TW201829774A - 用以製備目標蛋白的表現構建體與方法 - Google Patents
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Abstract
本揭示內容關於一種表現構建體以及用於製備目標蛋白的方法。依據某些實施方式，該表現構建體包含一用以編碼一融合蛋白的核苷酸序列。為了製備目標蛋白，將表現建構體轉形至宿主細胞中，並在適合表現該融合蛋白的條件下培養該宿主細胞。該融合蛋白具有至少一個表現單元；每一表現單元依序具有一親和標籤部、一間隔部、一酵素切割位點以及一目標蛋白部。從宿主細胞分離、溶解以及再重疊該融合蛋白。切割再重疊的融合蛋白以釋放目標蛋白。
Description
相關申請案之交互參照
本發明主張美國專利臨時申請案於2017年1月18日申請之第62/447,452號之優先權，該申請案之完整內容納入為本發明專利說明書的一部分以供參照。
本發明是關於目標蛋白的製備方法，特別是作為治療性胜肽的目標蛋白的製備方法。
治療性蛋白或胜肽佔目前市面上所銷售的生物製品(biological product，也稱為生物製劑(biologics))之大宗。一般而言，治療性蛋白包含抗體系藥物、Fc融合蛋白、生長因子、激素、介白素、抗凝血劑、血液因子、工程蛋白支架以及溶血栓藥劑(thrombolytic)。自1982年人類胰島素經核准後，已有超過100種重組治療性蛋白核准應用於美國與歐盟臨床研究。
與化學合成且其結構已知的小分子藥物不同，大多數治療性蛋白以及其他生物製劑都是不易被辨識或特性化的混雜混合物。生物製品(包括那些藉由重組技術生產的製品)多對熱具有敏感性，且容易受到微生物感染，因此，製備生物製品的條件會較製造小分子藥物更為嚴格。
製備治療性蛋白包含生產原料藥物(bulk drug substance)及藥物產品等多項步驟。通常先以表現構建體在微生物細胞(例如原核生物)中生產蛋白產物。之後再藉由大規模的蛋白質生產流程(例如發酵及細胞培養)於原核細胞中製備該些蛋白產物。該蛋白質產物經純化及緩衝劑交換處理後，可作為原料藥物來儲存。可以直接填充該原料藥物、或以緩衝液及賦形劑、稀釋或複合該原料藥物，據以製成最終的藥物製劑，之後將該藥物製劑填充或包裝至合適的容器以製成藥物產品。
後續的生物製劑(亦稱為生物仿製藥)是基於與FDA核准的生物製品(即：參考製品)具高度相似性而被核准的產品，就安全性及功效而言，生物製劑與參照產品並不具有臨床意義上的差異。
對治療性蛋白的需求已經促使其製備過程的不斷創新。然而，對於後續生物製劑的製備過程幾乎沒有可以改善的餘地。這是因為在臨床上，只有生物仿製藥產品中的非活性成分被容許可具有微小差異。舉例來說，表現系統的種類將影響可能存在於蛋白質產物中的流程相關及產物相關物質、雜質及汙染物(包含潛在的外源試劑)的種類。據此，盡可能地減少用於製備參考產品及生物仿製藥之表現系統之間的差異，在生物仿製藥產品的生產中通常是相當關鍵的。
鑑於上述情況，相關領域亟需一種用於製備目標蛋白(例如與FDA核准之生物製品高度相似的蛋白質藥物)的方法。
為了給讀者提供基本的理解，以下提供本揭示內容的簡要發明內容。此發明內容不是本揭示內容的廣泛概述，同時非用來識別本發明的關鍵/必需元件或勾勒本發明的範圍。其唯一目的是以簡化的概念形式呈現本揭示內容的一些概念，以作為呈現於後文中更詳細描述的序言。
本揭示內容的一態樣是關於用以製備一目標蛋白的新穎表現構建體。特別是，現有的表現構建體採用一新穎的間隔部。本揭示內容的表現構建體的優點在於，它提供了其他製造商目前所使用的表現構建體的一個替代方案，同時產生與現有產品高度相似的目標蛋白。
根據本揭示內容的一些實施方式，表現構建體包含一用以編碼融合蛋白的核苷酸序列，其中該融合蛋白依序包含一親和標籤部、一間隔部、一酵素切割位點以及一目標蛋白部。
在某些實施方式中，表現單元可更包含一啟動子，其係位於該用以編碼融合蛋白之核苷酸序列的上游。
根據特定實施方式，該間隔部包含序列編號：2的胺基酸序列。在某些實施方式中，該間隔部由序列編號：2的胺基酸序列組成。
根據非必要的實施方式，目標蛋白包含序列編號：4、5、6或16的胺基酸序列。舉例來說，目標蛋白係選自由序列編號：4、5、6及16的胺基酸序列所組成之群組。
根據特定的實施方式，親和標籤部為一幾丁質結合域(chitin binding domain，CBD)-內含肽(intein)。舉例來說，該CBD-內含肽包含序列編號：1的胺基酸序列。在某些實施方式中，CBD-內含肽由序列編號：1的胺基酸序列組成。
根據某些實施方式，酵素切割位點是一菸草蝕刻病毒(tobacco etch virus，TEV)切割辨識位點。 舉例來說，TEV切割辨識位點包含序列編號：3的胺基酸序列。在某些實施方式中，TEV切割辨識位點是由序列編號：3之胺基酸序列所組成。
根據某些實施方式，融合蛋白包含序列編號：7或8的胺基酸序列。
本揭示內容的另一態樣是關於用以製備一目標蛋白的表現系統。
