利用高效液相色谱法检测GLP-1或其类似物的方法
技术领域
本发明涉及GLP-1检测技术领域,具体涉及一种利用高效液相色谱法检测GLP-1或其类似物的方法。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(本发明简称GLP-1)是一种由胃肠内分泌细胞产生的肽类物质,属于一种肠促胰岛素,能够通过多种途径来控制血糖。重组GLP-1为GLP-1类似物,在生产及储存过程中会产生多种产品相关杂质,较难分离。
目前用于检测多肽类物质的流动相多为三氟乙酸体系,三氟乙酸流动相的主要缺陷是基线波动大,导致灵敏度低,不易检测到含量较小的杂质。并且在以三氟乙酸为流动相分离GLP-1或GLP-1类似物时,包含的杂质较多,分离效果不理想,无法很好的控制产品的质量。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足,提供一种利用高效液相色谱法(本发明简称HPLC)检测GLP-1或其类似物的方法,以减小基线波动,从而提高检测方法的灵敏度,提高主峰和杂质的分离效果,更有效地控制GLP-1产品或GLP-1类似物产品的质量。
本发明提供一种利用HPLC检测GLP-1或其类似物的方法,该方法使用流动相A和流动相B对含有GLP-1或GLP-1类似物的样品进行洗脱,所述流动相A由钠盐溶液和有机溶剂组成,流动相B由有机溶剂和水溶液组成;其中钠盐选自硫酸钠、氯化钠、乙酸钠和磷酸钠溶液中的一种或两种,有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈中的一种或两种。
作为本发明的优选实施方案,所述流动相A中的钠盐为硫酸钠,所述流动相A中硫酸钠的浓度为10~50g/L,优选为15~40g/L,进一步优选为20~35g/L,更优选为23~28g/L,更优选为25~26g/L。本发明通过优化硫酸钠在流动相A中的比例,降低基线波动,提高检测GLP-1或GLP-1类似物的灵敏度,提高GLP-1产品或GLP-1类似物主峰与杂质的分离度。
作为本发明的优选实施方案,所述流动相A中的有机溶剂为乙腈,所述流动相A中乙腈的体积百分比为5%~20%,优选为10%~15%,例如10%。通过优化乙腈在流动相A中的比例,降低基线波动,提高检测GLP-1或GLP-1类似物的灵敏度,提高GLP-1产品或GLP-1类似物主峰与杂质的分离度。
作为本发明的优选实施方案,所述流动相A的pH值为2.0~4.5,优选为2.5~3.5,更优选为3。缓冲液缓冲能力强,能够提供稳定的pH,通过调节流动相的pH值,以抑制样品组分的解离,增加组分在固定相上的保留,并改善峰形。
作为本发明的优选实施方案,所述流动相A的pH值的调节剂为磷酸缓冲溶液。
作为本发明的优选实施方案,所述流动相B中有机溶剂为乙腈,所述流动相B中乙腈的体积分数为60%~80%,优选为70%。通过优化乙腈在流动相B中的比例,降低基线波动,提高检测GLP-1或GLP-1类似物的灵敏度,提高GLP-1产品或GLP-1类似物主峰与杂质的分离度。
作为本发明的优选实施方案,所述洗脱为梯度洗脱。
作为本发明的更优选实施方案,所述梯度洗脱的方式为:以流动相A和流动相B的总体积为100%,所述流动相A所占的体积百分比由80%递减至30%,余量为流动相B。
作为本发明的更优选实施方案,所述梯度洗脱的方式为:以流动相A和流动相B的总体积为100%;0~8分钟,所述流动相A的体积百分比由80%递减至65.5%,余量为流动相B;8~29分钟,所述流动相A的体积百分比保持65.5%,余量为流动相B;29~32分钟,所述流动相A的体积百分比由65.5%递减至30%,余量为流动相B;32~40分钟,所述流动相A的体积百分比保持30%,余量为流动相B。
作为本发明的优选实施方案,所述洗脱所使用的色谱柱为C18柱,优选为WatersX-select CSH C18填充柱。增加对GLP-1或GLP-1类似物的选择性,提高对GLP-1或GLP-1类似物的分离效率。
作为本发明的优选实施方案,所述高效液相色谱法的色谱柱柱温为35~45℃。
作为本发明的优选实施方案,所述含有GLP-1或GLP-1类似物的样品的进样体积为1~10μL,优选为4~6μL,例如5μL。
作为本发明的优选实施方案,所述高效液相色谱法的流动相流速为0.5~5mL/min,优选为1~2mL/min。
作为本发明的优选实施方案,所述高效液相色谱法的检测波长为210~218nm;优选为214nm。
通过对色谱柱柱温、进样体积、流动相流速等优化,分离出更多的杂质,提高检测方法的灵敏度,更有效地控制GLP-1产品或GLP-1类似物产品的质量。
作为本发明的优选实施方案,所述GLP-1或其类似物选自GLP-1(1-37)、利拉鲁肽中间体、艾塞那肽、阿必鲁肽、利司那肽。
