CN106560475A - 一种活性短肽基因工程生物合成工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种活性短肽基因工程生物合成工艺,包括下述步骤:(1)、设计活性短肽的串联表达氨基酸序列;(2)、优化氨基酸序列密码子编码;(3)、人工合成基因导入原核或真核微生物细胞,利用微生物细胞的蛋白质合成系统,产生大量的活性短肽串联蛋白质,活性短肽串联蛋白质根据串联的数目在微生物细胞内以可溶蛋白质或蛋白质包涵体形式存在;(4)、将转基因原核或真核微生物细胞在充分养料或氧气供给的条件下进行高密度培养,化学诱导蛋白质表达,以增加活性短肽串联蛋白质重组的产率;(5)、采用高特异性的蛋白酶降解重组蛋白质,产生活性短肽单体片段;(6)、分离纯化酶降解活性短肽单体片段。本发明生产方法成熟,可规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及基因生物工程和多肽合成领域,尤其涉及一种活性短肽基因工程生物合成工艺。
背景技术
GHK三肽和GQPR四肽分别是一种天然活性多肽,也是一种活性短肽。
GHK三肽(天然三肽GHK)是3个天然氨基酸,甘氨酸-组氨酸-赖氨酸,按照顺序通过肽键连接而成的短肽(英文名:Gly-His-Lys,L-Glycine-L-Histidine-L-Lysine)。在人体内天然存在,通常在儿童体内含量较高,随年龄增长而逐渐下降。
GHK三肽具有促进皮肤伤口愈合及增生功效。人体血浆中的三肽Gly-L-His-L-Lys(GHK)和二价铜离子有很强的亲和力,能自发地形成络合物铜胜肽(copper peptide或GHK-Cu),又称蓝铜胜肽。铜是身体的基本元素之一,在皮肤组织的功用上,能协助伤口的愈合。铜离子无法单独进入肌肤底层,因此,透过蓝铜胜肽,可将铜导入肌肤,完美发挥活肤功效。蓝铜胜肽能有效促进胶原蛋白和弹力蛋白制造和抗氧化能能,同时更深入肌肤渗透,促进自我修补能力,发挥极致的抚平皱纹效果。铜离子对伤口愈合以及许多的酶促反应过程而言是一种非常重要的成分。研究表明,GHK-Cu可促使神经细胞、免疫相关细胞的生长、分裂和分化,能有效促进伤口愈合和生发。据此GHK三肽目前的工业应用,主要作为一种化妆品添加剂。
GQPR四肽的氨基酸序列为Gly-Gln-Pro-Arg,GQPR四肽目前的工业应用,同样也主要作为一种化妆品添加剂。如棕榈酰四肽Pal-GQPR能促进细胞间质胶原蛋白质和透明质酸分泌,促进细胞更新,具有抗衰老和除皱的功能,加速粒细胞趋化蛋白(GCP-2)表达,促进伤口恢复。同时,GQPR是免疫球蛋白IgG的片段,IgG有许多生物活性功能,尤其免疫调节功能。皮肤细胞因子,尤其是IL6参与了慢性炎症反应,在皮肤衰老过程中表现了重要作用。衰老过程中,脱氢表雄酮DHEA的下降和IL6的增多呈现很强的关联性。棕榈酰四肽Pal-GQPR会模拟皮肤中的DHEA,控制炎性细胞因子在循环系统中的水平,使用棕榈酰四肽Pal-GQPR将会降低老化中IL6水平从而达到重新维持皮肤中细胞因子平衡,来实现对皮肤的护理,降低炎性反应使皮肤更加紧致、光滑富有弹性。棕榈酰四肽Pal-GQPR肽通过作用于角质形成细胞来减少IL6分泌。
正因为铜胜肽GHK-Cu和棕榈酰四肽Pal-GQPR广泛应用在化妆品和护肤品领域,所以活性短肽GHK和GQPR作为必备原料需求量巨大。
然而,GHK三肽和GQPR四肽在人体内只是少量存在,含量很低,从天然生物体中分离纯化获得的工艺不可行。
目前,GHK和GQPR的合成主要采用化学合成法中的Merrifield固相多肽合成法。该法主要是将带有氨基保护基团的氨基酸的羧基端固定到不溶性树脂上,脱去该氨基酸上的氨基保护基。同下一个氨基酸的活化羧基形成酯键,从而延伸肽链形成多肽。每个肽链合成循环由以下三步反应构成,反复循环,直到肽链在树脂上延伸至所需长度,然后多肽被切割下来用于色谱纯化:
步骤(1)、脱保护:固相多肽合成法保护的氨基酸必须用一种碱性溶剂(piperidine)去除氨基的保护基团;