根據本揭示內容的特定實施方式，表現系統包含一宿主細胞以及一表現構建體，該表現構建體包含一用以編碼融合蛋白的核苷酸序列，其中該融合蛋白依序包含一親和標籤部、一間隔部、一酵素切割位點以及一目標蛋白部。
根據特定實施方式，該間隔部包含序列編號：2的胺基酸序列。在某些實施方式中，該間隔部由序列編號：2的胺基酸序列組成。
根據非必要的實施方式，目標蛋白包含序列編號：4、5、6或16的胺基酸序列。舉例來說，目標蛋白係選自由序列編號：4、5、6及16的胺基酸序列所組成之群組。
根據特定的實施方式，親和標籤部為一CBD-內含肽。舉例來說，該CBD-內含肽包含序列編號：1的胺基酸序列。在某些實施方式中，CBD-內含肽由序列編號：1的胺基酸序列組成。
根據某些實施方式，酵素切割位點是一TEV切割辨識位點。 舉例來說，TEV切割辨識位點包含序列編號：3的胺基酸序列。在某些實施方式中，TEV切割辨識位點是由序列編號：3之胺基酸序列所組成。
根據某些實施方式，融合蛋白包含序列編號：7或8的胺基酸序列。
根據一些實施方式，宿主細胞為原核細胞，像是大腸桿菌(Escherichia. coli
)細胞。
本揭示內容的又另一態樣是關於能夠製備多份(multiple copies)目標蛋白的新穎表現構建體。特別是，現有的表現構建體採用一新穎的間隔部。本揭示內容之表現構建體更優勢在於，它實質上增加目標蛋白的產量。進一步，透過根據本揭示內容之前述態樣的新穎載體設計方案，可使藉由此載體製備的目標蛋白與現有的產品高度相似。
根據本揭示內容的某些實施方式，表現構建體包含兩個或更多表現單元，其中每一表現單元包含一用以編碼融合蛋白的核苷酸序列。其中該融合蛋白依序包含一親和標籤部、一間隔部、一酵素切割位點以及一目標蛋白部。
在某些實施方式中，每一表現單元可更包含一啟動子，其係位於該用以編碼融合蛋白之核苷酸序列的上游。
根據特定實施方式，該間隔部包含序列編號：2的胺基酸序列。在某些實施方式中，該間隔部由序列編號：2的胺基酸序列組成。
根據非必要的實施方式，目標蛋白包含序列編號：4、5、6或或16的胺基酸序列。舉例來說，目標蛋白係選自由序列編號：4、5、6及16的胺基酸序列所組成之群組。
根據特定的實施方式，親和標籤部為一CBD-內含肽。舉例來說，該CBD-內含肽包含序列編號：1的胺基酸序列。在某些實施方式中，CBD-內含肽由序列編號：1的胺基酸序列組成。
根據某些實施方式，酵素切割位點是一TEV切割辨識位點。 舉例來說，TEV切割辨識位點包含序列編號：3的胺基酸序列。在某些實施方式中，TEV切割辨識位點是由序列編號：3之胺基酸序列所組成。
根據某些實施方式，融合蛋白包含序列編號：7或8的胺基酸序列。
本揭示內容的另一態樣是關於用以製備一目標蛋白的表現系統。
根據本揭示內容的特定實施方式，表現系統包含一宿主細胞以及一表現構建體，該表現構建體包含一用以編碼融合蛋白的核苷酸序列，其中該融合蛋白依序包含一親和標籤部、一間隔部、一酵素切割位點以及一目標蛋白部。
根據特定實施方式，該間隔部包含序列編號：2的胺基酸序列。在某些實施方式中，該間隔部由序列編號：2的胺基酸序列組成。
根據非必要的實施方式，目標蛋白包含序列編號：4、5、6或或16的胺基酸序列。舉例來說，目標蛋白係選自由序列編號：4、5、6及16的胺基酸序列所組成之群組。
根據特定的實施方式，親和標籤部為一CBD-內含肽。舉例來說，該CBD-內含肽包含序列編號：1的胺基酸序列。在某些實施方式中，CBD-內含肽由序列編號：1的胺基酸序列組成。
根據某些實施方式，酵素切割位點是一TEV切割辨識位點。 舉例來說，TEV切割辨識位點包含序列編號：3的胺基酸序列。在某些實施方式中，TEV切割辨識位點是由序列編號：3之胺基酸序列所組成。
根據某些實施方式，融合蛋白包含序列編號：7或8的胺基酸序列。
根據一些實施方式，宿主細胞為原核細胞，像是大腸桿菌細胞。
本揭示內容又另一個態樣係關於用以製備一目標蛋白的方法。 具體來說，本發明使用根據本揭示內容前述態樣之實施方式的新穎表現構建體。據此，本揭示內容的一些實施方式提供可替代其他製造者使用的製程的製備方法，同時維持目標蛋白與從其他來源取得的產物之間的相似度。舉例來說，在目標蛋白是一蛋白的情況下，就一級、二級、三級及/或四級結構、後轉譯修飾以及功能活性而言，本揭示內容製備的蛋白與參考蛋白是高度相似。
根據本揭示內容的一實施方式，該製備方法包含(a)提供根據前述態樣之任何實施方式的一表現構建體；(b)將表現構建體轉形至一宿主細胞，並在允許表現該融合蛋白的條件下培養該宿主細胞；(c)破碎該宿主細胞以得到含有一可溶性分液及一不可溶性分液的細胞破碎物；(d)非必要地，純化該不可溶性分液，以得到一經純化的不可溶性分液；(e)溶解步驟(c)之該不可溶性分液或步驟(d)之該經純化的不可溶性分液，藉以得到一經溶解的融合蛋白；(f)將該經溶解的融合蛋白懸浮於一復性緩衝液中，藉此使該經溶解的融合蛋白進行再摺疊(refold)，以得到一再摺疊融合蛋白；以及(g)對該再摺疊融合蛋白的酵素切割位點進行切割。
根據某些實施方式，是使用對一親和標籤部具專一性的親和管柱(例如幾丁質管柱)來進行步驟(d)。
