MX2007005327A - Metodo para purificacion de la hormona foliculo estimulante (hfe). - Google Patents
Metodo para purificacion de la hormona foliculo estimulante (hfe).Info
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Abstract
La presente inencion se refire a un metodo para purificar HFE humana recombinante o una variante de la HFE a partir de una HFE cruda, que comprende las siguientes etapas: 1. cromatografia de afinidad de tinte; 2. cromatografia de interaccion hidrofobica; y 3. cromatografia de fase inversa.
Description
MÉTODO PARA PURIFICACIÓN DE LA HORMONA FOLÍCULO ESTIMULANTE (HFE)
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al campo de la purificación de hormona folículo estimulante (HFE) . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hormona folículo estimulante (HFE) es una pro teína inyectable que cae dentro de la clase de gonadotropinas . La HFE es usada en el tratamiento de infertilidad y trastornos reproductivos en pacientes tanto femeninos como masculinos. En la naturaleza, la HFE es producida por la glándula pituitaria. Para uso farmacéutico, la HFE puede ser introducida recombinantemente (HFEr) , o puede ser aislada de la orina de mujeres post-menopáusicas (HFEo) . La HFE es usada en pacientes femeninos en la inducción de ovulación (10) y en la hiperes t imulación ovárica controlada (HEOC) por técnicas reproductivas asistidas (ART) . En un régimen de tratamiento típico para inducción de ovulación, a un paciente se administra diariamente, inyecciones de HFE o una variante (aproximadamente 75 a 300 IU de HFE/día) , por un periodo desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 12 días. En un régimen de tratamiento típico para hiperestimulación ovárica controlada, a un paciente se REF.: 180329
administra diariamente, inyecciones de HFE o una variante (aproximadamente 150-600 IU de HFE/día) , por un periodo desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 12 días . La HFE también es usada para inducir espermatogénesis en hombres que sufren de oligoespermia. Un régimen que usa 150 IU de HFE 3 veces semanalmente en combinación con 2 '500 IU de hCG dos veces por semana, ha sido exitoso en lograr un mejoramiento en el conteo de espermas en el hombre que sufre de hipogonadismo hipogonadotrópico . [Burges et al; au to-administración subcu tánea de hormona folículo estimulante al tamente purificada y gonadotropina coriónica humana para el tratamiento de hipogonadismo hipogonadotrópico . Spanish Collaborative Group on Male Hypogonadotrophic Hypogonadism) ; Hum . Reprod. ; 1997, 12, 980-6] . Debido a la importancia de la HFE en el tratamiento de trastornos de fertilidad, es deseable la provisión de HFE de alta pureza y alta actividad específica. El tratamiento de HFE requiere inyecciones repetidas. Las preparaciones de HFE altamente purificadas pueden ser administradas subcutáneamente, permitiendo la auto-administración por el paciente, de este modo, incrementando la conveniencia y comodidad del paciente. Lynch et al . , [The extraction and purification of human pituitary follicle-stimulating hormone and luteinising
hormone (por sus siglas en inglés, Extracción y purificación de la hormona folículo estimulante pituitaria humana y hormona luteinizante) ; Acta Endocr inologica , 1988, 288, 12-19] , describe un método para purificar la HFE pituitaria humana. El método involucra la cromatografía de intercambio aniónico y catiónico, extracción de inmunoafinidad y cromatografía de exclusión de tamaño. El método se dice, resulta en la HFE de la pituitaria que tiene una actividad específica de 4,990 IU (inmunoensayo) /mg, con 16 IU/mg de HL. El contenido de proteína se determina ya sea por peso seco o en solución por absorción a 280 nm (asumiendo que A280lcm por 1 g/1 es igual a 1) . El documento WO 98/20039 (Instituto de Bioquímica SA IBSA) , describe un proceso para la purificación de HFE urinaria humana partiendo con extractor urinarios llamados gonadotropinas menopáusicas humanas (GMH) . El proceso usa cromatografía de intercambio iónico en resinas de intercambio aniónico débilmente básicas del tipo DEAE, seguido por cromatografía de afinidad en resinas que tienen un derivado antraquinona como ligando. El proceso se dice, proporciona HFE urinaria libre de HL y que tiene una actividad específica de 6,870 IU (inmunoensayo) /mg. El contenido de proteína se determina asumiendo que una solución acuosa de 1 mg/ml de proteína, tiene una densidad óptica de 0.62 a 277 nm, en cubetas de cuarzo con 1 cm de longitud de trayectoria.
