CN108165570A - 一种利用蛋白质酶切位点形成包涵体并制备小肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用蛋白质酶切位点形成包涵体并制备小肽的方法，利用基因工程技术将识别序列为芳香族氨基酸的蛋白酶酶切位点分别置于目标小肽的两端，通过提高最终表达蛋白质中的芳香族氨基酸含量促使蛋白质以包涵体形式表达；通过包涵体形式低成本获得目标蛋白质，将蛋白质变性处理后利用选定的蛋白酶进行切割，从酶切产物中分离纯化获得目标功能小肽。将蛋白质酶切技术与包涵体技术整合，降低功能小肽的生产成本，为功能小肽的产业开发提供可行之路。

Description

一种利用蛋白质酶切位点形成包涵体并制备小肽的方法
技术领域
本发明涉及蛋白质与多肽领域，特别涉及一种利用蛋白质酶切位点形成包涵体并制备小肽的技术。
背景技术
小肽由几个或几十个氨基酸构成，功能多样，如可以降低人血压的降压肽、可以达到美容效果的美容肽、可以抑制细菌生长的抗菌肽等。随着研究的不断深入，肽的种类与功能不断丰富，一系列基于肽的药物、保健品、食品添加剂、疫苗不断形成，肽相关产业不断强大。
肽的生产制备方法主要有两大类：一是化学法，利用多肽合成仪或手工制备克级甚至是千克级的肽，制备成本高昂，因为化学法制备多肽所用材料必须是功能基团保护后的氨基酸，必须对氨基酸中的功能基团进行保护并且合成后还要去除保护基团。第二种方法是生物法，利用细菌直接发酵制备功能小肽，通过细菌发酵生产小肽的成本低，但是从细菌中分离纯化出功能小肽的分离成本高。
发明内容
本发明目的是解决现有生物法生产小肽技术中小肽分离纯化成本高的生产难题，提供了一种利用蛋白质酶切位点形成包涵体并制备小肽的方法。
本发明的发明构思是：蛋白质包涵体技术可以大量生产目标蛋白质，分离纯化非常容易，但蛋白质产物没有活性，不能直接应用；所以蛋白质包涵体技术生产蛋白质时总是要面对蛋白质复性难题。但是，小肽生产与蛋白质生产不同，从多肽链中制备小肽只需要多肽链的完整，不关注多肽链的功能有无，只要多肽链中的氨基酸排列顺序正确，就可以切割多肽链获得目标小肽。
本发明选择以芳香族氨基酸为识别序列的蛋白酶酶切位点，将选定的酶切位点的编码序列与目标小肽的编码序列串联在一起，利用绿色荧光蛋白与芳香族氨基酸进行空间结构重组并促使目标小肽串联体以包涵体形式表达；通过包涵体技术低成本大量获得包含有目标小肽的多肽链，再加入适宜的蛋白酶对包涵体变性后的多肽链进行蛋白酶酶切降解，通过蛋白酶在目标小肽两侧进行切割从多肽链中释放目标小肽。
本发明的技术方案如下：一种利用蛋白质酶切位点形成包涵体并制备小肽的方法，包括以下步骤：
S1根据生物学遗传密码设计目标小肽的编码序列，将含芳香族氨基酸的蛋白酶识别与切割位点的氨基酸编码序列分别置于目标小肽的两端，组成小肽编码单元。
S2将设计好的小肽编码单元串联在一起，小肽编码单元可以相同也可以不同，串联的小肽编码单元再与荧光蛋白基因连接在一起获得融合基因，其中，串联小肽单元与荧光蛋白基因之间不使用长间隔序列，保证包涵体形成。
S3将融合基因与大肠杆菌表达载体进行重组，转化大肠杆菌并优化表达条件使融合基因以包涵体形式表达，通过包涵体分离获得含有目标小肽的多肽链。
S4将含有目标小肽的多肽链用蛋白酶进行氨基酸序列切割，从酶切产物中分离纯化获得目标小肽。
所述的步骤S2，在串联小肽编码单元之间可增加芳香族氨基酸的编码序列。
优选地，所述蛋白酶为可以回收重复利用的固定化酶，可以在氨基酸的N端切割的蛋白酶如内肽酶Asp-N、可以在氨基酸C端切割的蛋白酶如糜蛋白酶，也可以是能够完成以上切割目标的其他蛋白酶。
优选地，荧光蛋白基因为绿色荧光蛋白基因。
本发明通过芳香族氨基酸的蛋白酶酶切位点的编码序列与目标小肽的编码序列串联在一起，利用绿色荧光蛋白与芳香族氨基酸进行空间结构重组并促使目标小肽串联体以包涵体形式表达；通过包涵体技术获得多肽链，再从多肽链中通过蛋白酶酶切释放目标小肽。本发明的制备方法简单，易操作，有效降低功能小肽的生产成本，为功能小肽的研究开发提供新思路。
附图说明
图1为本发明实施例1融合蛋白检测图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述。以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。本发明所应用的化学试剂以及仪器如未经特别说明，均可从商业渠道购买。
实施例1
选择长度不同的小肽(WSKVVL、IY、IVGRPRHEE、GDIGY、IKP、CF、IWH、VIF、LKP、SKVPP、EY、VAWKL、GPL、IW，氨基酸均用单字母表示，以下同)，在小肽的两侧分别添加可用于后续多肽链切割的蛋白酶酶切位点，酶切位点一定要含有芳香族氨基酸，结果为(FWSKVVLD、FIY、FIVGRPRHEED、DIGY、FIKPD、FCF、FIWHD、FVIF、FLKPD、FSKVPPD、FEY、FVAWKLD、FGPLD、FIWD)，其中：苯丙氨酸F可以在其羧基一端用糜蛋白酶切割，天冬氨酸D可以利用内肽酶Asp-N在其氨基端进行切割，利用以上两种蛋白酶配合切割可以获得处于苯丙氨酸F的羧基侧且处于天冬氨酸D的氨酸侧的小肽。将以上小肽的编码序列直接连接或加入间隔序列进行连接构成小肽串联重组体，为优化序列切割过程可以在小肽基因之间加入多肽链的羟胺的化学切割位点NG。
