。

实施例4

一种肽类组合物化妆品，包括30份酵母肽、15份寡肽-1、15份寡肽-3、8份血清白蛋白、8份海藻糖以及50份纯水。

本发明一种制备方法，用于制备肽类组合物化妆品，包括以下步骤：

S1，培养酿酒酵母，得到合适的酵母肽，选取0.5~50份酵母肽待用；

S2，按照寡肽-1和寡肽-3的氨基酸序列，通过固相合成寡肽-1和寡肽-3，然后进行检测，得到符合纯度和效果要求的寡肽-1和寡肽-3，选取0.01~20份寡肽-1和0.01~20份寡肽-3待用；

S3，在无菌条件下，将S1得到的0.5~50份酵母肽、1~10份海藻糖和0~100份纯水混合搅拌均匀，待到充分溶解后，加入S2得到的寡肽-1和寡肽-3，再加入0.01~10份血清白蛋白，充分混合均匀；

S4，在层流超净工作台中经0.22μm滤膜除菌过滤，无菌分装；

S5，分装好的产品放置于-18℃~-30℃冻存。

从天然酿酒酵母菌种中，筛选得到适用于本产品的酿酒酵母，选择合适的培养基和培养条件，将筛选得到的酿酒酵母进行培养，培养足够时间后培养基中酵母数量达到一定值，终止发酵，分离微生物，将酵母进行破碎，分离，得到酵母肽，选取0.5~50份酵母肽待用，需要说明的是，具体得到酵母肽的方法下文再做详细介绍；按照已知的氨基酸序列，通过固相合成寡肽-1、寡肽-3，并进行检测，使成分纯度和效果符合要求，选取0.01~20份寡肽-1和0.01~20份寡肽-3待用需要说明的是，检测成分纯度和效果是否符合要求的方法下文再做详细介绍；上述各组分准备好后，量取0~100份预冷纯水，依次加入待用的0.5~50份酵母肽、1~10份海藻糖，待充分溶解后，搅拌均匀；然后再加入成分纯度和效果符合要求的和0.01~10份重组血清白蛋白，混合均匀，在层流超净工作台中经0.22μm滤膜除菌过滤，无菌分装，最后将分装好的产品放置于-18℃至-30℃冻存，避免微生物污染，影响产品活性。需要注意的是，以上混合和分装操作要求在无菌条件下进行。

这样，肽类组合物化妆品的制备方法，简便易行，可以实现各组分纯度高，活性好，稳定性好，安全性高，用于制备得到的肽类组合物化妆品安全有效。

S1中得到合适的酵母肽的方法，包括以下步骤：

S11，将酿酒酵母接种到YM培养基中，150rpm~170rpm，25 ºC ~30 ºC培养3d~4d，4200rpm~4800rpm离心收集菌体；

S12，菌体按照1:10（m/v）重悬于纯水中，高压均质破碎菌体，高压均质压力580 bar ~650bar，9800rpm~11000rpm，3ºC~4ºC离心收集离心上清液；

S13，在S12的离心上清液中加入2%~3%（w/v）酵母水解酶，60 ºC ~65 ºC酶解5h~6h，酶解后沸水浴10min~20min，9800rpm~11000rpm，离心20min~30min，收集离心上清液；

S14，离心上清液经3 KD超滤，超滤后的滤液喷雾干燥，Folin-酚法测定酵母肽的含量。

酿酒酵母接种到YM培养基中，置于转速为 150rpm~170rpm，温度为25 ºC ~30 ºC的培养箱中培养3d~4d，经过一段时间繁殖后，置于离心管中，转速为4200rpm~4800rpm离心收集符合条件的酵母菌体；将收集得到的符合条件的酵母菌体按照1:10（m/v）重新悬浮于纯水中，再进行高压均质破碎菌体，高压均质压力为580 bar ~650bar，将得到的破碎后的酵母菌体置于离心管中，转速为9800rpm~11000rpm，温度为3ºC~4ºC离心收集离心上清液；收集离心上清液加入2%~3%（w/v）酵母水解酶，60 ºC ~65 ºC酶解5h~6h，酶解后沸水浴10min~20min后，再将酶解后的离心上清液置于离心管中，转速为9800rpm~11000rpm，离心20min~30min，继续收集离心上清液；离心上清液经3 KD超滤，超滤后的滤液喷雾干燥，Folin-酚法测定酵母肽的含量，将得到的酵母肽进行无菌保存，待用，需要注意的是制备酵母肽的过程应在无菌环境中进行。