步骤(2)、活化:待连接的氨基酸的羧基被活化剂所活化;
步骤(3)、偶联:活化的羧基与前一个氨基酸裸露的氨基反应,形成肽键。在此步骤使用过量的试剂促使反应完成。
所以,多肽固相合成是一个重复添加氨基酸的过程,固相合成顺序一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。为了防止副反应的发生,参加反应的氨基酸的侧链都是被保护的;而羧基端是游离的,并且在反应之前必须活化。
多肽固相合成法经过不断改进和完善,成为多肽化学合成的常规方法,尤其是短肽的合成,已经广泛用于多肽和蛋白质的研究领域。而其主要的缺点表现为直接合成的序列短、耗时、合成效率和纯度低、成本高及合成试剂的毒性大等。
因此需要一种新的生产工艺,大批量地生产活性短肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、合成速度快、产量高、成本低而且安全的活性短肽基因工程生物合成工艺。
解决上述技术问题所采用的技术方案包括下述步骤:
步骤一、设计活性短肽的串联表达氨基酸序列;
步骤二、优化氨基酸序列密码子编码;
步骤三、人工合成基因,导入原核或真核微生物细胞,利用微生物细胞的蛋白质合成系统,产生大量的活性短肽的串联体,活性短肽串联蛋白质根据串联的数目在微生物细胞内以可溶的蛋白质或蛋白质包涵体形式存在;
步骤四、将转基因原核或真核微生物细胞在充分养料或氧气供给的条件下进行高密度培养,化学诱导蛋白质表达,以增加活性短肽串联蛋白质重组的产率;
步骤五、采用高特异性的蛋白酶降解重组蛋白质,产生活性短肽单体片段;
步骤六、分离纯化酶降解活性短肽单体片段。
所述的步骤四与步骤五之间增加一步,优化微生物的表达产率:
所述的优化微生物细胞的表达产率后增加两步:
其一、高压破碎微生物细胞,
其二、镍离子螯合亲和柱分离Hisx6标记重组蛋白质。
所述的活性短肽为GHK三肽和GQPR四肽。
所述的高特异性的蛋白酶为胰蛋白酶或内肽酶Lys-C。
本发明采用的基因工程生物合成工艺,通过对活性短肽的串联设计,利用微生物细胞的快速大量繁殖,合成肽链速度快和产量大,生物合成过程中生产条件温和,再通过蛋白酶降解,最后分离纯化。本发明生产方法成熟,原料和化学试剂成本低,可以实现低成本规模化生产GHK三肽和GQPR四肽。
附图说明
图1是本发明的GHK三肽基因工程生物合成工艺。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述,而非以任何形式对本发明进行限制。
一、以GHK三肽基因工程生物合成完整工艺进行说明,如图1所示:
步骤一:设计GHK三肽的串联表达氨基酸序列:
设计GHK三肽的20单体串联序列(按照标准氨基酸代码)为:
MMRGHKGHKGHKGHKGHKGHKGHKGHKGHKGHKGHKGHKGHKGHKGHKGHKGHKGHKGHKGHKHHHHHH*
步骤二、优化氨基酸序列密码子编码:
表达载体细胞大肠杆菌E.coli的偏爱密码子:甘氨酸GGT/GGC,组氨酸CAT/CAC,赖氨酸AAA/AAG,GHK三肽的优化密码选用GGTCATAAA和GGCCACAAG;
步骤三、合成串联GHK三肽的基因蛋白质:
首先,根据大肠杆菌的密码子偏爱性,将GHKx20的核苷酸序列,设计成如SEQ ID No.1所示的目的基因,SEQ ID No.1:串联GHKx20的DNA片段:
分两个核酸片段分别合成,合成基因可以是优化的GHK基因编码(x可以是从1到200)的串联体,如下所示,N表示可以为A,T,G,C中的任何一种碱基),也可以是下面片段的不同组合的串联体,
GGNCATAAA-(GGNCATAAA)X-GGNCATAAA
GGNCACAAA-(GGNCACAAA)X-GGNCACAAA
GGNCATAAG-(GGNCATAAG)X-GGNCATAAG
GGNCACAAG-(GGNCACAAG)X-GGNCACAAG