利用大肠杆菌遗传密码表设计以上肽段的编码基因，基因序列与氨基酸的对应情况如下：
序列中含有三个限制性核酸内切酶位点：BamHI、SacI、HindIII。可以利用以上位点进行基因重组。
利用基因重组技术把小肽的串联基因与荧光蛋白基因连接在一起，本实施例中选择绿色荧光蛋白。通过大肠杆菌表达载体pET28a上的三个限制性核酸内切酶位点：BamHI、SacI、HindIII完成串联小肽基因与绿色荧光蛋白基因的重组。构建完成的大肠杆菌表达载体pET28a中可编码的多肽序列如下：
其中，双下划线部分是绿色荧光蛋白的氨基酸序列，加粗加下划线的部分是增添的芳香族氨基酸，目标小肽可以通过序列组成直接读出不再单独标注。
通过原核表达载体pET28a将融合基因在大肠杆菌细胞中表达，利用his-tag抗体进行Westernblotting检测融合蛋白，结果如图1所示(图1a中，M为Marker，1为诱导上清，2为诱导沉淀，3为未诱导上清，4为未诱导沉淀；图1b中，M为Marker，1为诱导上清，2为诱导沉淀)。杂交检测结果表明，表达的融合蛋白在诱导后沉淀中，目标小肽以包涵体形式表达，通过差速离心法收获包涵体，
分离纯化的包涵体利用煮沸法变性将折叠的多肽链打开，冷却到室温后，先用糜蛋白酶进行多肽链的切割，在芳香族氨基酸的羧基端位置上将多肽链切断，通过离心方法去除沉淀，上清用内肽酶Asp-N在天冬氨酸的氨基端进行切割，释放出目标小肽。小肽利用HPLC(高效液相色谱技术)进行分离纯化，获得目标产品。
实施例2
以目标小肽IKP为例，通过多次串联重复获得目标小肽的技术方案如下：在目标小肽IKP的两侧设计蛋白酶的酶切位点并尽可能增添芳香族氨基酸，本实施例的选择结果为YFIKPDFCF，在IKP的羧基端加上天冬氨酸，在IKP的氨酸加上苯丙氨酸，在未来获取多肽链后，可以利用糜蛋白酶和内肽酶Asp-N将目标小肽从包涵体的变性后获得的多肽链中切割出来。其他的氨基酸是为了促进融合基因以包涵体形式表达。
将以上小肽编码单元重复九次串联后与绿色荧光蛋白重组，构建完成的大肠杆菌表达载体pET28a中可编码的多肽序列如下：
其中，侧端增加芳香族氨基酸的小肽(YFIKPDFCF)重复了九次(见斜体字母和点划线部分)，并且在重复序列中增加了羟胺的切割位点NG(见下划线部分)，绿色荧光蛋白的氨基酸序列见双下划线部分，在融合蛋白的两端均设计了组氨酸标签(见波浪线部分)。
利用基因工程技术与蛋白质包涵体技术获得纯化后的多肽链，先用羟胺水解多肽链释放出多肽链中不含小肽序列的肽段，这部分肽链有组氨酸标签可以通过组氨酸标签将此部分肽链分离除去，从而获得仅含有小肽重复序列的肽段(小肽串联体)。再用固定化的N端切割酶进行小肽串联体，分离出切割产物，最后用固定化的糜蛋白酶进行切割，去除固定化的糜蛋白酶和多肽链上水解下来的氨基酸，可以获得目标小肽。
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种利用蛋白质酶切位点形成包涵体并制备小肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.设计目标小肽编码序列，将编码芳香族氨基酸的序列分别置于目标小肽的两端，组成小肽编码单元；
S2.将小肽编码单元串联在一起，串联的小肽编码单元再与荧光蛋白基因连接在一起获得融合基因，其中，串联小肽单元与荧光蛋白基因之间不使用长间隔序列；
S3.将融合基因与大肠杆菌表达载体进行重组，转化大肠杆菌并优化表达条件使融合基因以包涵体形式表达，通过包涵体分离获得含有目标小肽的多肽链；
S4.将含有目标小肽的多肽链用蛋白酶进行氨基酸序列切割，在酶切产物中分离纯化目标小肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，在串联小肽编码单元之间可增加芳香族氨基酸的编码序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，将包涵体变性处理并利用蛋白酶水解变性后的包涵体从而释放出多肽链。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，荧光蛋白基因为绿色荧光蛋白基因。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中多肽链切割所用蛋白酶为固定化酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4所述蛋白酶为糜蛋白酶或内肽酶Asp-N。
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