根據一些實施方式，宿主細胞為原核細胞，像是大腸桿菌細胞。
本揭示內容的又另一態樣是關於具有多份目標蛋白的表現載體。所述表現載體可用於製造提高的目標蛋白產量。
根據本揭示內容的實施方式，表現構建體包含一表現單元，其中每一表現單元包含用以編碼融合蛋白的核苷酸序列；其中該融合蛋白包含兩個目標蛋白部，以及一自我切割胜肽或一催化切割蛋白，其中該自我切割胜肽或該催化切割蛋白係插在所述兩個目標蛋白部之間。
根據本揭示內容的一些非必要實施方式，自我切割胜肽或催化切割蛋白包含序列編號：17的胺基酸序列。
根據非必要的實施方式，目標蛋白包含序列編號：4、5、6或或16的胺基酸序列。舉例來說，目標蛋白係選自由序列編號：4、5、6及16的胺基酸序列所組成之群組。
在非必要的實施方式中，每一表現單元可更包含一啟動子，其位於該用以編碼融合蛋白之核苷酸序列的上游。
根據本揭示內容的某些實施方式，該表現構建體包含兩個表現構建體。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
為了便於說明，此處統整性地說明本說明書、實施例以及後附的申請專利範圍中所記載的特定術語。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。
在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」(at least one)與「一或更多」(one or more)等表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本說明書與申請專利範圍中，「A、B及C其中至少一者」(at least one of A, B and C)、「A、B或C其中至少一者」(at least one of A, B, or C)以及「A、B和/或C其中至少一者」(at least one of A, B and/or C)係指涵蓋了僅有A、僅有B、僅有C、A與B兩者、B與C兩者、A與C兩者、以及A、B與C三者。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」(about)通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
對本揭示內容的所有核苷酸及胺基酸序列來說，應當理解的是該些均等核苷酸及胺基酸序列可在不影響該胺基酸序列之功能的前提下被取代。該些取代作用可被本領域技術具有通常知識者理解。
本揭示內容中，「蛋白」(protein)一詞意旨在包含全長天然蛋白質或其片段的胺基酸序列，該些胺基酸序列則受到不明顯改變該天然蛋白質的特定性質的修飾。
本揭示內容使用的「表現構建體」(expression construct)一詞是指含有一所需編碼序列及使其在特定宿主生物中表現有效連接編碼序列必需的合適核酸序列。在原核生物表現系統中表現必需的核酸序列是本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的。
「酵素切割位點」(enzymatic cleavage site)是指一特定胺基酸序列，其可使含有此序列的蛋白質或胜肽被選定的蛋白酶切割。
本揭示內容使用的「融合蛋白」(fusion protein)一詞是指包含來自至少兩種不同蛋白質的蛋白結構域的一種雜合多肽。本揭示內容使用的「目標蛋白」(protein of interest)一詞是指胜肽的表現是在雜合多肽中期望的胜肽。本揭示內容使用的「親和標籤部」(affinity tag moiety)一詞是指一種胜肽，其能夠與一特定的配位基發生一特定交互作用。
本揭示內容使用的「宿主細胞」(host cell)一詞包含可用於表現本揭示內容之融合蛋白或其片段的任何細胞系統。合適的宿主細胞包含原核細胞微生物(例如大腸桿菌)。
本揭示內容之目的在於製備目標蛋白。為此，本揭示內容提供一種新穎表現構建體。可以理解的是，包含前述表現構建體的表現系統也被包含在本揭示內容的範圍中。此外，本揭示內容的一些實施方式提供可替代其他製造者使用的製程之製備方法，同時維持目標蛋白與從其他來源取得的產物兩者之間的相似度。舉例來說，目標蛋白可以是一蛋白，且在此情況下，就一級、二級、三級及/或四級結構、後轉譯修飾以及功能活性而言，本揭示內容生產的蛋白可與參考蛋白的高度相似。
根據本揭示內容的實施方式，該方法包含以下步驟。以下也同時闡述本揭示內容方法使用的表現構建體以及表現系統。
首先，提供包含至少一表現單元的一表現構建體。每一個表現單位包含一用以編碼融合蛋白的核苷酸序列。簡言之，先合成用以編碼融合蛋白的核苷酸序列或其部分，接著使用專門設計用於在後續的選殖步驟中引入限制切位的引子擴增該核苷酸序列或其部分。接著，將擴增後的核苷酸轉殖入受合適啟動子調控的表現載體內。可依據宿主細胞的種類、於宿主細胞內所欲產生之表現及後轉釋特性來挑選表現載體。舉例來說，在某些情況，宿主細胞為大腸桿菌，而表現載體為pTWIN載體。
根據本揭示內容的實施方式，融合蛋白依序包含：親和標籤部、間隔部、酵素切割位點以及目標蛋白部。