合成后的基因DNA片段经过PCR扩增,PCR产物经过限制酶NdeI和XhoI的剪切并克隆进质粒pET30a(Merck公司,默克公司)中,转化进CaCl2法活化的大肠杆菌DH5a(Thermo-Fisher Scientific,赛默飞公司),在37℃下在LB-卡那霉素的琼脂培养基筛选阳性克隆;
然后,在LB-卡那霉素的培养液中,通过摇瓶进行培养10mL菌液,用质粒提取试剂盒(Thermo-Fisher Scientific,赛默飞公司)进行纯化质粒,如果在LB-卡那霉素的琼脂培养基筛选阳性克隆时,在串联GHK三肽的串联蛋白质的N末端或C末端连接一个亲和标签Hisx6,可更方便串联GHK三肽的基因蛋白质的纯化;
再次,通过对串联GHK三肽的表达基因进行测序鉴定和确认带有目标基因的质粒;
最后,纯化的串联GHK三肽的重组质粒,以CaCl2法转化进表达受菌体大肠杆菌BL21(DE3),在37℃下在LB-卡那霉素的琼脂培养基筛选阳性克隆,并摇瓶过夜培养后加入甘油,在-80℃保存大肠杆菌种作为工程菌种,以备后续使用;根据串联的不同数目,串联GHK三肽的重组蛋白质表达,在大肠杆菌细胞内,以胞内可溶性蛋白质和不可溶的蛋白质包涵体等形式存在;
步骤四、优化大肠杆菌的高密度培养条件:
首先,种子活化:取冻存的工程菌种,在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上划线,37℃过夜培养,挑选生长良好的单菌落,接种于50mL的LB培养液中(含50μg/mL卡那霉素),37℃培养过夜,形成种子发酵液;
其次,自动调控的发酵罐发酵:取种子发酵液,按照1%接种量,接种3.5L的LB发酵液(含50μg/mL卡那霉素),发酵条件为:37℃,控制pH在7.0左右,通过通气和搅拌转速控制溶氧在30%,种子发酵液的大肠杆菌微生物细胞在充分养料和(或)氧气供给的条件下,可以生长到很高的含量,就叫高密度培养,高密度微生物细胞培养,是增加重组蛋白质产量的重要手段之一;
步骤五、采用高特异性的蛋白酶降解将连接串联GHK三肽的基因蛋白质的肽键断裂,生成GHK三肽单体:
首先,采用BCA蛋白质浓度测定试剂盒(BCA protein Assay Kit,美国Thermo-Fisher Scientific公司(美国赛默飞公司),按照说明书步骤,以牛血清蛋白BSA为蛋白质标准,测定串联GHK三肽的重组蛋白质浓度,同时用SDS-PAGE法分析重组蛋白质的纯度,纯度至少在90%以上;
其次,在串联GHK三肽的重组蛋白质的混合液中,按照优化的酶-底物配比, 加入适量的高特异性蛋白酶如胰蛋白酶Trypsin或内肽酶Lys-C,在30℃保温过夜,产生胰蛋白酶或内肽酶Lys-C水解液,含有大量的GHK三肽的单体片段,串联蛋白质胰蛋白酶Trypsin的酶切位点在碱性氨基酸Lys(K,赖氨酸)和Arg(R,精氨酸)的C端,而内肽酶Lys-C的酶切位点在碱性氨基酸Lys(K,赖氨酸)的C端;
最后,取胰蛋白酶或内肽酶Lys-C水解液,用纯水稀释至咪唑浓度低于25mM,通过Ni离子螯合柱,去除Hisx6片段和重组Hisx6-胰蛋白酶或内肽酶Lys-C;
步骤六、分离纯化GHK三肽,可以采用现有的反相液相色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、脱盐,沉淀,冻干,喷雾干燥等办法处理,或提高GHK三肽的纯度、或去除杂质、或有利于肽的保存运输。
更优的是,步骤四与步骤五之间增加一步,优化大肠杆菌的表达产率:
当大肠杆菌生长至OD为15-30左右,加入IPTG至最终浓度为0.2-1.0mM,诱导2-8小时后下罐,离心,收集菌体。
更优的是,在优化大肠杆菌的表达产率后增加两步:
其一、高压破碎大肠杆菌:
将3.5L的高密度发酵液,低速离心后得到约800g的菌体沉淀,沉淀的菌体重新悬浮在300mL的缓冲液(20mM Tris,pH7.2,500mM NaCl,0.5mM PMSF)。加入0.1mM MgCl2和0.1mg/mL DNase I。大肠杆菌悬浮液,在700-1500bar的压力和4℃循环冷却水的条件下,通过Avestin C3高压细胞破碎机两次,收集细胞破碎液进行高速离心(美国Thermo,LYNX 4000),在50,000xg离心20分钟,收集上清液并用0.45μM的过滤膜过滤上清液;
