CN112608933B - 一种重组蓝铜肽前体-寡肽的高纯度制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种重组蓝铜肽前体‑寡肽的高纯度制备方法，涉及基因工程领域。该制备方法利用大肠杆菌合成重组多拷贝GHK串联短肽，及酶解法切割释放GHK单体以大量生产GHK单肽。该方法的关键在于(1)利用class‑IIS型限制性核酸内切酶在识别位点下游特定位置切割任意DNA序列的特点，实现短肽的多次串联延长；解决了基因工程表达短肽的低表达量的问题，具有降低生产成本、减轻化学合成中造成的环境负担的优势；(2)无需蛋白纯化柱，简单通过硫酸铵沉淀‑等电点沉淀结合的蛋白纯化方法，即可高效分离纯化酶切获得GHK单体；与GHK标准品具有相同的生物活性，且纯度高、成本低。

Description

一种重组蓝铜肽前体-寡肽的高纯度制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种重组蓝铜肽前体-寡肽(GHK)的高纯度制备方法，具体是利用酶切串联多肽制备可用于医疗和护肤的GHK的工艺方法。
背景技术
蓝铜肽前体-寡肽(GHK)是一种由甘氨酸、赖氨酸和组氨酸三个氨基酸组成的三联体短肽，其在溶液中可以自发地和铜离子结合形成蓝铜胜肽。蓝铜胜肽(GHK-Cu)具有较高的社会价值和经济价值，应用于化妆品中，可以起到减少皱纹以及抗衰老的功效。
蓝铜胜肽(GHK-Cu)最初于1973年从人的血浆中分离得到。近年来有人报道，GHK和GHK-Cu可以在纤维原细胞培养液中促进或抑制金属蛋白酶的合成，还能促进多种细胞和组织的生长、分裂和分化。
接下来的几年中，人们陆续发现GHK-Cu的多种功能及应用，如：1)抗炎症活性，在最近的研究发现，GHK-Cu复合物可减少TNF-α依赖的IL-6在人类皮肤成纤维细胞中的分泌。由于其抗炎症性质，铜肽可取代类固醇或非固醇类抗炎症药物在皮肤炎症治疗中的作用。其还可以减少紫外线诱导的红斑；2)DNA修复，最近研究表明GHK-Cu具有恢复经辐射后的完整细胞的功能的能力，GHK-Cu可刺激经辐射后的成纤维细胞生长并促进其表达更多的生长因子bFGF和VGF；3)神经再生。2005年，Ahmed的研究表明GHK可促进神经再生。研究者使用带有合成GHK短肽的胶原管研究轴突再生，发现GHK使造血细胞至胶原管的迁移、神经生长因子的产量、整合素的表达以及有髓鞘的神经纤维再生速率增加，同时增加了轴突数量和神经鞘细胞的增殖；4)在干细胞中的效应。2009年，汉城国立大学的一组研究团队发现，铜肽GHK-Cu可刺激角质细胞的增殖以及整合素和p63蛋白的在表皮干细胞的表达。由于p63被认为是一种重要的干细胞标记物和抗衰老蛋白，作者总结GHK-Cu能够修复表皮干细胞，同时增强其修复表皮的能力。2012年，该研究团队报道称未结合Cu的GHK中也观察到该活性；5)抗癌症效应。2010年，Hong Y.团队揭示了GHK-Cu能够逆转某些与结肠癌的转移性扩散相关基因的表达，在非常低的浓度(1mM)即有极高效率；
此外，最近的基因组研究表明GHK直接调节基因表达，可能可以解释许多生物学现象的差异。Iorio研究团队探索产生相似转录应答的复合体网络，发现抑制GHK的同时，在268个基因中的mRNA产量增加。通过对患有慢性阻塞性肺病的吸烟者的肺的研究发现，GHK能够逆转肺气肿损伤的基因表达信号。与肺气肿严重程度相关的基因表达信号包括127个基因，涉及炎症和修复。研究者确定GHK下调了涉及肺损伤和炎症的基因，同时上调了涉及组织修复的基因。在从患有肺气肿的肺中获取的肺成纤维细胞中添加10摩尔GHK，恢复了其胶原蛋白重构能力及将其组装至特定组织纤维中的能力。
GHK作为生物活性多肽，广泛用于实验和临床等目的。其大部分通过化学合成方式生产，其小规模短肽生产成本极高，且发展主要受到反应副产物过多、环境不友好、产率过低、反应底物和试剂价格过高等缺点的制约。基因工程技术成功生产了许多种蛋白。目前，通过基因工程生产蛋白主要步骤为分离目的基因，构建表达载体，在大肠杆菌宿主中生产蛋白，是一种非常高效生产相对短肽分子量较大的蛋白的方法，但由于其低表达量，此方法几乎不应用于短肽生产。