在某些表現構建體包含多個表現單元的情況中，每一個表現單元具有啟動子，其位於用以編碼融合蛋白之核苷酸序列的上游。
引入親和標籤部，藉此可從宿主細胞表現的內源性蛋白質中將目標蛋白純化出來。根據特定的實施方式，親和標籤部為一幾丁質結合域(CBD)-內含肽。然而，本揭示內容並不以此為限；反之，應當理解的是，也可使用其他純化的標籤(像是組胺酸標籤(His-tag))取代CBD來介導後續親和純化作用。根據本揭示內容的實施方式，CBD-內含肽包含序列編號：1的胺基酸序列。在某些實施方式中，CBD-內含肽由序列編號：1的胺基酸序列組成。
間隔部為介於親和標籤部及酵素切割位點之間的一段胺基酸殘基。根據本揭示內容的特定實施方式，間隔部包含一脯胺酸(P)殘基，依序連接由甘胺酸(G)及絲胺酸(S)殘基組成的一機動(flexible)胜肽。舉例來說，間隔部可具有P(GGGGS)2 的胺基酸序列(序列編號：2)。根據本揭示內容的實施方式，間隔部的參與可改善後續酵素切割步驟的切割效率。
酵素切割位點可使融合蛋白接受酵素切割作用，藉此可將目標蛋白從其餘融合蛋白分離出來。根據某些實施方式，酵素切割位點是一菸草蝕刻病毒(TEV)切割辨識位點。TEV蛋白酶可辨識一般式為E-Xaa-Xaa-Y-Xaa-Q-(G/S)的線性表位，並在Q及G或Q及S之間進行切割作用。根據本揭示內容的實施方式，TEV切割辨識位點包含胺基酸序列ENLYFQ的胺基酸序列(序列編號：3)。在某些實施方式中，TEV切割辨識位點是由序列編號：3之胺基酸序列所組成。應當理解的是，在某些實施方式中，目標蛋白為一蛋白質，其第一胺基酸殘基為絲胺酸或甘胺酸。如此一來，切割作用將會發生在TEV切割辨識位點的最後一個殘基及該蛋白質的第一殘基之間。在某些實施方式中，該蛋白質的第一胺基酸殘基不為絲胺酸也不為甘胺酸；然而，在TEV切割辨識位點的最後一個殘基及該蛋白質的第一殘基之間仍會發生切割作用。
根據本揭示內容的實施方式，目標蛋白可為任何蛋白質。在某些實施方式中，蛋白質為治療蛋白質。更具體來說，所製備的蛋白質可作為生物仿製藥產品中的活性成分。僅為例示，目標蛋白可為重組副甲狀腺激素(例如：特立帕肽(teriparatide))或一類升糖素胜肽-1受體促效劑(glucagon-like peptide-1 receptor agonist)(例如：利拉魯肽(liraglutide))。舉例來說，本發明方法製備的蛋白包含如序列編號：4、5、6或16的胺基酸序列。在某些實施例中，蛋白是選自由序列編號：4、5、6及16所組成之群組。
根據本揭示內容之實施方式，可透過本領域習知之各種方法將表現載體引入宿主細胞中，以製備表現系統。根據一些實施方式，宿主細胞為原核細胞，例如大腸桿菌細胞。一旦表現載體被引入合適的宿主細胞中，可在能夠表現融合蛋白的條件下培養宿主細胞。舉例來說，可在特定培養基與溫度條件下培養宿主細胞。培養基可以是營養培養基(nutrient medium)、基本培養基(minimal medium)、選擇性培養基(selective medium)、鑑別性培養基(differential medium)或滋補培養基(enriched medium)。宿主細胞的生長及表現溫度可從4°C至45°C；較佳地可從30°C至39°C。
接著由宿主細胞分離融合蛋白。根據本揭示內容的某些實施方式，破碎宿主細胞以得到包含可溶性分液及不可溶性分液的細胞破碎物。在某些非必要的實施方式中，可使用對親和標籤部具專一性的親和管柱來進一步純化不可溶性分液，藉此得到經純化的不可溶性分液。應當理解的是，本揭示內容之發明不應受上述的純化方法限制；相反地，任何其他合適的純化技術均可用於本發明。
接著，溶解不可溶性分液或該步驟得到之經純化的不可溶性分液，以得到經溶解的融合蛋白。舉例來說，可藉由變性溶液(denaturing solution)(例如：胍鹽酸鹽(guanidine hydrochloride)或尿素)處理不可溶性分液或經純化的不可溶性分液，藉以變性及溶解包含在該分液內的融合蛋白。
接著，於再摺疊步驟中，透過稀釋或透析的方式，將經溶解的融合蛋白懸浮於復性緩衝液(renaturation buffer)中，藉此可使融合蛋白得到其天然的、具生物活性的構形。非必要性地，可透過濃度及色層分析法由其他異常摺疊產物中分離再摺疊的融合蛋白。
接著，以蛋白酶切割摺疊融合蛋白中的酵素切割位點，藉以釋放目標蛋白。
本揭示內容的另一態樣是關於包含多份目標蛋白部的表現載體。
根據本揭示內容的實施方式，表現構建體包含一表現單元，該表現單元包含用以編碼融合蛋白的核苷酸序列，其中該融合蛋白包含兩個目標蛋白部，以及插在所述兩個目標蛋白部之間的自我切割胜肽或催化切割蛋白。
在此情況中，每個表現單元可更包含一啟動子，其位於用以編碼融合蛋白的核苷酸序列之上游。換句話說，兩份(two copies)目標蛋白部是受到單一啟動子調控。特別是在表現構建體包含兩個或更多表現單元的情況中，每個表現單元可包含其自身的啟動子。