其二、镍离子螯合亲和柱分离Hisx6标记重组蛋白质:
取细胞裂解液,加入终浓度为25mM咪唑缓冲液(pH7.6),在AKTA Pure 色谱仪(美国GE公司)上,以20mL/min的速度通过150mL的Ni-NTA柱子,用25mM咪唑(pH7.6),200mM NaCl的缓冲液平衡洗脱色谱柱,然后用3个柱体积和终浓度200mM咪唑(pH7.6)梯度洗脱GHK三肽的重组串联蛋白质。
二、以GQPR四肽基因工程生物合成完整工艺进行说明:
步骤一:设计GQPR四肽的串联表达氨基酸序列:
设计GQPR四肽的16单体串联序列(按照标准氨基酸代码)
MMRGQPRGQPRGQPRGQPRGQPRGQPRGQPRGQPRGQPRGQPRGQPRGQPRGQPRGQPRGQPRGQPRHHHHHH*
步骤二、优化氨基酸序列密码子编码:
表达载体细胞大肠杆菌E.coli的偏爱密码子:甘氨酸GGT/GGC;谷氨酰胺CAG/CAA;脯氨酸:CCG/CCA/CCT/CCC;精氨酸:CGT/CGC组氨酸:因此GQPR单体的优化密码选用GGTCAGCCGCGT和GGCCAACCACG;
步骤三、合成串联GQPR四肽的基因蛋白质:
首先,根据大肠杆菌的密码子偏爱性,将GQPRx16的核苷酸序列,设计成如SEQ ID No.2所示的目的基因,SEQ ID No.2:GQPR的16x串联体的DNA片段:
分两个核酸片段分别合成,合成后的基因片段经过PCR扩增,PCR产物经过限制酶NdeI和XhoI的剪切并克隆进质粒pET30a(Merck公司,美国默克公司)中,转化进CaCl2法活化的大肠杆菌DH5a(Thermo-Fisher Scientific,赛默飞公司),在37℃下在LB-卡那霉素的琼脂培养基筛选阳性克隆;
然后,在LB-卡那霉素的培养液中,通过摇瓶进行培养10mL菌液,用质粒提取试剂盒(Thermo-Fisher Scientific,赛默飞公司)进行纯化质粒,如果在LB-卡那霉素的琼脂培养基筛选阳性克隆时,在串联GQPR四肽的基因蛋白质的N末端或C末端连接一个亲和标签Hisx6,可更方便串联GQPR四肽的基因蛋白质的纯化;
再次,通过对串联GQPR四肽的表达基因进行测序鉴定和确认带有目标基因的质粒;
最后,纯化的串联GQPR四肽的重组质粒,以CaCl2法转化进表达受菌体大肠杆菌BL21(DE3),在37℃下在LB-卡那霉素的琼脂培养基筛选阳性克隆,并摇瓶过夜培养后加入甘油,在-80℃保存大肠杆菌种作为工程菌种,以备后续使用,此时的串联GQPR四肽的重组蛋白质根据串联的数目,在大肠杆菌细胞内,可以胞内可溶蛋白质和不可溶的蛋白质包涵体等形式存在;
步骤四、优化大肠杆菌的高密度培养条件:
首先,种子活化:取冻存的工程菌种,在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上划线,37℃培养16小时,挑选生长良好的单菌落,接种于50mL的LB培养液中(含50μg/mL卡那霉素),37℃培养过夜,形成种子发酵液;
其次,自动调控的发酵罐发酵:取种子发酵液,按照1%接种量,接种3.5L的LB发酵液(含50μg/mL卡那霉素),发酵条件为:37℃,控制pH在7.0左右,通过通气和搅拌转速控制溶氧在30%,种子发酵液的大肠杆菌微生物细胞在充分养料和(或)氧气供给的条件下,可以生长到很高的含量,就叫高密度 培养,高密度微生物细胞培养,是增加重组蛋白质产量的重要手段之一;
步骤五、采用高特异性的蛋白酶降解将连接串联GQPR四肽的基因蛋白质的肽键断裂,生成串联GQPR四肽单体:
首先,采用BCA蛋白质浓度测定试剂盒(BCA protein Assay Kit,美国Thermo-Fisher Scientific公司,美国赛默飞公司),按照说明书步骤,以牛血清蛋白BSA为蛋白质标准,测定串联GQPR四肽的重组蛋白质浓度,同时用SDS-PAGE法分析重组蛋白质的纯度,纯度至少在90%以上;