针对基因工程产短肽的表达量低这种问题，许多科学家积极研究多拷贝串联DNA的克隆技术来生产短肽，发现了可用于构建的不对称的和互补的黏性末端的限制酶class-IIS。另一种方法是DNA片段末端连接定向结合子来构建定向重复。但是这些方法不具有通用性，且目前也没有将多拷贝串联技术应用于提高GHK的表达量，同时也缺少对基因工程产GHK的分离纯化方面的相关研究。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种重组蓝铜肽前体-寡肽的高纯度制备方法。该制备方法利用大肠杆菌合成重组多拷贝GHK串联短肽，及酶解法切割释放GHK单体以大量生产GHK单肽。该方法的关键在于(1)利用class-IIS型限制性核酸内切酶在识别位点下游特定位置切割任意DNA序列的特点，实现短肽的多次串联延长；(2)建立了无需蛋白纯化柱，简单通过硫酸铵沉淀-等电点沉淀结合的蛋白纯化方法，即可高效分离纯化酶切获得GHK单体的技术方案。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种重组蓝铜肽前体-寡肽的高纯度制备方法，包括如下步骤：
(1)根据class-IIS型限制性内切酶特点和GHK的基因序列，设计引入5′末端磷酸化的互补的引物，构建小肽编码单元；
(2)小肽编码单元通过自连，延长重复序列，得到串联短肽基因片段；
(3)将引入了class-IIS型限制性内切酶酶切位点的克隆载体与步骤(2)的串联短肽基因片段连接，将串联短肽基因片段插入至class-IIS型限制性内切酶酶切位点处，得到重组克隆载体；
(4)将重组克隆载体上的串联短肽基因片段通过酶切连接，连接到表达载体上，获得重组表达载体；
(5)将步骤(4)所得重组表达载体转入宿主菌中，获得可表达重组串联重复GHK多肽的重组菌株；
(6)培养重组菌株，诱导重组串联重复GHK多肽的表达；
(7)细胞破碎上清液用60～75％饱和度硫酸铵静置沉淀，取上清调pH至弱碱性，继续静置后继续添加硫酸铵至饱和度80～95％，再次静置，所得沉淀即重组串联重复GHK多肽；
(8)利用蛋白酶切割重组串联重复GHK多肽得到GHK单体。
优选地，步骤(1)中所述class-IIS型限制性内切酶为BbsI或AvaI等。
优选的，步骤(1)中所述小肽编码单元对应的氨基酸序列为2拷贝的GHK；
进一步的，步骤(1)中，所述引物的序列如下：
Tar-F：5′-P-GGTCATAAAGGCCACAAG-3′；
Tar-R：5′-P-GACCCTTGTGGCCTTTAT-3′；
进一步的，步骤(1)中所述小肽编码单元对应的核苷酸序列为：5′-GGTCATAAAGGCCACAAG-3′，如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，步骤(3)中所得的重组克隆载体可被相同class-IIS型限制性内切酶重复酶切，与步骤(2)的串联短肽基因片段连接，实现串联重复GHK片段不断延长，直至获得足够拷贝的串联重复序列。
优选的，步骤(3)中所述克隆载体为大肠杆菌克隆载体；进一步为pUC19、pUC18或pBluescript等。
优选的，步骤(3)中，class-IIS型限制性内切酶酶切位点引入至pUC19克隆载体的NdeI和HindIII位点之间；
优选的，步骤(4)中，重组克隆载体上的串联短肽基因片段对应的氨基酸序列为n+1拷贝的GHK；其中，n为2～998；进一步为8～100；再进一步为8～50；更进一步为18～40；
优选的，步骤(4)中，酶切所用的酶切位点为HindIII和NdeI。
优选的，步骤(4)中所述表达载体为大肠杆菌表达载体；进一步为pET30a(+)、pET28a(+)或pETDuat-1等。
优选的，步骤(5)中所述宿主菌为大肠杆菌；进一步为E.coli BL21(DE3)、E.coliBL21或E.coli BL21(DE3)plyS等。
优选的，步骤(6)中，诱导所用的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)；进一步为0.1～1mM的IPTG；进一步为1mM的IPTG。