藉由挑選合適的自我切割胜肽或催化切割蛋白，使用此表現載體製備的多份目標蛋白部可具有相同的胺基酸序列。由於蛋白質胺基酸序列的微小差異都可能顯著地惡化藥品產物的治療效果，因此前述特徵對於用於製備藥物產品的蛋白質具有優異的優點。
舉例來說，催化切割蛋白可以是一巰基誘導(thiol-induced)切割蛋白。根據本揭示內容的一些非必要實施方式，自我切割胜肽或催化切割蛋白包含序列編號：17的胺基酸序列。
根據本揭示內容的特定實施方式，每個目標蛋白部係選自由序列編號：4、5、6及16所組成之群組。
下文提出多個實施例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明。不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信本發明所屬技術領域的通常知識者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。
材料與方法
PCR擴增以及選殖可編碼融合蛋白的核苷酸
透過PCR方法，以序列編號：10及11、序列編號：12及13以及序列編號：14及15的引子對分別對用於表現CBD-內含肽-特立帕肽融合蛋白(序列編號：9)、CBD-內含肽-間隔(S)-TEV切割辨識位點(TEV切位)-特立帕肽融合蛋白(序列編號：7)以及CBD-內含肽-S-TEV切位-利拉魯肽融合蛋白(序列編號：8；LX1)的目標基因進進行擴增，藉以引入Sap I及Pst I限制位。使用與表現LX1相同的方法擴增用於表現含有2份或3份CBD-內含肽-S-TEV切位-利拉魯肽(LX2或LX3)之融合蛋白的目標基因。
接著使用IMPACT™ kit (NEB #E6901)將擴增後產物轉殖進pTWIN1表現載體的Sap I切割位點與Pst I切割位點之間。pTWIN1表現載體為一種蛋白質純化系統，其利用蛋白剪接元素(例如內含肽)的可誘導自我切割(inducible self-cleavage)活性將目標蛋白從親和標籤分離。為了轉殖入TWIN1表現載體，按照製造商的使用操作說明純化含有擴增目標基因片段的反應混合物。接著，以一反應混合物中的限制酶Sap I及Pst I雙重剪切上述經純化的基因片段。同時，以反應混合物的相同酵素剪切pTWIN1載體。在2至4小時剪切作用之後，按照製造商的使用操作說明進行連接作用(ligation)。
融合蛋白表現
按照製造商的使用操作說明進行轉形作用。純化經轉形以表現融合蛋白的大腸桿菌菌株BL21(DE3)。
關於細胞培養，將新鮮生長的菌落或10毫升的新鮮生長培養物接種於一公升的LB培養液(每毫升培養液含有100微克的胺苄青黴素(ampicillin))中。在37°C之溫度下，將細胞培養物放置於空氣振盪器培養直到OD600
吸光值達到0.5至0.7。為了誘導融合蛋白的表現，加入IPTG使最後濃度為0.5 mM，接著將細胞培養物移至空氣振盪器，於15°C之溫度下放置隔夜。在4°C之溫度下，以5000 × g離心15分鐘，藉此將IPTG誘導的細胞培養物之細胞旋轉下來，並丟棄上清液；接著將細胞沉澱物儲存於–20°C之環境下以備後續使用。
親和純化
在親和純化之前，按照製造商的使用操作說明從前述細胞沉澱物中製備澄清的細胞萃取物。在幾丁質管柱(chitin column)經平衡之後，澄清的細胞萃取物以不超過每分鐘0.5至1.0 毫升的流速緩慢地裝載到幾丁質管柱上。以三倍管柱體積的緩衝液B2(含有500 mM之NaCl以及1 mM的 EDTA的20 mM HEPES或Tris-HCl，pH 6.5)快速沖洗該管柱，以進行管柱上切割(On-column cleavage)步驟。接著，中止管柱流體並將管柱於室溫下放置隔夜。
融合蛋白的內含肽-介導自我切割
針對管柱上切割，係按照製造商的使用操作說明書，利用不同pH值(pH 5.0、6.0及6.7)的切割緩衝液沖提(elute)目標蛋白。從各分液移除40微升的樣本，並分別將其與20微升的3倍SDS樣本緩衝液混合。離心混合物並丟棄上清液。接著，將40微升的1倍SDS樣本緩衝液加至該沉澱物中，煮5分鐘，後續進行電泳。最後以1%的SDS將剩餘的內含肽標籤以及未切割的融合蛋白從管柱剝離。為了評估切割效率，將 200微升的幾丁質樹脂移除並與100微升的3倍SDS樣本緩衝液移除混合。經煮5分鐘之後，以SDS-PAGE分析上清液以測定切割效率。
也在無親和純化的情況下進行內含肽-介導的融合蛋白自我切割。簡要地說明，使用不同pH值(pH 5.0、6.0及6.7)的切割緩衝液與澄清的細胞萃取物混合。以SDS–PAGE從混合物中分離細胞蛋白，接著轉印至聚二氟亞乙烯(PVDF)膜上，以抗GLP-1(7-36)抗體(針對利拉魯肽前驅物)及抗PTH抗體(針對特立帕肽)，接著以合適的HRP-共軛的二級抗體反應，以進行西方墨點轉印法偵測。
TEV蛋白酶對融合蛋白的酵素切割能力
針對融合蛋白的酵素切割，使融合蛋白與TEV蛋白酶緩衝液(利拉魯肽融合蛋白：TEV蛋白酶 = 50：1(莫耳))混合反應至少16小時。
產品特性分析