其次,在串联GQPR四肽的重组蛋白质的混合液中,加入高特异性蛋白酶如胰蛋白酶Trypsin或内肽酶Lys-C,在30℃保温过夜,产生胰蛋白酶或内肽酶Lys-C水解液,包含大量的GQPR四肽的单体片段,胰蛋白酶Trypsin的酶切位点在碱性氨基酸Lys(K,赖氨酸)和Arg(R,精氨酸)的C端,而内肽酶Lys-C的酶切位点在碱性氨基酸Lys(K,赖氨酸)的C端;
最后,取胰蛋白酶或内肽酶Lys-C水解液,用纯水稀释至咪唑浓度低于25mM,通过Ni离子螯合柱,去除Hisx6片段和重组Hisx6-胰蛋白酶或内肽酶Lys-C;
步骤六、分离纯化串联GQPR四肽可以采用现有的反相液相色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、脱盐,沉淀,冻干,喷雾干燥等办法处理,或提高GHK三肽的纯度、或去除杂质、或有利于肽的保存运输。
更优的是,步骤四与步骤五之间增加一步,优化大肠杆菌的表达产率:
当大肠杆菌生长至OD为15-30左右,加入IPTG至最终浓度为0.2-1.0mM,诱导2-8小时后下罐,离心,收集菌体。
更优的是,在优化大肠杆菌的表达产率后增加两步:
其一、高压破碎大肠杆菌:
将3.5L的高密度大肠杆菌发酵液,低速离心后得到约800g的菌体沉淀, 沉淀的菌体重新悬浮在300mL的缓冲液(20mM Tris,pH7.2,500mM NaCl,0.5mM PMSF)。加入0.1mM MgCl2和0.1mg/mL DNase I。大肠杆菌悬浮液,在700-1500bar的压力和4℃循环冷却水的条件下,通过Avestin C3高压细胞破碎机两次,收集细胞破碎液进行高速离心(美国赛默飞公司,LYNX 4000),在50,000xg离心20分钟,收集上清液并用0.45μM的过滤膜过滤上清液;
其二、镍离子螯合亲和柱分离Hisx6标记重组蛋白质
取细胞裂解液,加入终浓度为25mM咪唑缓冲液(pH7.6),在AKTA Pure色谱仪(美国GE公司)上,以20mL/min的速度通过150mL的Ni-NTA柱子,用25mM咪唑(pH7.6),200mM NaCl的缓冲液平衡洗脱色谱柱,然后用3个柱体积和终浓度200mM咪唑(pH7.6)梯度洗脱重组串联GQPR四肽的基因蛋白质。
本发明具有以下优点,
第一、采用基因工程生物合成短肽法,替代固相和液相化学合成多肽法,低成本、大规模地合成小肽,如本发明所述的GHK和GQPR,每升发酵液可以获得10-200g重组蛋白质,经过胰蛋白酶降解后,可以回收90%左右的肽单体。通过基因工程的方法,可以容易扩大发酵的规模,在发酵规模扩大到100L后,即可实现公斤级别以上的多肽合成。
第二、制造快速:大肠杆菌的繁殖速度非常迅速,在适宜的培养条件下,细胞大约20分钟繁殖一代,因此批次发酵时间基本在24小时之内。在化学物质的诱导下,转基因大肠杆菌能够迅速和大量生产地生产重组蛋白质,重组蛋白质的含量甚至可以接近50%的总蛋白质量。本发明中,每升发酵液能产生大约10g左右的可溶性串联蛋白质。如果能够实现重组蛋白质形成不可溶的包涵体, 可以得到数倍更多的不溶性串联蛋白质。
第三、成本低:
<110>天演益合(厦门)生物技术有限公司
<120>一种活性短肽基因工程生物合成工艺
<160>4
<211>88
<212>PRT
<213>人工合成
<400>
Met Met Arg
Gly His Lys Arg Gly His Lys Arg Gly His Lys Arg
1
5 10 15
Gly His Lys Arg Gly His
Lys Arg Gly His Lys Arg Gly His Lys
20 25 30
Arg Gly His Lys Arg Gly His Lys Arg Gly His Lys Arg Gly His
35 40 45
Lys Arg Gly
His Lys Arg Gly His Lys Arg Gly His Lys Arg Gly
50 55 60
His Lys Arg Gly