优选的，步骤(6)中，诱导的条件为28～40℃，200～250rpm诱导3～6h；进一步为37℃，220rpm诱导4h。
优选的，步骤(7)中，细胞破碎上清液用70％饱和度硫酸铵静置沉淀，取上清调pH至弱碱性，继续静置后继续添加硫酸铵至饱和度90％。
优选的，所述的静置的条件为2～8℃静置4～18h；进一步为2～8℃静置6～18h；再进一步为2～8℃静置8～12h；更进一步为4℃静置8～12h；
优选的，所述的继续静置的条件为2～8℃静置4～18h；进一步为2～8℃静置6～18h；再进一步为2～8℃静置8～12h；更进一步为4℃静置8～12h；
优选的，所述的再次静置的条件为2～8℃静置4～18h；进一步为2～8℃静置6～18h；再进一步为2～8℃静置8～12h；更进一步为4℃静置8～12h；
优选的，步骤(7)中，调pH至弱碱性为调pH至8.5～10.5；进一步为调pH至9～10。
进一步的，步骤(7)中，重组串联重复GHK多肽的制备方法，采用硫酸铵沉淀法和等电点沉淀法，具体包括如下步骤：
收集步骤(6)中的诱导表达后的菌体，重悬，超声破碎并离心得到细胞破碎上清液，通过加固体硫酸铵粉末的方式，先在饱和度60～75％的硫酸铵下静置，离心并过滤去除杂蛋白，收集上清液；调上清液调节pH至弱碱性，继续静置后继续加入硫酸铵粉末至饱和度80～95％，再次静置，离心得到目的蛋白沉淀，即重组串联重复GHK多肽。
优选的，步骤(8)中所述蛋白酶为胰蛋白酶。
进一步的，步骤(8)中，GHK单体的制备方法，包括如下步骤：
将重组串联重复GHK多肽重悬，按质量比1～5％加入胰蛋白酶，酶切，离心收集上清液，得到纯度高的GHK单体溶液。
优选的，所述的重悬采用5～100mM碳酸氢铵溶液重悬；进一步采用25～100mM碳酸氢铵溶液重悬；再进一步采用25～50mM碳酸氢铵溶液重悬；更进一步采用50mM碳酸氢铵溶液重悬。
优选的，按质量比5％加入胰蛋白酶；
优选的，酶切的条件为25～40℃酶切2～6h；进一步为37℃酶切4h。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明通过优化蓝铜肽前体-寡肽(GHK)的编码基因，设计重复串联结构，解决了基因工程表达短肽的低表达量的问题，具有降低生产成本、减轻化学合成中造成的环境负担的优势。
(2)本申请通过串联编码基因获得31个串联重复的GHK肽序列([GHK]31)，该[GHK]31无需经过色谱柱的简便纯化制备方案。本发明所述方法获得的重组蓝铜肽前体-寡肽与化学合成样品具有相同的生物活性，纯度高，成本低。
附图说明
图1是重组载体rpUC19的构建流程。
图2是重组蛋白的SDS-PAGE图；其中，(a)为诱导验证图，泳道包括M：蛋白Marker；泳道1、2、3：分别为未诱导的细菌破碎全液、上清液、沉淀；泳道4、5、6：分别为诱导后的细菌破碎全液、上清液、沉淀；(b)为方案6的硫酸铵分离纯化图，泳道包括M：蛋白Marker；泳道1、2、3：分别为诱导后的细菌破碎全液、上清液、沉淀；泳道4：70％饱和度硫酸铵沉淀；泳道5：调节pH后的90％饱和度硫酸铵的沉淀，稀释了6倍；泳道6：70％饱和度硫酸铵上清；泳道7：调节pH后的90％饱和度硫酸铵上清。
图3是胰蛋白酶酶切重组多肽后的薄层层析(TLC)图；其中，泳道1：GHK标准品2μg；泳道2：GHK标准品3μg；泳道3：重组多肽；泳道4：重组多肽胰蛋白酶酶切产物。
图4是胰蛋白酶酶切重组多肽后的高效液相色谱(HPLC)图；其中，(a)为胰蛋白酶酶切产物样品峰图，(b)为GHK标准品峰图。
图5是GHK单体的抑菌实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1表达串联多拷贝[GHK]31短肽的重组菌株的构建
1.末端磷酸化[GHK]n的构建
结合E.coli密码子偏好性，设计了[GHK]2序列(SEQ ID NO.1)作为引物Tar-F，根据BbsI酶切位点及碱基互补配对原则设计并合成了引物Tar-R作为Tar-F的反义链，在DNA引物合成时引入5′末端磷酸化。具体引物序列如下：