所述GLP-1(1-37)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体为:HNEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。
所述利拉鲁肽中间体为含有31个氨基酸的多肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。具体为:HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFI AWLVRGRG。
所述艾塞那肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示:HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS。
所述阿必鲁肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示:HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR。
所述利司那肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示:HGEGTFTS DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK。
本发明提供的利用高效液相色谱检测GLP-1或其类似物的方法,通过设置流动相A为含有硫酸钠的乙腈水溶液,流动相B为乙腈水溶液,相对于现有的以三氟乙酸体系等为流动相的高效液相色谱法,减小基线波动,提高灵敏度,提高GLP-1产品或GLP-1类似物产品主峰与杂质的分离度,更有效地控制GLP-1产品或GLP-1类似物产品的质量。。
本发明提供的利用高效液相色谱检测GLP-1或其类似物的方法,GLP-1或GLP-1类似物的检测限为0.5μg/ml,定量限为1μg/ml。
附图说明
图1为色谱柱ACE C18与Waters X-bridge C18的检测结果对比图。其中1代表ACEC18;2代表Waters X-bridge C18。
图2为色谱柱Waters X-bridge C18与Waters X-select C18的检测结果对比图。其中2代表Waters X-bridge C18;3代表Waters X-select C18。
图3为硫酸钠分别浓度为0.1M和0.2M的检测结果对比图。
图4为流动相A的pH2.0和pH3.0的检测结果对比图。
图5为流动相A的pH3.0和pH3.5的检测结果对比图。
图6为不同色谱柱柱温的检测结果对比图。
图7为流动相B分别为50%ACN和70%CAN的检测结果对比图。
图8为实施例6中检测利拉鲁肽中间体的色谱图。
图9为实施例7中检测利拉鲁肽中间体的色谱图。
图10为实施例8中检测利拉鲁肽中间体的色谱图。
图11为通过本发明提供的利用HPLC检测GLP-1或其类似物的方法对粗品和精纯样品进行色谱纯化的色谱图。
图12为图11的放大图。
图13为对比例1中三氟乙酸流动相体系的色谱图。
图14为对比例1中缓冲盐流动相体系的色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明,应该理解的是,本发明的实施例仅仅是用于说明本发明,而不是本发明的限制,在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
制备例1
溶液配制
流动相A:称取无水硫酸钠28.4g,加超纯水1000ml溶解,用磷酸调节pH至3.0,用0.45μm水系滤膜过滤,取滤液900ml,加入乙腈100mL,混匀,超声15min,即得。在流动相A中,无水硫酸钠为25.56g/L,乙腈的体积分数为10%。
流动相B:取经0.45μm水系滤膜过滤的超纯水300ml,加入乙腈700ml,混匀,超声15min,即得。
空白溶液(0.01M HCl):取盐酸0.9ml,用水稀释成1000ml,摇匀,即得。
对照品溶液(1mg/ml):取GLP-1或其类似物对照品约25mg,精密称定,置于25ml的容量瓶中,加空白溶液适量使溶解并稀释至刻度,摇匀。
供试品溶液:取GLP-1或其类似物的供试品,分别加超纯水稀释,制成终浓度约为1mg/ml的溶液。
制备例2
溶液配制
制备例2与制备例1的区别在于:
流动相A:称取无水硫酸钠23.53g,加超纯水1000ml溶解,用磷酸调节pH至2.0,用0.45μm水系滤膜过滤,取滤液850ml,加入乙腈150ml,混匀,超声15min,即得。在流动相A中,无水硫酸钠为20g/L,乙腈的体积分数为15%。
流动相B:取经0.45μm水系滤膜过滤的超纯水200ml,加入乙腈800ml,混匀,超声15min,即得。