His Lys Arg Gly His Lys Arg Gly His Lys Arg
65 70 75
Gly His Lys Arg Gly His
Lys His His His His His His
80 85 88
<211>194
<212>DNA
<213>人工合成
<400>
gcgccatatg atgcgtggtc ataaaggtca
taaaggtcat aaaggtcata aaggtcataa 60
aggtcataaa ggtcataaag gtcataaagg
tcataaaggt cataaaggcc acaagggcca 120
caagggccac aagggccaca agggccacaa
gggccacaagg gccacaaggg ccacaagggc 180
cacaagggcc acaagctcga gtag 194
<211>73
<212>PRT
<213>人工合成
<400>
Met Met Arg
Gly Gln Pro Arg Gly Gln
Pro Arg Gly Gln Pro Arg
1
5 10 15
Gly Gln Pro Arg Gly Gln Pro Arg
Gly Gln Pro Arg Gly Gln
Pro
20 25 30
Arg Gly Gln Pro Arg Gly Gln
Pro Arg Gly Gln Pro Arg Gly
Gln
35 40 45
Pro Arg Gly
Gln Pro Arg Gly Gln Pro Arg
Gly Gln Pro Arg Gly
50 55 60
Gln Pro Arg Gly Gln Pro Arg His His His His
His His
65 70 73
<211>216
<212>DNA
<213>人工合成
<400>
gcgccatatg atgcgtggtc agccgcgtgg
tcagccgcgt ggtcagccgc gggtcagccg 60
cgtggtcagc cgcgtggtca gccgcgtggt
cagccgcgtg gtcagccgcg tggccaacca 120
cgcggccaac cacgcggcca accacgcggc
caaccacgcg gccaaccacg cggccaacca 180
cgcggccaac cacgcggcca accacgcctc
gagtag 216
Claims (5)
1.一种活性短肽基因工程生物合成工艺,其特征在于:包括下述步骤:
步骤一、设计活性短肽的串联表达氨基酸序列;
步骤二、优化氨基酸序列密码子编码;
步骤三、人工合成基因,导入原核或真核微生物细胞,利用微生物细胞的蛋白质合成系统,产生大量的活性短肽的串联体,活性短肽串联蛋白质根据串联的数目,在微生物细胞内以可溶的蛋白质或蛋白质包涵体形式存在;
步骤四、将转基因原核或真核微生物细胞在充分养料或氧气供给的条件下进行高密度培养,化学诱导蛋白质表达,以增加活性短肽串联蛋白质重组的产率;
步骤五、采用高特异性的蛋白酶降解重组蛋白质,产生活性短肽单体片段;
步骤六、分离纯化酶降解活性短肽单体片段。
2.如权利要求1所述的一种活性短肽基因工程生物合成工艺,其特征在于:所述的步骤四与步骤五之间增加一步,优化微生物细胞的重组串联蛋白质的表达产率。
3.如权利要求2所述的一种活性短肽基因工程生物合成工艺,其特征在于:所述的优化微生物细胞的表达产率后增加两步:
其一、高压破碎微生物细胞,
其二、镍离子螯合亲和柱分离Hisx6标记重组蛋白质。
4.如权利要求1所述的一种活性短肽基因工程生物合成工艺,其特征在于:所述的活性短肽为GHK三肽和GQPR四肽。
5.如权利要求1所述的一种活性短肽基因工程生物合成工艺,其特征在于:所述的高特异性的蛋白酶为胰蛋白酶或内肽酶Lys-C。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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