Tar-F：5′-P-GGTCATAAAGGCCACAAG-3′；
Tar-R：5′-P-GACCCTTGTGGCCTTTAT-3′；
DNA单链退火：洁净的离心管内加入等量Tar-F和Tar-R，利用PCR仪程序控温，在1h内温度由95℃梯度降温至25℃，形成二拷贝的GHK双链DNA，即[GHK]2。
[GHK]2两端黏性末端能够自身互补，而片段较短，不易自身环化，因此易于两段到多段[GHK]2的DNA片段串联连接形成[GHK]n，故用常规T4连接酶连接得到[GHK]n。
2.克隆载体rpUC19的构建。
在质粒pUC19的NdeI和HindIII酶切位点间引入酶切位点BbsI，并替换BbsI切割位点DNA序列，使其经酶切后形成的粘性末端与[GHK]n串联片段末端可互补配对。
以质粒pUC19上携带的NdeI和HindIII酶切位点前后序列为基础，分别设计上下游引物P1/P2，并将带有酶切位点BbsI的靶序列添加到上下游引物对的5′端，形成20bp的同源臂，另在质粒pUC19上选取了其中一段序列作为一组引物P3/P4，通过同源重组连接获得质粒rpUC19。具体引物序列如下：
P1：5′-TGACCTCGTCTTCGCATATGGTGCACTCTCAGTA-3′；
P2：5′-CATATGCGAAGACGAGGTCACAAGCTTGGCGTAATCATG-3′；
P3：5′-ACCTAGATCCTTTTAAATTA-3′；
P4：5′-TAATTTAAAAGGATCTAGGT-3′。
以质粒pUC19作为PCR模板，分别以P1/P3及P2/P4两组引物作为引物对，进行PCR扩增，得到两条pUC19同源重组线性片段rpUC19-1(fragmentⅠ)、rpUC19-2(fragmentⅡ)，使用ClonExpress II重组克隆试剂盒对两片段进行连接，得到克隆载体rpUC19(图1)。
3.重组克隆载体rpUC19-[GHK]31的构建
对克隆载体rpUC19使用BbsI进行单酶切及去磷酸化处理后，与[GHK]n连接，获得质粒rpUC19-[GHK]19。
重复上述操作，对rpUC19-[GHK]19继续使用BbsI进行单酶切及去磷酸化，与[GHK]n相连接，最终获得GHK拷贝数足够多的质粒rpUC19-[GHK]31。
4.表达载体pET30a(+)-[GHK]31的构建。
用NdeI和HindIII分别双酶切载体pET30a(+)与重组克隆载体rpUC19-[GHK]31，获得pET30a(+)与[GHK]31片段，经常规连接转化，得到表达载体pET30a(+)-[GHK]31。
5.表达[GHK]31的重组菌株的构建
将pET30a(+)-[GHK]31转化进表达菌株E.coli BL21(DE3)中，获得表达串联短肽[GHK]31的重组菌株E.coli BL21(DE3)-[GHK]31。
实施例2[GHK]31短肽的表达与分离纯化
1.[GHK]31短肽的表达
在含硫酸卡那霉素的300mL LB液体培养基中按体积比1：100接入重组菌株E.coliBL21(DE3)-[GHK]31，于37℃，220rpm条件下培养到OD600＝0.5～0.7后，加入1mM的IPTG继续诱导培养4h。
2.[GHK]31短肽的分离纯化
收集菌体，悬浮于30mL PBS缓冲液中(50mM PBS，pH＝7.0)，12～15OD/mL，超声破碎并离心得到细胞破碎上清液。
取细胞破碎上清液，采用下述6种方案进行纯化步骤优化，结果表明方案6得到的重组多肽[GHK]31蛋白回收率最高，且操作过程简单，无需纯化柱，成本低。
使用SDS-PAGE电泳分析对[GHK]31短肽的表达、分离纯化效果进行鉴定，如图2所示。
实施例3 GHK单体制备
利用胰蛋白酶切割重组蛋白。[GHK]31短肽经分离纯化后，按[GHK]31：胰蛋白酶＝20：1的质量比加入胰蛋白酶，37℃孵育4h，随后4℃下离心分离沉淀和上清液，GHK单体即存在于上清液中，即胰蛋白酶酶切产物。
实施例4 GHK单体纯度检验
1.薄层色谱(TLC)检测
将所得GHK单体溶液(胰蛋白酶酶切产物)做薄层层析验证。展开剂及其体积比例为氯仿：甲醇：水：氨水＝15：5：1：1，将胰蛋白酶酶切产物与GHK标准品在展开剂中共同展开50min。