透過高效液相層析術(HPLC，系統：Agilent 1260 Infinity II LC System；管柱：C18 column)純化特立帕肽及利拉魯肽蛋白質至純度95%。
透過質譜法在MALDI TOF質譜儀上鑑定識別特立帕肽及利拉魯肽蛋白質。
實施例1
CBD-內含肽-特立帕肽融合蛋的內含肽-介導自我切割
在本實施例中，以各種不同pH值的切割緩衝液處理新鮮製備的CBD-內含肽-特立帕肽融合蛋白，並利用SDS-PAGE分析，以評估融合蛋白的內含肽-介導自我切割(第1A圖)。CBD-內含肽-特立帕肽融合蛋白的理論分子量為29,280.41道耳頓(約 29 kDa)，其中特立帕肽的分子量約為4.2 kDa。如第1A圖所示，在第2及第4電泳道中的CBD-內含肽-特立帕肽融合蛋白對應於大約30 kDa的蛋白條帶(與第1電泳道的分子量標記比對)。此結果表示在pH值6.7 (第2電泳道)、pH值6.0(第3電泳道)或pH值5.0(第4電泳道)之條件下，沒有發生融合蛋白的內含肽-介導自我切割。通常pH值6.0至7.0的切割緩衝液足以誘導內含肽-介導的自我切割，而pH值較低會造成更有效的自我切割。據此，此SDS-PAGE結果是相當令人意外的。
在進一步分析中，以前述各種pH值的切割緩衝液對CBD-內含肽-特立帕肽融合蛋白進行一個月的處理，以評估較長的反應期間是否可促進內含肽-介導的自我切割。第1B圖提供SDS-PAGE的結果，其說明即便經一個月的反應期間，仍然沒有在pH值6.7(第2電泳道 )、pH6.0(第3電泳道)或pH值5.0(第4電泳道)的條件下觀察到內含肽-介導的自我切割現象。
使用幾丁質管柱對細胞破碎物(從切割緩衝液(pH 6.7)處理一個月的反應混合物取得)進行親和純化，隨後進行SDS-PAGE分析。如第1C圖提供的結果，在裝載的細胞破碎物中(第2電泳道)、流經液體中(flow-through)(第3電泳道)、管柱洗滌液(column wash)中(第4電泳道)、或第一至第四沖提物(elusions)(分別為第5至8電泳道)中均沒有單離的特立帕肽。
總結來說，當在酸性條件下或是長時間的處理期間下，內含肽無法誘發CBD-內含肽-特立帕肽胜肽的自我切割反應。
實施例 2
以TEV蛋白酶對CBD-內含肽-S-TEV切位-特立帕肽融合蛋白的酵素切割作用
基於實施例 1令人意外的結果，製備CBD-內含肽-間隔-TEV切位-特立帕肽融合蛋白。在本新穎平台上，將TEV切割位點與一間隔部一起引入，以促進TEV蛋白酶-介導的切割作用。將間隔部設計成包含機動甘胺酸-絲胺酸(G-S)連接物，其N端有脯胺酸用以防止被內含肽誘導自我切割。首先，純化CBD-內含肽-間隔-TEV切位-特立帕肽融合蛋白，接著以TEV蛋白酶在不同pH值之條件下進行處理，接著進行SDS-PAGE分析(第2A圖)及西方墨點法轉印法分析(第2B圖)。
參考第2A圖及第2B圖所示，經純化的產物中，可在第2電泳道(pH值8.0)及第5電泳道(pH值7.0)觀察到一條約35 kDa的蛋白條帶(對應於第1電泳道的分子量標記)，表示在CBD-內含肽-間隔-TEV切位-特立帕肽融合蛋白(理論分子量：30,802.9 Da)沒有發生切割。反之，在pH值8.0(第3電泳道)及pH值7.0(第4電泳道)之環境下，以TEV蛋白酶處理的經純化蛋白之樣本中，可觀察到兩個蛋白條帶(其中一條靠近35 kDa標記，而另一條則稍微在前者之下)。此結果表示CBD-內含肽-間隔-TEV切位-特立帕肽融合蛋白被切割。第4電泳道與第7電泳道分別裝載(溶於)pH8.0及pH 7.0緩衝液中的特立帕肽，而並未在該些電泳道中發現切割片段。
第2A圖第2B圖的結果則表示，特立帕肽的分離是由於TEV蛋白酶進行切割的結果。
在經TEV蛋白酶處理之後，利用HPLC來純化反應混合物，同時第3圖顯示HPLC沖提圖譜結果。第3圖呈現的是，經純化的特立帕肽相對於參考樣本具有相似的沖提滯留時間。接著利用質譜法測定經純化形成的特立帕肽，且質譜測定結果顯示特立帕肽的分子量為4,115.17 Da，非常接近其理論分子量4,115.13 Da。這些結果表示本實施例(經切割作用)製備的特立帕肽至少在其一級結構上與參考特立帕肽高度相似。
實施例3
以TEV蛋白酶對CBD-內含肽-S-TEV切位-利拉魯肽融合蛋白的酵素切割作用
利用實施例2的平台製備攜帶利拉魯肽的融合蛋白。據此，製備CBD-內含肽-S-TEV切位-利拉魯肽融合蛋白，並以SDS-PAGE進行分析。利用SDS-PAGE分析將上清液(第2電泳道)以及來自細胞破碎物的不可溶性分液(第3電泳道)成功分離(第4圖左圖)。在第4圖左圖呈現的第3個電泳道中，在35 kDa標記下方的單一寬條帶清楚地指示出CBD-內含肽-S-TEV切位-利拉魯肽融合蛋白的表現(理論分子量：30,068.9 Da)。將此條帶切下並電沖提(electroelute)以得到融合蛋白產物，再以TEV蛋白酶(pH值8.0)處理，並利用SDS-PAGE分析經酵素處理後之產物(第4圖，右圖)。右圖的第2電泳道中，可看到兩條條帶：較靠近35 kDa標記的淡條帶表示未經切割的CBD-內含肽-S-TEV切位-利拉魯肽融合蛋白，而其下方較濃的條帶表示經切割的融合蛋白。上述結果均顯示：利拉魯肽的分離是由於TEV蛋白酶進行切割的結果。