制备例3
溶液配制
制备例3与制备例1的区别在于:
流动相A:称取无水硫酸钠36.84g,加超纯水1000ml溶解,用磷酸调节pH至6.0,用0.45μm水系滤膜过滤,取滤液950ml,加入乙腈50mL,混匀,超声15min,即得。在流动相A中,无水硫酸钠为34.998g/L,乙腈的体积分数为5%。
流动相B:取经0.45μm水系滤膜过滤的超纯水400ml,加入乙腈600ml,混匀,超声15min,即得。
实施例1:色谱柱优化选择
流动相A(0.2M):取无水硫酸钠28.4g加1L超纯水溶解,用磷酸调pH至3.0,用0.45μm的水系滤膜(津腾,PES)滤过,取900ml滤液,加100ml乙腈,混匀超声15min即得。
流动相B:取超纯水、乙腈各500ml,混匀超声15min即得。
色谱条件:流速1.0ml/min,检测波长214nm,柱温40℃。
1、考察色谱柱①ACE C18 4.6x250mm,5μm和②Waters X-bridge C18 4.6x250mm,5μm。具体而言:
色谱柱①ACE C18 4.6x250mm,5μm
梯度洗脱如下:
色谱柱②Waters X-bridge C18 4.6x250mm,5μm
梯度洗脱如下:
时间(min) |
流动相A(%) |
流动相B(%) |
0 |
45 |
55 |
30 |
45 |
55 |
35 |
20 |
80 |
40 |
20 |
80 |
图1结果表明,色谱柱Waters X-bridge C18 4.6x250mm,5um对于主峰周围的杂质分离效果较好,主峰前能够多分离出一个杂质,色谱柱Waters X-bridge C18优于ACE C18。
2、考察色谱柱②Waters X-bridge C18 4.6x250mm,5μm和③Waters X-select C184.6x75mm,2.5μm。具体而言:
色谱柱②Waters X-bridge C18 4.6x250mm,5μm
梯度洗脱如下:
时间(min) |
流动相A(%) |
流动相B(%) |
0 |
70 |
30 |
18 |
42 |
58 |
33 |
42 |
58 |
40 |
20 |
80 |
45 |
20 |
80 |
色谱柱③Waters X-select C18 4.6x75mm,2.5μm
梯度洗脱如下:
图2中结果表明,色谱柱Waters X-select C18较Waters X-bridge C18对于主峰周围的杂质分离效果较好,能够在主峰前后分离5个杂质,而色谱柱Waters X-bridge C18在主峰前后只能分离出两个峰,色谱柱Waters X-select C18优于X-bridge C18,因此选择色谱柱Waters X-select C18 4.6x75mm,2.5um作为最终检测方法所用的色谱柱。
实施例2:
流动相A中钠盐浓度的影响
流动相A(0.1M):取无水硫酸钠14.2g加1L超纯水溶解,用磷酸调pH至3.0,用0.45μm的水系滤膜(津腾,PES)滤过,取900ml滤液,加100ml乙腈,混匀超声15min即得。
流动相A(0.2M):取无水硫酸钠28.4g加1L超纯水溶解,用磷酸调pH至3.0,用0.45μm的水系滤膜(津腾,PES)滤过,取900ml滤液,加100ml乙腈,混匀超声15min即得。
流动相B:取超纯水、乙腈各500ml,混匀超声15min即得。
色谱条件:流速1.0ml/min,检测波长214nm,柱温40℃。
色谱柱:Waters X-select C18 4.6x75mm,2.5μm
梯度洗脱如下:
由图3可知,对比硫酸钠缓冲盐浓度为0.1M和0.2M对分离度的影响,pH均为3.0,见图3,结果表明,0.2M硫酸钠缓冲盐对主峰前后的杂质分离效果均较好。
实施例3
对比流动相A不同pH对分离度的影响
流动相A(pH2.0):取无水硫酸钠28.4g加1L超纯水溶解,用磷酸调pH至2.0,用0.45μm的水系滤膜(津腾,PES)滤过,取900ml滤液,加100ml乙腈,混匀超声15min即得。
流动相A(pH3.0):取无水硫酸钠28.4g加1L超纯水溶解,用磷酸调pH至3.0,用0.45μm的水系滤膜(津腾,PES)滤过,取900ml滤液,加100ml乙腈,混匀超声15min即得。
流动相A(pH3.5):取无水硫酸钠28.4g加1L超纯水溶解,用磷酸调pH至3.5,用0.45μm的水系滤膜(津腾,PES)滤过,取900ml滤液,加100ml乙腈,混匀超声15min即得。
流动相B:取超纯水、乙腈各500ml,混匀超声15min即得。
色谱条件与实施例2相同。