这样，酵母氨基酸类为通过筛选合适的酿酒酵母，通过发酵后纯化而来，安全性高，并且包含多种营养成分，可以提高细胞合成胶原蛋白，起到抗衰老效果，同时能有效保护组分内寡肽成分。

S2中检测符合纯度和效果要求的寡肽-1和寡肽-3的方法为反相高效液相色谱法，包括以下步骤：

S21，选择的色谱柱为C18，流动相A为20 mM磷酸缓冲液，流动相B为乙腈；

S22，设置仪器参数，检测波长为215 nm，梯度洗脱，流速为1.0 ml/min；

S23，得到色谱图，通过保留时间及峰面积计算得到纯度>95%的寡肽-1及寡肽-3。

反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析固相合成的寡肽-1及寡肽-3的纯度，选择的色谱柱为C18，流动相A为20 mM磷酸缓冲液，流动相B为乙腈，设置检测参数为检测波长为215nm，梯度洗脱，流速为1.0 ml/min，通过保留时间及峰面积计算合成的寡肽的纯度，其合成的寡肽-1及寡肽-3的纯度>95%，符合肽类组合物化妆品对寡肽-1及寡肽-3的纯度的要求。

这样，寡肽-1、寡肽-3通过多肽固相合成方法制备，合成的寡肽-1、寡肽-3纯度高，活性好，稳定性好，特别适用于化妆品这类复杂混合物体系。

所述血清白蛋白为重组血清白蛋白。

本产品中所用血清白蛋白是通过基因工程技术，经工程菌发酵表达和经蛋白纯化得来的。

这样，通过基因工程技术重组得到的重组血清白蛋白，来源稳定、结构清晰、安全性高。

实施例4

一种制备方法，用于制备肽类组合物化妆品，包括以下步骤：

第一步，将酿酒酵母接种到YM培养基中，160rpm，28 ºC培养3d，4500rpm离心收集菌体；将收集的菌体按照1:10（m/v）重新悬浮于纯水中，高压均质破碎菌体，高压均质压力600bar， 10000rpm， 4ºC离心收集离心上清液；在离心上清液中加入2%（w/v）酵母水解酶，60 ºC酶解5h，酶解后沸水浴10min， 10000rpm，离心20min，再次收集离心上清液；将再次收集的离心上清液经3 KD超滤，超滤后的滤液喷雾干燥，Folin-酚法测定酵母肽的含量，以纯度高于95%计算，选取25份酵母肽待用；

第二步，按照寡肽-1和寡肽-3的氨基酸序列，通过固相合成寡肽-1和寡肽-3，然后使用反相高效液相色谱法检测符合纯度和效果要求的寡肽-1和寡肽-3，选择的色谱柱为C18，流动相A为20 mM磷酸缓冲液，流动相B为乙腈；设置仪器参数，检测波长为215 nm，梯度洗脱，流速为1.0 ml/min；得到色谱图，通过保留时间及峰面积计算得到纯度>95%的寡肽-1及寡肽-3，选取10份寡肽-1和10份寡肽-3待用；

第三步，通过基因工程技术，经工程菌发酵表达，并经蛋白纯化得来重组血清白蛋白，选取5份血清白蛋白待用；

第四步，在无菌条件下，将S1得到的25份酵母肽、5份海藻糖和50份纯水混合搅拌均匀，待到充分溶解后，加入待用的寡肽-1、寡肽-3和血清白蛋白，充分混合均匀；

第五步，在层流超净工作台中经0.22μm滤膜除菌过滤，无菌分装；

第六步，分装好的产品放置于-20℃冻存。

实施例5

一种制备方法，用于制备肽类组合物化妆品，包括以下步骤：

第一步，将酿酒酵母接种到YM培养基中，150rpm，25 ºC培养3d，4200rpm离心收集菌体；将收集的菌体按照1:10（m/v）重新悬浮于纯水中，高压均质破碎菌体，高压均质压力580bar， 9800rpm， 4ºC离心收集离心上清液；在离心上清液中加入2%（w/v）酵母水解酶，60 ºC酶解5h，酶解后沸水浴10min， 9800rpm，离心20min，再次收集离心上清液；将再次收集的离心上清液经3 KD超滤，超滤后的滤液喷雾干燥，Folin-酚法测定酵母肽的含量，以纯度高于95%计算，选取35份酵母肽待用；