结果显示，胰蛋白酶酶切产物与GHK标准品位置相同，且斑点单一(如图3所示)，由此初步证明本发明所述方法可有效制备GHK单体。
2.高效液相色谱(HPLC)检测
使用HPLC进一步分析所制备GHK单体样品的纯度。使用Shimadzu-LC-20A双泵及SPD-M20A检测器，色谱柱为WATERS sunfire C18柱(5μm，4.6mm×250mm)，检测波长为215nm。流动相为5％乙腈(含0.1％三氟乙酸)的水溶液。
结果显示，GHK标准品和[GHK]31酶切后的GHK单体保留时间都为3.06min左右(如图4所示)，且峰型单一，无杂质峰出现，证明本发明所述方法可有效制备高纯度的GHK单体。经计算，最终GHK单体产量为17.56mg/L。
表1：1L培养物中[GHK]31和GHK单体收率
样品 总蛋白质量(mg) 目的蛋白质量(mg) 纯度(％) 收率(％) 产量(mg/L)
破碎全液 184.80 24.64 13.33 100.00 24.64
破碎上清液 170.80 23.89 13.99 96.97 23.89
70％上清液 18.52 18.13 97.89 73.58 18.13
等电点沉淀 * 18.04 * 73.21 18.04
GHK单体 17.56 17.56 100 71.27 17.56
*等电点沉淀样品无法溶解，故无法计算总蛋白质量。
从表1可知，经过最优纯化方法，最终在1L培养物中可收获18.04mg重组多肽[GHK]31，收率达73.21％；经过酶切后可得17.56mg GHK单体，即GHK单体产量为17.56mg/L。
实施例5 GHK生物学活性检验
将GHK标准品、GHK单体分别加入到M9培养基(加0.1％酵母提取物)中，使其终浓度为50μg/mL。在20mL上述培养液中按体积比1：50接种常规大肠杆菌DH5α，在37℃，220rpm条件下培养24h，监测其生长状态，在8h、12h、24h时取样并记录其OD600值(图5)。可以看到，在含GHK的培养液中，大肠杆菌的生长明显受到抑制，表明本发明制备的GHK与GHK标准品有相同生物学活性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种重组蓝铜肽前体-寡肽的高纯度制备方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> [GHK]2序列
<400> 1
ggtcataaag gccacaag 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Tar-F
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化修饰
<400> 2
ggtcataaag gccacaag 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Tar-R
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化修饰
<400> 3
gacccttgtg gcctttat 18
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P1
<400> 4
tgacctcgtc ttcgcatatg gtgcactctc agta 34
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P2
<400> 5
catatgcgaa gacgaggtca caagcttggc gtaatcatg 39
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P3
<400> 6
acctagatcc ttttaaatta 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P4
<400> 7
taatttaaaa ggatctaggt 20

Claims (6)