分别考察pH2.0、pH3.0、pH3.5,缓冲盐浓度均为0.2M,见图4图5,结果表明,pH2.0流动相下最后一个杂质出峰太晚,pH3.0流动相主峰前后杂质分离效果较好,杂质个数较多,因此pH3.0流动相优于pH2.0流动相;pH 3.5流动相下主峰前的两个杂质未能分离出来,pH3.0流动相优于pH3.5流动相,因此选择3.0作为缓冲盐的最终pH。
实施例4
对比不同柱温对分离度的影响
流动相A(pH3.0):取无水硫酸钠28.4g加1L超纯水溶解,用磷酸调pH至3.0,用0.45μm的水系滤膜(津腾,PES)滤过,取900ml滤液,加100ml乙腈,混匀超声15min即得;
流动相B:取超纯水、乙腈各500ml,混匀超声15min即得。
色谱柱Waters X-select C18 4.6x75mm,2.5um
流速1.0ml/min,检测波长214nm
柱温分别为30℃、35℃、40℃。
梯度洗脱如下:
时间(min) |
流动相A(%) |
流动相B(%) |
0 |
70 |
30 |
8 |
47 |
53 |
30 |
47 |
53 |
34 |
20 |
80 |
柱温分别考察30℃、35℃、40℃,见图6,结果表明,40℃时,主峰前少分离出一个杂质峰;在30℃时,紧接着主峰后的杂质峰不明显,柱温为35℃时分离效果最优。
实施例5
对比流动相B不同乙腈比例的影响
流动相A(pH3.0):取无水硫酸钠28.4g加1L超纯水溶解,用磷酸调pH至3.0,用0.45μm的水系滤膜(津腾,PES)滤过,取900ml滤液,加100ml乙腈,混匀超声15min即得。
流动相B1:取超纯水、乙腈各500ml,混匀超声15min即得。
流动相B2:取超纯水300ml,乙腈700ml,混匀超声15min即得。
检测条件:
色谱柱Waters X-select C18 4.6x75mm,2.5um
流速1.0ml/min,检测波长214nm
柱温分别为35℃
梯度洗脱如下:
时间(min) |
流动相A(%) |
流动相B(%) |
0 |
80 |
20 |
8 |
65.5 |
34.5 |
39 |
65.5 |
34.5 |
32 |
20 |
80 |
40 |
20 |
80 |
经高效液相色谱检测,由图7可知,利用两种流动相检测得到的主峰峰形、主峰前后杂质的分离度、保留时间一致,流动相B为70%ACN的色谱图中的基线较为平缓,因此选择70%ACN作为最终的流动相B相。
实施例6
本实施例提供一种利用HPLC检测GLP-1或其类似物的方法。针对GLP-1类似物利拉鲁肽中间体(利拉鲁肽中间体由一条肽链组成,包含31个氨基酸,与利拉鲁肽相比在位于20位的赖氨酸上少了一条脂肪酸链,其理论分子量为3381.67Da,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示:HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG)检测。利用制备例1制备的流动相A和流动相B对含有GLP-1类似物的样品进行洗脱。
检测条件:
色谱柱:Waters Xselect CSH C18 4.6*75mm,2.5μm
进样体积:5μL
检测波长:214nm
色谱柱柱温:35℃
流动相流速:1.0ml/min
运行时间:40min
洗脱梯度:以初始比例后运行6min,详见表1。
表1洗脱梯度的方式
时间(min) |
流动相A(%) |
流动相B(%) |
0 |
80 |
20 |
8 |
65.5 |
34.5 |
29 |
65.5 |
34.5 |
32 |
30 |
70 |
40 |
30 |
70 |
经高效液相色谱检测,由图8可知,检测限能够低至0.5μg/ml,相当于对照品溶液的0.05%,定量限为1μg/ml,相当于对照品溶液的0.1%。
实施例7
本实施例提供一种利用HPLC检测GLP-1或其类似物的方法。针对GLP-1类似物利拉鲁肽中间体样品检测,进行了多批样品(批次1、批次2、批次3和批次4)的检测,利用制备例1制备的流动相A和流动相B对多批样品(批次1、批次2、批次3和批次4)含有GLP-1类似物的样品进行洗脱。
检测条件参见实施例6,洗脱梯度的方式详见表1。
经高效液相色谱检测,如图9显示,能够检测出2-18min(即主峰前)的含量很小的杂质,甚至最小杂质含量为0.004%,能够严格地控制GLP-1类似物产品的质量,确保GLP-1类似物产品的纯度。
实施例8
本实施例提供一种利用HPLC检测GLP-1或其类似物的方法。
针对GLP-1类似物利拉鲁肽中间体样品检测。利用制备例1制备的流动相A和流动相B对含有GLP-1类似物的样品进行洗脱。
检测条件参见实施例6,洗脱梯度的方式详见表1。
经高效液相色谱检测,如图10显示,对主峰前后能够分离出更多的杂质,且主峰与相邻杂质有很好的分离效果,分离度大于1.5。
实施例9
本实施例提供一种利用HPLC检测GLP-1或其类似物的方法。