在經TEV蛋白酶處理之後，使用HPLC來純化反應混合物。第5圖顯示HPLC沖提圖譜結果，其呈現的是，經純化的利拉魯肽相對於參考樣本具有相似的沖提滯留時間。接著利用質譜法測定經純化利拉魯肽前驅物，且質譜測定結果顯示利拉魯肽的分子量為3,382.6，非常接近其理論分子量3,383.7。此結果表示本實施例製備的利拉魯肽前驅物至少在其一級結構上與參考利拉魯肽前驅物是高度相似。
實施例4
以不同表現系統表現多份CBD-內含肽-S-TEV切位-利拉魯肽融合蛋白
利用前述的方法建構攜帶一份(LX1)或兩份(LX2)CBD-內含肽-S-TEV切位-利拉魯肽的載體(如第6圖所示)。將載體轉形至不同的細菌菌株內。
(4.1) BL21(DE3)菌株
以前述方式培養經轉形的大腸桿菌BL21(DE3)細菌，並藉由凝膠電泳結果確認轉形作用(第7A圖)。表現的蛋白質在包涵體中累積成不可溶性的包涵體。第7B圖之相片說明以LX2載體轉形之細菌的包涵體體積實質上增加。考馬斯藍(Coomassie blue)染色結果也說明，LX2 載體轉形之細菌包涵體內的表現蛋白(即CBD-內含肽-S-TEV切位-利拉魯肽融合蛋白)實質上增加(第7C圖；M：標記；A：LX1包涵體；B：LX1上清液；C：LX2包涵體；D：LX2 上清液)。
以TEV酶剪切表現融合蛋白，接著以HPLC進行純化。第7D圖總結考馬斯藍染色結果且下表1顯示HPLC分析結果，其說明相較於以LX1載體轉形的細菌，以LX2載體轉形的細菌之蛋白質產率增加至少45倍(第7D圖：M：標記；A：LX1包涵體；C：LX2包涵體；E：經TEV酶剪切後的LX1；F：經TEV酶剪切後的LX2)。
表1
(4.2) T7表現細菌菌株
以前述方式培養經轉形的大腸桿菌T7表現細菌，並藉由凝膠電泳結果確認轉形作用(第8A圖)。表現的蛋白質(培養於100毫升培養基中)在包涵體中累積成不可溶性的包涵體。第8B圖之相片說明以LX2載體轉形之細菌的包涵體體積實質增加。考馬斯藍染色結果也說明，以LX2載體轉形之細菌包涵體內的表現蛋白(即，CBD-內含肽-S-TEV切位-利拉魯肽融合蛋白)實質上增加(第8C圖)。
(4.3)羅賽塔(Rosetta)表現菌株
利用前述的方法建構攜帶一份(LX1或L)、兩份(LX2)或三份(LX3)CBD-內含肽-S-TEV切位-利拉魯肽的載體(如第9圖所示)。將載體轉形至不同的細菌菌株內。
以前述方式培養經轉形的大腸桿菌羅賽塔表現細菌，並藉由凝膠電泳結果確認轉形作用(第10A圖)。表現的蛋白質(培養於100毫升培養基中)在包涵體中累積成不可溶性的包涵體。第10B圖之相片說明，相比於LX1載體，以LX2載體或LX3 載體轉形細菌的包涵體體積實質上增加。
第11A圖總結在不同條件下，轉形細菌的生長速率。第11B圖之相片說明，相比於LX1載體，以LX2載體或LX3 載體轉形細菌的包涵體體積實質上增加。考馬斯藍染色結果也說明，以LX2載體或LX3載體轉形之細菌包涵體內的表現蛋白(即，CBD-內含肽-S-TEV切位-利拉魯肽融合蛋白)實質上增加(第11C圖)。另一方面，在上清液中，表現蛋白的量則沒有明顯差異(第11D圖)。
實施例5
如第12圖繪示的，建構本實施例中用於表現融合蛋白之目標基因。簡言之，L1載體依序包含：一T7啟動子、一利拉魯肽片段、一自我切割胜肽或一催化切割蛋白(內含肽2，序列編號：17)以及CBD胜肽；L2載體包含一表現單元，其依序包含：一T7啟動子、一第一利拉魯肽片段、一內含肽2片段以及一第二拉魯肽片段；以及L4 載體包含兩個所述表現單元。接著將載體轉形至KRX菌株中。
以前述方式培養經轉形的細菌，並藉由凝膠電泳結果確認其轉形作用(第13A圖)。第13B圖提供的是表現蛋白的考馬斯藍染色結果(培養於100毫升培養基中)，其說明以L2載體或L4載體轉形的細菌包涵體體內的表現蛋白實質上增加。
應當理解的是，前述對實施方式的描述僅是以實施例的方式給出，且本領域所屬技術領域中具有通常知識者可進行各種修改。以上說明書、實施例及實驗結果提供本發明之例示性實施方式之結構與用途的完整描述。雖然上文實施方式中揭露了本發明的各種具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
第1A圖至第1C圖係依據本揭示內容實施例1所繪示之照片，其係關於由融合蛋白之內含肽所介導之自我切割。
第2A圖至第2B圖係依據本揭示內容實施例2所繪示之照片，其係關於由融合蛋白之TEV蛋白酶所介導之自我切割。
第3圖包含根據本揭示內容實施例2之目標蛋白的HPLC沖提層析圖。
第4圖係依據本揭示內容實施例3所繪示之照片，其係關於由融合蛋白之TEV蛋白酶所介導之自我切割。
第5圖包含根據本揭示內容實施例3之目標蛋白的HPLC沖提層析圖。
第6圖繪示本揭示內容實施例4的實驗設計。
第7A圖至第7D圖之照片係關於本揭示內容實施例4的結果。
第8A圖至第8C圖之照片係關於本揭示內容實施例4的結果。
