CN115144508B - 一种适用于多种水溶性肽的hplc分离方法 - Google Patents

一种适用于多种水溶性肽的hplc分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，其特征在于：第一步：配制一个或多个待测水溶性肽样品，所述水溶性肽样品可以是单一种水溶性肽或多种水溶性肽的混合物；第二步：根据配制的待测水溶性肽样品的种类，设定液相色谱条件；第三步：配制分析用流动相；第四步：色谱柱平衡化；第五步：采用分析程序对其中一个待测水溶性肽样品进行测定：第六步：采用流动相B清洗色谱柱1~5min；第七步：重复第五步和第六步，对其他未测的待测水溶性肽样品依次进行测定。本发明的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法操作简单，连续分离测定多种水溶性肽时，节约大量的时间成本和经济成本，大大简化了操作的复杂性，对多种水溶性肽具有普适性。

Description

一种适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种适用于多种水溶性肽的高效液相色谱法(HPLC)分离方法。
背景技术
现有技术中，对于肽类的HPLC分析方法已有很多报道，然而，在这些报道中，多为针对一种肽或者是接近结构的几种肽进行分离测定，例如，现有技术文件CN109870525A公开了一种用液相色谱法分离测定多肽及其中杂肽的方法，其采用磷酸盐作为峰形增强试剂分离测定了多肽N端缺1个氨基酸的38肽、多肽N端缺2个氨基酸的37肽。现有技术中鲜有使用一种通用的HPLC方法进行三种以上多种水溶性肽的分离测定。一般是每种肽对应一个专一的方法，不仅使得流动相配制工作繁琐,而且所需试剂种类繁多，无论从管理上还是从所需空间上都需要很大的投入。例如：肽1用的流动相是甲醇和水，而用的分析程序是程序1，用的色谱柱是硅胶柱，分析时间为15min；而肽2用的流动相是乙腈和水，而用的分析程序是程序2，用的色谱柱为十八烷基柱，分析时间为15min。当分析完肽1后切换成分析肽2时，不仅要对硅胶柱进行清洗，然后换成十八烷基柱，更要配制乙腈和水流动相，再对十八烷基柱进行前期清洗，而后再对其进行平衡，这就需要花费大概2小时的时间。然而分析时间其实只需要15min，这前后会造成大量的时间成本浪费。
此外，根据现有技术文献报道：不同的肽类使用不同的流动相，如不同的乙腈或甲醇与水的配比，从而达到分离的目的。同时也有使用纯有机试剂或无机盐的相关报道。但这些方法均只能满足一种肽或蛋白，并不通用于大部分肽类或蛋白质类，而且使用无机盐时如果冲洗不彻底极易造成仪器或色谱柱堵塞,给后续工作带来困扰。
在以往的工作中，肽类分析时很容易出现几种肽不能完全分离的情况，而在分析肽类含量时又要求必须完全分离，否则无法准确计算肽的含量。同时，分析肽类时通常每种肽对应一种方法，包括分析程序，流动相成分及配比。使得操作步骤复杂繁琐。
另外，现有技术的方法为了改善色谱峰峰形，一般会在流动相里添加酸类或者三氟乙酸，这样会导致最终产品中酸类或三氟乙酸有残留，使产品呈现酸性并能闻到明显的酸味，而一些肽类实际在酸性条件下并不稳定，影响其储存时间。再者，由于三氟乙酸是强酸，对色谱柱的耐受性有很高要求，一般色谱柱无法承受强酸，需采用强化型色谱柱。
因此，亟待研究探寻一种更加通用的高效液相色谱法，对更多种类的水溶性肽具有普适性。
发明内容
发明要解决的问题
针对现有技术存在的问题，本发明的目的之一是解决对多种水溶性肽样品进行HPLC方法分离测定时，需要更换或清洗色谱柱、更换流动相、重新进行平衡等工序，造成时间成本上的浪费的问题。
本发明的再一目的是解决当流动相中含有无机盐时，冲洗不彻底极易造成仪器或色谱柱堵塞等问题。
此外，本发明另一目的是解决现有技术中为了改善色谱峰峰形添加的酸对色谱柱的负担的问题。
用于解决问题的方案
本发明涉及：
1、一种适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，其特征在于：
第一步：配制一个或多个待测水溶性肽样品，所述水溶性肽样品可以是单一种水溶性肽或多种水溶性肽的混合物；
第二步：根据配制的待测水溶性肽样品的种类，设定液相色谱条件；
第三步： 配制分析用流动相；
第四步：色谱柱平衡化；
第五步：采用分析程序对其中一个待测水溶性肽样品进行测定：
第六步：采用流动相B清洗色谱柱1~5min；
第七步：重复第五步和第六步，对其他未测的待测水溶性肽样品依次进行测定。
2、根据项目1所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，其特征在于：对于所述分析用流动相，流动相A为超纯水，流动相B为乙腈。
3、根据项目1或2所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，其特征在于：相对于每100mL超纯水，上述水溶性肽样品的质量为0.1~0.3g，优选0.1g。