针对制备例1中的GLP-1类似物粗品溶液和精纯样品溶液检测。利用制备例1制备的流动相A和流动相B对含有GLP-1类似物的样品进行洗脱。
检测条件参见实施例6,洗脱梯度的方式详见表1。
经高效液相色谱检测,如图11和图12显示,对于纯化工艺中的粗品和精纯样品的检测,本发明提供的HPLC方法具有优异的区分效果,满足工艺的需求。
实施例10
本实施例提供一种利用HPLC检测GLP-1或其类似物的方法。
针对GLP-1类似物艾塞那肽样品检测。利用制备例2制备的流动相A和流动相B对含有GLP-1类似物的样品进行洗脱。
检测条件
色谱柱:Waters Xselect CSH C18 4.6*75mm,2.5μm
进样体积:5μL
检测波长:214nm
色谱柱柱温:35℃
流动相流速:1.0ml/min
运行时间:40min
洗脱梯度:以初始比例后运行6min,详见表1。
实施例11
本实施例提供一种利用HPLC检测GLP-1或其类似物的方法。
针对GLP-1类似物阿必鲁肽检测。利用制备例3制备的流动相A和流动相B对含有GLP-1类似物样品进行洗脱。
检测条件
色谱柱:Waters Xselect CSH C18 4.6*75mm,2.5μm
进样体积:5μL
检测波长:214nm
色谱柱柱温:35℃
流动相流速:1.0ml/min
运行时间:40min
洗脱梯度:以初始比例后运行6min,详见表1。
对比例1
三氟乙酸流动相体系:
流动相A:量取超纯水1000ml,加入三氟乙酸1ml,混匀,超声脱气15min即得。
流动相B:量取乙腈1000ml,加入三氟乙酸1ml,混匀,超声脱气15min即得。
检测条件:
色谱柱:Waters Xselect CSH C18 4.6*75mm,2.5μm
进样体积:5μL
检测波长:214nm
色谱柱柱温:35℃
流动相流速:1.0ml/min
运行时间:40min
洗脱梯度:以初始比例后运行6min,详见下表:
时间(min) |
流动相A(%) |
流动相B(%) |
0 |
80 |
20 |
8 |
67.5 |
32.5 |
29 |
67.5 |
32.5 |
32 |
30 |
70 |
40 |
30 |
70 |
缓冲盐体系见:制备例1。
检测条件
色谱柱:Waters Xselect CSH C18 4.6*75mm,2.5μm
进样体积:5μL
检测波长:214nm
色谱柱柱温:35℃
流动相流速:1.0ml/min
运行时间:40min
洗脱梯度:以初始比例后运行6min,详见表1。
由图13和图14结果可知:三氟乙酸作为流动相体系时基线波动大,未能检测到含量较小的杂质,因而选择基线波动小的缓冲盐流动相体系。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本发明的思想,其同样应当视为本发明所公开的内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞市东阳光生物药研发有限公司;广东东阳光药业有限公司
<120> 利用高效液相色谱法检测GLP-1或其类似物的方法
<130> RYP2010571.5
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GLP-1(1-37)
<400> 1
His Asn Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val
1 5 10 15
Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu
20 25 30
Val Lys Gly Arg Gly
35
<210> 2
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 利拉鲁肽中间体
<400> 2
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 3
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 艾塞那肽
<400> 3
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 阿必鲁肽
<400> 4
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 5
<211> 44
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 利司那肽
<400> 5
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys
35 40