El documento WO 00/63248 (Instituto Massone SA) , describe un proceso para la purificación de gonadotropinas, que incluyen, HFE, de orina humana. El proceso involucra las siguientes etapas: cromatografía de intercambio iónico con una resina catiónica fuerte del tipo sulfopropilo, cromatografía de intercambio iónico con una resina aniónica fuerte, y cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH) . Una preparación de HFE que tiene una actividad específica de 8,400 IU/mg (Steelman-Pohley method: Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation wi th human chorionic gonadotrophin (por sus siglas en inglés, Método Steelman-Pholey: Ensayo de la hormona folículo estimulante basado en el aumento con la gonadotropina coriónica humana) ; Endocrinology; 1953. 53 , 60-616) y menos de 1 IU de HL, se obtiene según se informa, (método de ganancia en peso de la vesícula seminal de rata: Van Hell, H, Matthi sen R & GA Overbeek; Acta Endocrinol , 1964, 47, 409), de actividad biológica por 75 IU de HFE. El contenido de proteína se realizó por el método Lowry [O.H. Lowry et al . , J. Biol . Chem . , 1951, 193 , 265]. El documento US 5,990,288 (Musick et al . ) , describe un método para purificar la HFE de muestras biológicas, tales como glándulas pituitarias humanas o de orina post-menopáusica humana. El proceso usa cromatografía de intercambio catiónico en Fractogel EMD SO3-650M, seguido por
cromatografía de afinidad de tinte en resina Mimética Naranja 1, seguido por una etapa de cromatografía de interacción hidrofóbica en resina Hl-Propil de Alto Poro Bakerbond. El proceso se dice, resulta en una HFE pituitaria humana, que tiene una actividad específica de 7,066 IU (inmunoensayo) /mg y menos de 1 IU (inmunoensayo) /mg de HL, y una HFE urinaria que tiene una actividad específica de 6,298 IU (inmunoensayo) /mg y menos de 3 IU (inmunoensayo) /mg de HL . El contenido de proteína se determina por absorción a 280 nm (asumiendo que A280?cm por 1 g/1 es igual a l). Chiba et al . [Isolation and partial characterisation of LH, FSH and TSH from canine pituitary gland; (por sus siglas en inglés, aislamiento y caracterización parcial de HL, HFE y HTE de glándula pituitaria canina; Endocrinol . J. , 1997, 44, 205-218], describe una técnica para purificar gonadotropinas pituitarias caninas, que incluyen HFE, usando cromatografía de afinidad A de Concanavalina (Con) , cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH) y cromatografía de ion metálico inmovilizado con Cu++ . La HFE resultante es reportada por tener una actividad específica de 2.17 IU/g de proteína, usando un ensayo radiorreceptor para HFE para medir la actividad biológica y el kit de proteína BioRad (BioRad Laboratories CA USA) , para determinar el contenido de proteína.
El documento WO 88/10270 (Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA) , describe un método para purificar HFE humana de orina. El proceso involucra inmunocromatograf í a con anticuerpos monoclonales inmovilizados específicos de la HFE, unidos a Sefarosa 4B por divinil sulfona, seguido por CLAR de fase inversa. La HFE resultante está libre de HL y otras proteínas urinarias y tiene una actividad específica de 6,200 IU/mg de polvo liofilizado (Método Steelman-Pohley ) . La preparación es primero, la preparación de HFE a ser adecuada para administración subcutánea, debido a su pureza. Permanece una necesidad en curso de nuevos métodos para purificar HFE y variantes de la HFE. En particular, existe una necesidad de métodos de purificación que evitan el uso de etapas de cromatografía de inmunoafinidad de altos costos . SUMARIO DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la invención, proporcionar un nuevo método para purificar HFE recombinante o una variante de la HFE recombinante. En un primer aspecto, la invención proporciona un método para purificar HFE humana recombinante, o una variante de HFE que parte de un líquido que contiene la HFE cruda, que comprende las siguientes etapas:
(1) cromatografía de afinidad de tinte; (2) cromatografía de interacción hidrofóbica; y (3) cromatografía de fase inversa; las cuales, se pueden llevar a cabo en cualquier orden. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra la presente invención, es decir, un proceso de purificación que comprende las etapas de: • cromatografía de afinidad de tinte, • cromatografía de interacción hidrofóbica, • cromatografía de fase inversa , La Figura 2 muestra un diagrama de flujo de una modalidad específica de la presente invención, es decir, un proceso de purificación que comprende las etapas de: • ultraf iltración/diaf iltración , • cromatografía de intercambio aniónico , • cromatograf ría de af inidad de tinte , • cromatografía de interacción hidrofóbica , • cromatograf ía de fase inversa , • cromatograf ía de intercambio aniónico , • nanofiltración, • ultrafiltración/diafiltración; Abreviaturas Se usan las siguientes abreviaturas en la descripción de la invención:
DF: diafiltración HFE: hormona folículo estimulante; HFEr: HFE recombinante; HFEh: HFE humana; HFEh-r; HFE humana recombinante VL: Volumen de Lecho DEAE: dietilaminoetilo ELISA: inmunoensayo ligado a la enzima CAF: cromatografía de afinidad de tinte IMAC : cromatografía de afinidad de ion metálico Inmovi1izado DO: densidad óptica CIH: cromatografía de interacción hidrofóbica CLAR: cromatografía líquida de lata resolución EIRM: ensayo inmunoradiométrico . KD o kD: kiloDalton PCH: proteína de célula hospedera, proteínas que se originan de la célula hospedera usadas para expresión de HFE CEP: Controles en procesos EFI : Enfoque isoeléctrico PES: poliétersulfona FI-CLAR: Cromatografía líquida de lata resolución de fase inversa Q FF : intercambio aniónico en Sefarosa Q FF
TA: temperatura ambiente UF: ultrafiltración API : agua para inyección DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un método para purificar la HFE humana recombinante o una variante de la HFE recombinante, partiendo de un líquido que contiene la HFE cruda, que comprende las etapas de: (1) cromatografía de afinidad de tinte; (2) cromatografía de interacción hidrofóbica; y (3) cromatografía de fase inversa; las cuales se pueden llevar a cabo en cualquier orden . El método de purificación de la invención, proporciona un volumen de HFE recombinante de alta pureza, el cual puede entonces, ser formulado a un medicamento, por ejemplo, F-Gonal (Serono) . Tiene la ventaja de proporcionar un alto grado de pureza sin usar cromatografía de inmunoafinidad. La HFE cruda la cual forma el material de partida para la purificación de conformidad con la presente invención, consiste de cultivos celulares colectados que contienen la HFE recombinante. En una modalidad preferida, un antioxidante o un aminoácido libre o dipéptido con efecto antioxidante y depurador, está incluido en algunas o todas las etapas del
método de purif icación, de conformidad con la presente invención . Más precisamente , el antioxidante está presente en cualquiera de los amortiguadores usados para purificar y/o concentrar y/o filtrar la HFEh-r . El antioxidante previene la oxidación de la HFE durante el procesamiento . Un antioxidante preferido es L-metionina . Preferiblemente, la L-metionina se usa a una concentración de al menos o aproximadamente 10-100 mM. Ejemplos adicionales de un antioxidante incluyen, t-butil-4-metoxifenol, 2 , 6-bis (l, 1-dimetiletil) -4-metil fenol; bimeta-bisulfito de potasio o sido, bisulfito de sodio . Ejemplos de aminoácido libre y dipéptido con efecto antioxidante y depurador son, histidina, taurina, glicina, alanina, carnosina, anserina, 1-metilhistidina o combinaciones de los mismos . Típicamente, el material de partida es clarificado primero y después y opcionalmente, concentrado (por ejerrplo, usando ultrafiltración) y/o amortiguador intercambiado (por ejepplo, a través de una etapa de diafiltración) , antes de ser capturado en la primera etapa cromatográf ica . En las etapas de cromatografía, las resinas a base de agarosa y a base de polímero, pueden ser usadas . También es posible usar cromatografía de membrana, en la cual, la resina es reemplazada con una maribrana funcionalizada. Las 3 etapas de purificación de la presente invención ( es decir , cromatograf ía de afinidad de tinte , cromatografía de interacción hidrofóbica , cromatograf ía de fase inversa) , están en el siguiente subrayado , en más detalle .