1.一种重组蓝铜肽前体-寡肽的高纯度制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）根据class-IIS型限制性内切酶特点和GHK的基因序列，设计引入5′末端磷酸化的互补的引物，构建小肽编码单元；
（2）小肽编码单元通过自连，延长重复序列，得到串联短肽基因片段；
（3）将引入了class-IIS型限制性内切酶酶切位点的克隆载体与步骤（2）的串联短肽基因片段连接，将串联短肽基因片段插入至class-IIS型限制性内切酶酶切位点处，得到重组克隆载体；
（4）将重组克隆载体上的串联短肽基因片段通过酶切连接，连接到表达载体上，获得重组表达载体；
（5）将步骤（4）所得重组表达载体转入宿主菌中，获得表达重组串联重复GHK多肽的重组菌株；
（6）培养重组菌株，诱导重组串联重复GHK多肽的表达；
（7）细胞破碎上清液用60～75%饱和度硫酸铵静置沉淀，取上清调pH至弱碱性，继续静置后继续添加硫酸铵至饱和度80～95%，再次静置，所得沉淀即重组串联重复GHK多肽；
（8）利用蛋白酶切割重组串联重复GHK多肽得到GHK单体；
步骤（7）中，
所述的静置的条件为2～8℃静置4～18h；
所述的继续静置的条件为2～8℃静置4～18h；
所述的再次静置的条件为2～8℃静置4～18h；
调pH至弱碱性为调pH至8.5～10.5；
步骤（8）中，GHK单体的制备方法，包括如下步骤：
将重组串联重复GHK多肽重悬，按质量比1～5%加入胰蛋白酶，酶切，离心收集上清液，得到纯度高的GHK单体溶液；
所述的重悬采用5～100 mM碳酸氢铵溶液重悬；
酶切的条件为25～40℃酶切2～6 h；
步骤（1）中所述class-IIS型限制性内切酶为BbsI或AvaI；
步骤（1）中所述小肽编码单元对应的氨基酸序列为2拷贝的GHK；
步骤（1）中所述小肽编码单元对应的核苷酸序列为：5′-GGTCATAAAGGCCACAAG-3′；
步骤（1）中，所述引物的序列如下：
Tar-F：5′-P-GGTCATAAAGGCCACAAG-3′；
Tar-R：5′-P-GACCCTTGTGGCCTTTAT-3′。
2.根据权利要求1所述的高纯度制备方法，其特征在于：
步骤（3）中所得的重组克隆载体被相同class-IIS型限制性内切酶重复酶切，与步骤（2）的串联短肽基因片段连接，实现串联重复GHK片段不断延长，直至获得足够拷贝的串联重复序列。
3.根据权利要求1所述的高纯度制备方法，其特征在于：
步骤（4）中，重组克隆载体上的串联短肽基因片段对应的氨基酸序列为n+1拷贝的GHK；其中，n为2～998。
4.根据权利要求1所述的高纯度制备方法，其特征在于：
步骤（3）中所述克隆载体为pUC19、pUC18或pBluescript；
步骤（4）中所述表达载体为pET30a(+)、pET28a(+)或pETDuat-1；
步骤（5）中所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21或E.coli BL21(DE3)plyS。
5.根据权利要求4所述的高纯度制备方法，其特征在于：
步骤（3）中，class-IIS型限制性内切酶酶切位点引入至pUC19克隆载体的NdeI和HindIII位点之间；
步骤（4）中，酶切所用的酶切位点为HindIII和NdeI；
步骤（6）中，诱导所用的诱导剂为IPTG；
步骤（6）中，诱导的条件为28～40℃，200～250rpm诱导3～6h；
步骤（8）中所述蛋白酶为胰蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的高纯度制备方法，其特征在于：
步骤（7）中，
细胞破碎上清液用70%饱和度硫酸铵静置沉淀，取上清调pH至弱碱性，继续静置后继续添加硫酸铵至饱和度90%；
所述的静置的条件为2～8℃静置6～18h；
所述的继续静置的条件为2～8℃静置6～18h；
所述的再次静置的条件为2～8℃静置6～18h；
调pH至弱碱性为调pH至9～10。
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