4、根据项目1~3任一项所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，其特征在于：波长范围为200~300nm，优选210~230nm、260~280nm，特别优选215nm。
5、根据项目1~4任一项所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，其特征在于：色谱柱为填料为C18的色谱柱，流速为0.3～5mL/min，优选1 mL/min 。
6、根据项目1~5任一项所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，其特征在于：色谱柱柱温为室温，进样量为10～30μL，优选20μL，进样器温度为环境温度，待测样品采集时间为10~30min ，优选15min。
7、根据项目1~6任一项所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，其特征在于分析程序如下：
0.00～2.5min，所述流动相A和所述流动相B的比例为95％：5％；
2.5～10min，所述流动相A和所述流动相B的比例为95.0～40.0％：5.0～60.0％；
10～12.5min，所述流动相A和所述流动相B的比例为40％：60％；
12.5～12.6min，所述流动相A和所述流动相B的比例为40~95％：60~5％；
12.6～15min，所述流动相A和所述流动相B的比例为95.0％：5.0％。
8、根据项目1~6任一项所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，其特征在于：所述水溶性肽为寡肽-1、蓝铜胜肽、二肽-2、四肽-9、乙酰基四肽-9、六肽-9、寡肽-3、乙酰基六肽-8中的一种或多种。
发明的效果
本发明发现了一种新的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，其仅采用超纯水和乙腈作为流动相溶剂和特定的分析程序，而不用添加其他酸性物质例如现有技术中采用的无机酸和三氟乙酸等有机酸等，就实现了改善峰形的目的，而不会产生最终产品中酸类物质的残留、一些肽类实际在酸性条件下不稳定而影响其储存时间，以及由于三氟乙酸等强酸不利于色谱柱的耐受性或需要更高性能的强化型色谱柱等的不利效果，例如在流动相中添加三氟乙酸可以改善峰形，但不适用于蓝铜胜肽，这是因为三氟乙酸会影响蓝铜胜肽的存储和功效。
其次，通过完善分析程序来达到改善峰形的目的，同时将肽类分析方法统一化，减少分析时人力和物力的消耗。不同的肽类分析时无需更换色谱柱，仅需对色谱柱进行清洗即可，无需更换分析程序，无需改变检测波长，也无需改变色谱柱温度，更无需重新配制流动相和重新进行脱气，可以实现对多种水溶性肽的分析和纯度计算。
本发明的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法操作简单，连续分离测定多种水溶性肽时，节约大量的时间成本和经济成本，大大简化了操作的复杂性。本发明从分析肽类方法的普适性进行研究，并通过实验进行了验证。该技术可大大节省流动相配制的时间和切换肽类分析时所消耗的等待时间，不仅能够节省时间成本，同时也可节省流动相储存及色谱瓶储存所占用的空间和配制及切换过程中劳动力的消耗，从而使得利用此方法更利于全程自动化的实现。
附图说明
图1为实施例1中的寡肽-1的HPLC色谱图。
图2为实施例2中的蓝铜胜肽的HPLC色谱图。
图3为实施例3中的二肽-2的HPLC色谱图。
图4为实施例4中的四肽-9的HPLC色谱图。
图5为实施例5中的乙酰基四肽-9的HPLC色谱图。
图6为实施例6中的六肽-9的HPLC色谱图。
图7为实施例7中的寡肽-3的HPLC色谱图。
图8为实施例8中的乙酰基六肽-8的HPLC色谱图。
图9为比较例1中的蓝铜胜肽的HPLC色谱图。
图10为比较例2中的蓝铜胜肽的HPLC色谱图。
具体实施方式
本发明的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法包括以下步骤：
第一步：配制一个或多个待测水溶性肽样品，所述水溶性肽样品可以是单一种水溶性肽或多种水溶性肽的混合物；
第二步：根据配制的待测水溶性肽样品的种类，设定液相色谱条件；
第三步： 配制分析用流动相；
第四步：色谱柱平衡化；
第五步：采用分析程序对其中一个待测水溶性肽样品进行测定：
第六步：采用流动相B清洗色谱柱1~5min；
第七步：重复第五步和第六步，对其他未测的待测水溶性肽样品依次进行测定。
所述水溶性肽可以为例如寡肽-1、蓝铜胜肽、二肽-2、四肽-9、乙酰基四肽-9、六肽-9、寡肽-3、乙酰基六肽-8 、寡肽-5、透皮肽、十肽-4等，特别优选为寡肽-1、蓝铜胜肽、二肽-2、四肽-9、乙酰基四肽-9、六肽-9、寡肽-3、乙酰基六肽-8。