第9圖繪示本揭示內容實施例4的實驗設計。
第10A圖至第10B圖之照片係關於本揭示內容實施例4的結果。
第11A圖至第11D圖之照片係關於本揭示內容實施例4的結果。
第12圖繪示本揭示內容實施例5的實驗設計。
第13A圖至第13B圖之照片係關於本揭示內容實施例5的結果。
序列表<110> 展旺生命科技股份有限公司<120> 用以製備目標蛋白的表現構建體與方法<130> P2929-TW<150> US62447452<151> 2017-01-18<160> 17<170> BiSSAP 1.3.6<210> 1<211> 226<212> PRT<213> 人工序列<220> <223> 合成的<400> 1Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Thr Asn Pro Gly Val Ser Ala Trp 1 5 10 15 Gln Val Asn Thr Ala Tyr Thr Ala Gly Gln Leu Val Thr Tyr Asn Gly 20 25 30 Lys Thr Tyr Lys Cys Leu Gln Pro His Thr Ser Leu Ala Gly Trp Glu 35 40 45 Pro Ser Asn Val Pro Ala Leu Trp Gln Leu Gln Asn Asn Gly Asn Asn 50 55 60 Gly Leu Glu Leu Arg Glu Ser Gly Ala Ile Ser Gly Asp Ser Leu Ile 65 70 75 80 Ser Leu Ala Ser Thr Gly Lys Arg Val Ser Ile Lys Asp Leu Leu Asp 85 90 95 Glu Lys Asp Phe Glu Ile Trp Ala Ile Asn Glu Gln Thr Met Lys Leu 100 105 110 Glu Ser Ala Lys Val Ser Arg Val Phe Cys Thr Gly Lys Lys Leu Val 115 120 125 Tyr Ile Leu Lys Thr Arg Leu Gly Arg Thr Ile Lys Ala Thr Ala Asn 130 135 140 His Arg Phe Leu Thr Ile Asp Gly Trp Lys Arg Leu Asp Glu Leu Ser 145 150 155 160 Leu Lys Glu His Ile Ala Leu Pro Arg Lys Leu Glu Ser Ser Ser Leu 165 170 175 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Claims (10)
- 一種表現構建體，包含至少二表現單元，其中每一表現單元包含一用以編碼一融合蛋白的核苷酸序列，其中該融合蛋白從N-端至C-端依序包含一親和標籤部、一間隔部、一酵素切割位點以及一目標蛋白部。
- 如請求項1所述之表現構建體，其中該間隔部包含序列編號：2的胺基酸序列。
- 如請求項1所述之表現構建體，其中該親和標籤部是一幾丁質結合域(chitin binding domain，CBD)-內含肽。
- 如請求項1所述之表現構建體，其中該酵素切割位點是一菸草蝕刻病毒(tobacco etch virus，TEV)切割辨識位點。
- 如請求項1所述之表現構建體，其中每一表現單元更包含一啟動子，其係位於該用以編碼該融合蛋白之核苷酸序列的上游。
- 一種表現構建體，包含至少一表現單元，其中該表現單元包含一用以編碼一融合蛋白的核苷酸序列，其中該融合蛋白包含兩個目標蛋白部，以及一自我切割胜肽或一催化切割蛋白，其中該自我切割胜肽或該催化切割蛋白係位於所述兩個目標蛋白部之間。
- 如請求項6所述之表現構建體，其中每一表現單元更包含一啟動子，其係位於該用以編碼該融合蛋白之核苷酸序列的上游。
- 如請求項6所述之表現構建體，其中該表現構建體包含兩或多個所述表現單元。
- 如請求項6所述之表現構建體，其中該自我切割胜肽或該催化切割蛋白包含序列編號：17的胺基酸序列。
- 一種用以製備一目標蛋白的方法，包含以下步驟： (a)提供如請求項1至5所述之任一種表現構建體； (b)將該表現構建體轉形至一宿主細胞，並於允許表現該融合蛋白的條件下培養該宿主細胞； (c) 破碎該宿主細胞以得到一細胞破碎物，其包含一可溶性分液及一不可溶性分液； (d)非必要性地，純化該不可溶性分液，以得到一經純化的不可溶性分液； (e)溶解步驟(c)之該不可溶性分液或步驟(d)之該經純化的不可溶性分液，藉以得到一經溶解的融合蛋白； (f)將該經溶解的融合蛋白懸浮於一復性緩衝液中，藉此使該經溶解的融合蛋白進行再摺疊，以得到一再摺疊融合蛋白；以及 (g)對該再摺疊融合蛋白的酵素切割位點進行切割，以釋放該目標蛋白。
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