第二步，按照寡肽-1和寡肽-3的氨基酸序列，通过固相合成寡肽-1和寡肽-3，然后使用反相高效液相色谱法检测符合纯度和效果要求的寡肽-1和寡肽-3，选择的色谱柱为C18，流动相A为20 mM磷酸缓冲液，流动相B为乙腈；设置仪器参数，检测波长为215 nm，梯度洗脱，流速为1.0 ml/min；得到色谱图，通过保留时间及峰面积计算得到纯度>95%的寡肽-1及寡肽-3，选取10份寡肽-1和10份寡肽-3待用；

第三步，通过基因工程技术，经工程菌发酵表达，并经蛋白纯化得来重组血清白蛋白，选取6份血清白蛋白待用；

第四步，在无菌条件下，将S1得到的35份酵母肽、6份海藻糖和60份纯水混合搅拌均匀，待到充分溶解后，加入待用的寡肽-1、寡肽-3和血清白蛋白，充分混合均匀；

第五步，在层流超净工作台中经0.22μm滤膜除菌过滤，无菌分装；

第六步，分装好的产品放置于-18℃冻存。

实施例6

一种制备方法，用于制备肽类组合物化妆品，包括以下步骤：

第一步，将酿酒酵母接种到YM培养基中，170rpm，30 ºC培养4d，4800rpm离心收集菌体；将收集的菌体按照1:10（m/v）重新悬浮于纯水中，高压均质破碎菌体，高压均质压力650bar， 11000rpm， 4ºC离心收集离心上清液；在离心上清液中加入2%（w/v）酵母水解酶，65 ºC酶解5h，酶解后沸水浴20min， 11000rpm，离心30min，再次收集离心上清液；将再次收集的离心上清液经3 KD超滤，超滤后的滤液喷雾干燥，Folin-酚法测定酵母肽的含量，以纯度高于95%计算，选取20份酵母肽待用；

第二步，按照寡肽-1和寡肽-3的氨基酸序列，通过固相合成寡肽-1和寡肽-3，然后使用反相高效液相色谱法检测符合纯度和效果要求的寡肽-1和寡肽-3，选择的色谱柱为C18，流动相A为20 mM磷酸缓冲液，流动相B为乙腈；设置仪器参数，检测波长为215 nm，梯度洗脱，流速为1.0 ml/min；得到色谱图，通过保留时间及峰面积计算得到纯度>95%的寡肽-1及寡肽-3，选取7份寡肽-1和7份寡肽-3待用；

第三步，通过基因工程技术，经工程菌发酵表达，并经蛋白纯化得来重组血清白蛋白，选取7份血清白蛋白待用；

第四步，在无菌条件下，将S1得到的35份酵母肽、7份海藻糖和40份纯水混合搅拌均匀，待到充分溶解后，加入待用的寡肽-1、寡肽-3和血清白蛋白，充分混合均匀；

第五步，在层流超净工作台中经0.22μm滤膜除菌过滤，无菌分装；

第六步，分装好的产品放置于-30℃冻存。

对本发明制备方法制备得到的肽类组合物化妆品进行试验，试验数据如下：

试验1

试验目的

以成纤维细胞BALB/c 3T3作为受试细胞，测定肽类组合物化妆品对BALB/c 3T3细胞的促细胞增殖活性的影响。

试验方案

分组与处理：将试验分为试验组、对比组1、对比组2、对比组3，每组设置6个稀释对照组，稀释前后的浓度分别为0.01 ng/ml、0.05 ng/ml、0.1 ng/ml、2.5 ng/ml、5 ng/ml、10ng/ml，试验组使用一定量本发明实施例4制得的肽类组合物化妆品，对比组1使用等量同浓度寡肽-1，对比组2使用等量同浓度寡肽-3，对比组3使用等量同浓度酵母肽；

实验细胞及试剂：BALB/c 3T3（小鼠胚成纤维细胞），DMEM培养基，FBS，CCK8试剂盒，寡肽-1，寡肽-3，酵母肽，本发明实施例4制得的肽类组合物化妆品；