流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，流动相中不添加任何改善峰形的添加剂，例如醋酸、三氟乙酸、磷酸钾等物质。经过大量实验发现，采用超纯水作为流动相A，乙腈作为流动相B，可以对更多种类的肽类具有普适性，而其他种类的流动相组合仅适合一种或两种肽类，因此为最优选的流动相组合。
待测水溶性肽样品的浓度为：相对于每100mL超纯水，水溶性肽样品的质量为0.1~0.3g，优选0.1g。
检测波长由待测的肽类本身性质所决定，不受分析条件影响。但优选波长范围为200~300nm，更优选210~230nm、260~280nm，特别优选215nm。
色谱柱为常规使用的色谱柱，优选为填料为C18的色谱柱。
流速一般设定为0.3～5mL/min，优选1 mL/min 。
色谱柱柱温为室温，进样量为10～30μL，优选20μL。
进样器温度为环境温度，待测样品采集时间为10~30min ，优选15min。
色谱柱使用前按以下程序进行平衡化：
时间 B相百分比
1 100
15 5
30 5
所采用的分析程序如下：
0.00～2.5min，所述流动相A和所述流动相B的比例为95％：5％；
2.5～10min，所述流动相A和所述流动相B的比例为95.0～40.0％：5.0～60.0％；
10～12.5min，所述流动相A和所述流动相B的比例为40％：60％；
12.5～12.6min，所述流动相A和所述流动相B的比例为40~95％：60~5％；
12.6～15min，所述流动相A和所述流动相B的比例为95.0％：5.0％。
下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述说明。
以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。但是，应理解，这些实施例仅仅是示例性的，并不意图限制本发明。如无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原材料均为本领域常用的原材料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
实施例
仪器与条件：
采用Agilent1260InfinityII LC高效液相色谱仪及OpenLabCDS2软件系统；以Aglient ZORBAX SB-C18（250×4.6mm）为分离柱，柱温室温；紫外检测波长为215nm；流动相A为超纯水；流动相B为乙腈。
实验步骤：
分别取水溶性肽样品，分别称取0.1g的寡肽-1（实施例1）、蓝铜胜肽（实施例2，比较例1和2）、二肽-2（实施例3）、四肽-9（实施例4）、乙酰基四肽-9（实施例5）、六肽-9（实施例6）、寡肽-3（实施例7）、乙酰基六肽-8（实施例8），并分别溶于100mL超纯水中，制成待测水溶性肽样品。以上八种肽均为经北京百态派克生物科技有限公司验证肽序和分子量的源自态创生物科技(广州)有限公司的产品。
流速： 1mL/min
进样量： 20uL
色谱柱平衡化： 色谱柱使用前按以下程序进行平衡化
时间 B相百分比
1 100
15 5
30 5
分析程序：
时间 B相百分比
0.1 5
2.5 5
10 60
12.5 60
12.6 5
15 5
按照上述色谱条件连续对实施例1-8进行高效液相色谱分析，记录色谱图，而在更换测试样品进行测试时，除了使用乙腈对色谱柱进行清洗之外，中间没有进行更换色谱柱、重新平衡化、更换分析程序、改变检测波长、改变色谱柱温度等操作，更无需进行重新配制流动相和重新进行脱气等操作。
实施例1. 寡肽-1的分析
参照以上分析条件，对本公司产品寡肽-1进行HPLC分析, 结果如图1所示：寡肽-1的保留时间为3.093min。
实施例2. 蓝铜胜肽的分析
参照以上分析条件，对本公司产品蓝铜胜肽进行HPLC分析， 结果如图2所示：蓝铜胜肽的保留时间为3.098min。
实施例3. 二肽-2的分析
参照以上分析条件，对本公司产品二肽-2进行HPLC分析，结果如图3所示：二肽-2的保留时间为3.186min。
实施例4. 四肽-9的分析
参照以上分析条件，对本公司产品四肽-9进行HPLC分析，结果如图4所示：四肽-9的保留时间为3.038min。
实施例5. 乙酰基四肽-9的分析
参照以上分析条件，对本公司产品乙酰基四肽-9进行HPLC分析，结果如图5所示：乙酰基四肽-9的保留时间为3.095min。
实施例6. 六肽-9的分析
参照以上分析条件,对本公司产品六肽-9进行HPLC分析,结果如图6所示：六肽-9的保留时间为3.100min。
实施例7. 寡肽-3的分析
参照以上分析条件，对本公司产品寡肽-3进行HPLC分析，结果如图7所示：寡肽-3的保留时间为3.095min。
实施例8. 乙酰基六肽-8的分析
参照以上分析条件，对本公司产品乙酰基六肽-8进行HPLC分析, 结果如图8所示：乙酰基六肽-8的保留时间为3.069min。
比较例1.
除了更换了分析程序之外，以与实施例2相同的方式，分离测定了蓝铜胜肽样品的保留时间，结果如图9所示，可以看出不能达到很好的分离效果。
比较例2
除了流动相中乙腈换为甲醇之外，以与实施例2相同的方式，分离测定了蓝铜胜肽样品的保留时间，结果如图10所示，可以看出，流动相中乙腈换为甲醇，会加大峰宽，从而影响分离效果和纯度计算。
结果表明，采用本发明的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，在可以连续的分离测定实施例1~8的肽类，色谱中的各肽类的峰形清晰，该技术可大大节省流动相配制的时间和切换肽类分析时所消耗的等待时间，不仅能够节省时间成本，同时也可节省流动相储存及色谱瓶储存所占用的空间和配制及切换过程中劳动力的消耗，从而使得利用此方法更利于全程自动化的实现。
此外，从实施例2与比较例1的比较可以看出，采用本发明范围内的分析程序，可以获得更好、更优异的分离效果。
同时从实施例2与比较例1的比较可以看出，采用乙腈作为流动相，获得了比采用甲醇作为流动相更加清晰、更窄的波形，从而大大提高了分离效果和纯度计算的准确性。
本发明通过实施例的方式详细分析了上述8种水溶性肽，该8种肽的分析方法完全统一，在每种肽中均能得到很好的验证。上述实施例仅是示例性的，本发明并不限于此。
综上可知，本发明的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法操作简单，连续分离测定多种水溶性肽时，节约大量的时间成本和经济成本，大大简化了操作的复杂性对水溶性肽类具有普适性。

Claims (6)

1.一种适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，其特征在于：
第一步：配制多个待测水溶性肽样品，所述水溶性肽样品是单一种水溶性肽；
第二步：根据配制的待测水溶性肽样品的种类，设定液相色谱条件；
第三步：配制分析用流动相；
第四步：色谱柱平衡化；
第五步：采用分析程序对其中一个待测水溶性肽样品进行测定；
第六步：采用流动相B清洗色谱柱1~5min；
第七步：重复第五步和第六步，对其他未测的待测水溶性肽样品依次进行测定；
其中：
对于所述分析用流动相，流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；所述色谱柱为填料为C18的色谱柱；流速为0.3～5mL/min；波长范围为210~230nm或260~280nm；
上述分析程序如下：
0.00～2.5min，所述流动相A和所述流动相B的比例为95％：5％；
2.5～10min，所述流动相A和所述流动相B的比例为95.0～40.0％：5.0～60.0％；
10～12.5min，所述流动相A和所述流动相B的比例为40％：60％；
12.5～12.6min，所述流动相A和所述流动相B的比例为40~95％：60~5％；
12.6～15min，所述流动相A和所述流动相B的比例为95.0％：5.0％；
所述水溶性肽为寡肽-1、蓝铜胜肽、二肽-2、四肽-9、乙酰基四肽-9、六肽-9、寡肽-3和乙酰基六肽-8。
2.根据权利要求1所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，其特征在于：相对于每100mL超纯水，所述水溶性肽样品的质量为0.1~0.3g。
3.根据权利要求1或2所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，其特征在于：相对于每100mL超纯水，所述水溶性肽样品的质量为0.1g。
4.根据权利要求1或2所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，其特征在于：所述流速为1 mL/min。
5.根据权利要求1或2所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，其特征在于：色谱柱柱温为室温，进样量为10～30μL，进样器温度为环境温度，待测样品采集时间为10~30min。
6.根据权利要求5所述的适用于多种水溶性肽的HPLC分离方法，其特征在于：所述进样量为20μL。
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