需要进一步说明的是，实验中将标准酵母肽称之为酵母氨基酸类，将本发明肽类组合物化妆品简称为复合原液。

实验步骤

（1） BALB/c 3T3细胞接种于24个96孔中（1×10⁵~5×10⁵），37ºC，5%细胞培养箱培养24 h。

（2）换用无血清培养基继续培养12 h。

（3）将各浓度的各组试剂加入各培养基中，继续培养24~48 h。

（4）每孔加入10 µl CCK-8试剂，37ºC，5%细胞培养箱孵育2 h后取出。

（5）用酶标仪读取每个96孔细胞培养板在450 nm和630 nm的吸光值，以630 nm为参比波长，在450 nm处测定吸光度，记录测定结果。

试验结果

相对细胞增殖率统计如表1所示：

表1

促细胞增值活性如图1所示。

试验结论

相比于肽类组合物化妆品的各组分寡肽-1，寡肽-3，酵母肽，本发明肽类组合物化妆品具有突出的促进细胞再生能力，能有效地促进细胞增殖活性，促进新皮肤细胞生成，淡化疤痕；减少和防止细纹、皱纹的生成

试验2

试验目的

以成纤维细胞BALB/c 3T3作为受试细胞，测定肽类组合物化妆品对促BALB/c 3T3细胞增殖的划痕恢复的影响。

实验方案

分组与处理：将试验分为试验组、对比组1、对比组2、对比组3，每组设置3个对照组，试验组使用一定量2ug/ml本发明实施例4制得的肽类组合物化妆品，对比组1使用等量同浓度寡肽-1，对比组2使用等量同浓度寡肽-3，对比组3使用等量同浓度酵母肽；

实验细胞及试剂：BALB/c 3T3（小鼠胚成纤维细胞），DMEM培养基，寡肽-1，寡肽-3，酵母肽，本发明实施例4制得的肽类组合物化妆品。

需要进一步说明的是，实验中将标准酵母肽称之为酵母氨基酸类，将本发明肽类组合物化妆品简称为复合原液。

试验步骤

（1） BALB/c 3T3细胞接种于6孔细胞培养板中（5×105），37ºC，5%细胞培养箱培养，待细胞密度达到60%~70%。

（2）换用无血清培养基继续培养12 h。

（3）将各组试剂加入各培养基中，继续培养，于0h、12h和24h时观察细胞的生长状态，进行拍照记录并计算相对恢复面积。

试验结果

划痕相对恢复面积如表2所示：

表2

试验结论

从数据中可以得到，本发明肽类组合物化妆品相对于等量等浓度的寡肽-1，寡肽-3，酵母肽，具有突出的修复细胞损伤，淡化疤痕的作用。

试验3

试验目的

以成纤维细胞BALB/c 3T3作为受试细胞，测定肽类组合物化妆品对成纤维细胞BALB/c3T3的MMP-1蛋白表达强度的影响。

试验方案

分组与处理：将试验分为试验组、对比组1、对比组2、模型组，试验组和对比组各设置1组，模型组为2组，试验组使用一定量本发明实施例4制得的肽类组合物化妆品（含量为2%），对比组1使用等量同浓度寡肽-3（含量为2%，对比组2使用等量同浓度酵母肽（含量为2%）；模型组使用等量的无菌水；

实验细胞及试剂：BALB/c 3T3（小鼠胚成纤维细胞），DMEM培养基，寡肽-1，寡肽-3，酵母肽，无菌水，本发明实施例4制得的肽类组合物化妆品。

需要进一步说明的是，实验中将标准酵母肽称之为酵母氨基酸类，将本发明肽类组合物化妆品简称为复合原液。

试验步骤

（1）将 BALB/c 3T3细胞接种于5个6孔细胞培养板中，37ºC，5%细胞培养箱培养，待细胞密度达到80%取出；

（2）取出的其中1个模型组BALB/c 3T3细胞不经10J/cm2 UVA辐照作为空白对照，其他取出的BALB/c 3T3细胞经10J/cm2 UVA辐照；

（3）将各组试剂加入各个6孔细胞培养板中，继续培养24h；

（4）收集细胞，并提取总RNA， Q-PCR分析基质金属蛋白酶1（MMP-1）基因的表达水平。

试验结果

MMP-1蛋白表达的相对强度值图2所示。

试验结论

与空白对照组相比，经10J/cm2 UVA辐照的细胞基质金属蛋白酶 1（MMP-1）表达增加，与模型组相比，按相同添加比例（2%）添加的寡肽-3、酵母氨基酸类和肽类组合物化妆品，能使细胞的MMP-1蛋白表达相对强度值由0.735降低至0.712、0.522和0.314。因此，肽类组合物化妆品能有效抑制MMP-1的表达，并呈现复合效果显著大于单一使用的效果。

试验4

试验目的

以成纤维细胞BALB/c 3T3作为受试细胞，测定肽类组合物化妆品对成纤维细胞BALB/c3T3的胶原蛋白含量的影响。

试验方案

分组与处理：将试验分为试验组、对比组1、对比组2、对比组3和空白对照组，试验组使用一定量本发明实施例4制得的肽类组合物化妆品，对比组1使用等量同浓度寡肽-1，对比组2使用等量同浓度寡肽-3，对比组3使用等量同浓度酵母肽，空白对照组使用等量无菌水；

实验细胞及试剂：BALB/c 3T3（小鼠胚成纤维细胞），DMEM培养基，寡肽-1，寡肽-3，酵母肽，本发明实施例4制得的肽类组合物化妆品。

需要进一步说明的是，实验中将标准酵母肽称之为酵母氨基酸类，将本发明肽类组合物化妆品简称为复合原液。

试验步骤

（1） BALB/c 3T3细胞接种于5个6孔细胞培养板中，37ºC，5% 细胞培养箱培养，待细胞密度达到80%后取出；

（2）换用无血清培养基继续培养12小时；

（3）将各组试剂加入各培养基中，继续培养，继续培养24小时；

（4）收集各培养基的细胞，并提取总RNA， Q-PCR分析胶原蛋白酶3基因的表达水平。

试验结果

BALB/c 3T3细胞的胶原蛋白含量如图3所示。

试验结论

与空白对照相比，添加相同含量的寡肽-1、寡肽-3、七肽-6和肽类组合物化妆品均能明显提高细胞合成胶原蛋白的数量，其中，使用肽类组合物化妆品的细胞培养液中胶原蛋含量明显提高，且各分组间存在显著差异，差异具有统计学意义。

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种肽类组合物化妆品，包括0.5~50份酵母肽、0.01~20份寡肽-1、0.01~20份寡肽-3、0.01~10份血清白蛋白、1~10份海藻糖以及0~100份纯水。

2.一种制备方法，用于制备权利要求1所述的肽类组合物化妆品，其特征在于，包括以下步骤：

S1，培养酿酒酵母，得到酵母肽，选取0.5~50份酵母肽待用；

S2，按照寡肽-1和寡肽-3的氨基酸序列，通过固相合成寡肽-1和寡肽-3，然后进行检测，得到寡肽-1和寡肽-3，选取0.01~20份寡肽-1和0.01~20份寡肽-3待用；

S3，在无菌条件下，将S1得到的0.5~50份酵母肽、1~10份海藻糖和0~100份纯水混合搅拌均匀，待到充分溶解后，加入S2得到的寡肽-1和寡肽-3，再加入0.01~10份血清白蛋白，充分混合均匀；

S4，在层流超净工作台中经0.22μm滤膜除菌过滤，无菌分装；

S5，分装好的产品放置于-18℃~-30℃冻存。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S1中得到合适的酵母肽的方法，包括以下步骤：

S11，将酿酒酵母接种到YM培养基中，150rpm~170rpm，25 ºC ~30 ºC培养3d~4d，4200rpm~4800rpm离心收集菌体；

S12，菌体按照1:10（m/v）重悬于纯水中，高压均质破碎菌体，高压均质压力580 bar ~650bar，9800rpm~11000rpm，3ºC~4ºC离心收集离心上清液；

S13，在S12的离心上清液中加入2%~3%（w/v）酵母水解酶，60 ºC ~65 ºC酶解5h~6h，酶解后沸水浴10min~20min，9800rpm~11000rpm，离心20min~30min，收集离心上清液；

S14，离心上清液经3 KD超滤，超滤后的滤液喷雾干燥，Folin-酚法测定酵母肽的含量。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S2中检测符合纯度和效果要求的寡肽-1和寡肽-3的方法为反相高效液相色谱法，包括以下步骤：

S21，选择的色谱柱为C18，流动相A为20 mM磷酸缓冲液，流动相B为乙腈；

S22，设置仪器参数，检测波长为215 nm，梯度洗脱，流速为1.0 ml/min；

S23，得到色谱图，通过保留时间及峰面积计算得到纯度>95%的寡肽-1及寡肽-3。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述血清白蛋白为重组血清白蛋白。