La etapa de cromatografía de afinidad de tinte ( 1 ) El método de la invención involucra una etapa de cromatograf ía de afinidad de tinte (1) . En una modalidad preferida, la etapa de cromatografía de afinidad de tinte se lleva a cabo usando una resina que tiene un ligando inmovilizado un compuesto de tinte el cual es bien conocido por una persona experta en la técnica, es decir, Cibacron Blue F3G—A. El término "inmovilizado" es bien entendido por una persona experta en la técnica, y significa que el ligando es derivatizado en el sentido de que es químicamente ligado a la resina. Una resina particularmente preferida es Sefarosa Azul FF ( que se obtiene de Amersham Biosciences Inc . ) . Las características técnicas de Sefarosa Azul FF son como sigue :
Se entiende que el método puede ser realizado con resinas alternas, que tienen características similares. Ejemplos de resinas alternativas incluyen: Toyopearl AF-azul-HC-650m (Tosoh Bioscience) , Toyopearl SuperButilo 550, Toyopearl Fenil 650, Cellthru BigBead Azul (Sterogen) , SwellGel Azul (Pierce) , Cibacromo Azul 3GA-agarosa 100 (Sigma) , Affi-Gel Azul (BioRad) , cartuchos Econo-Pac azul (Bio-Rad) , sefarosa HP Azul (Amersham) , Cibacron Azul 3GA (Sigma) . La elución en la etapa de cromatografía de afinidad de tinte inmovilizado, debe preferiblemente, llevarse a cabo usando un amortiguador de fosfato, particularmente, de manera preferible fosfato de sodio. El pH del eluyente debe ser preferiblemente en o aproximadamente 6.0 en o aproximadamente 11.5, más preferiblemente en o aproximadamente 6.5 en o aproximadamente 8, particularmente, preferiblemente en o aproximadamente 7.0. Los amortiguadores alternos apropiados para mantener el pH de 7.0 incluyen los siguientes: MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, BES, MOPS, TES, HEPES. El amortiguador de elución para la etapa de cromatografía de afinidad de tinte, debe contener preferiblemente, una sal para incrementar la conductividad, preferiblemente NaCl. En una modalidad particularmente preferida, los amortiguadores que contactan el producto para la etapa de cromatografía de afinidad de tinte (equilibrio, lavado y
elución), contienen un antioxidante, tal como L-metionina. Ejemplos adicionales de un antioxidante incluyen, t-butil-4-metoxifenol, 2 , 6-bis (1, 1, -dimetiletil) -4-metil fenol; bimetabisulfito de potasio o sodio, bisulfito de sodio. La etapa de cromatografía de interacción hidrofóbica (2) El método también involucra una etapa de cromatografía de interacción hidrofóbica (2). En una modalidad preferida, la cromatografía de interacción hidrofóbica se lleva a cabo con una resina tal como Toyopearl Butilo 650M (que se obtiene de Tosoh Biosep Inc.) . Se entiende que la etapa (2) se puede realizar usando resinas alternas, que tienen características similares. Resinas alternativas que pueden ser usadas son como sigue: Fenil Sefarosa 6 de Flujo Rápido (bajo sub); Fenil Sefarosa 6 de Flujo Rápido (alto sub) ; Butilo Sefarosa 4 de Flujo Rápido; Octil Sefarosa 4 de Flujo Rápido; Fenil Sefarosa de Alta Resolución; SOURCE 15ET; SOURCE 15IS0; SOURCE 15PHE, todas de Amersham Biosciences (800) 526-3593; (véase www . amershambiosciences . com) . Resinas todavía adicionales son: Hidrocel C3 ó C4; Fenil Hidrocel de BioChrom Labs Inc. (812) 234-2558 (véase www.biochrom.com) . El enlace en la CIH de la resina, se logra en un amortiguador con una alta conductividad, obtenido a través de la adición de sal (NaCl, (NH4)2 ó NaS04, por ejemplo) . La elución en la etapa de cromatografía de interacción
hidrofóbica se lleva a cabo preferiblemente, reduciendo la conductividad de la fase móvil (reduciendo la concentración de sal) , usando un amortiguador que tiene un pH en o aproximadamente 6 o en o aproximadamente 8 , más preferiblemente, en o aproximadamente 6.5 en o aproximadamente 7.5, más preferiblemente en o aproximadamente 7). Un sistema particularmente preferido contiene fosfato de sodio para amortiguación, preferiblemente a un pH en o aproximadamente 7, y un sulfato de amonio. Amortiguadores alternativos son mencionados anteriormente. En una modalidad particularmente preferida, los amortiguadores que contienen producto para la etapa (2) de la CIH (equilibrio, lavado, elución) , contienen un antioxidante, tal como L-metionina. Los antioxidantes alternativos son mencionados anteriormente. La etapa de cromatografía de fase inversa (3) El método de la invención también comprende una etapa de cromatografía de fase inversa (CFI) (3) . La CFI se lleva a cabo preferiblemente, usando una resina tal como SOURCE 30 CFI (que se obtiene de Amersham Biosciences) . Se entiende que la etapa (3) puede ser realizada usando resinas alternativas, las cuales son bien conocidas por una persona experta en la técnica y las cuales tienen características similares . La cromatografía se lleva a cabo preferiblemente,
usando una amortiguación de fase móvil a pH medianamente alcalino, por ejemplo, en o aproximadamente 7-8.5, más preferiblemente en o aproximadamente 7.5 ó 7.6. En una modalidad preferida, la especie de amortiguación es acetato de amonio. Amortiguadores alternos adecuados para un pH en o aproximadamente 7.6 incluyen: BES, MOPS, Fosfato, TES, HEPES. Las soluciones amortiguadoras usadas para esta etapa también pueden contener un modificador orgánico, la concentración la cual es modulada por diferentes fases de la etapa de cromatografía (carga, lavado, elución y regeneración) . En una modalidad preferida, el modificador orgánico es un solvente orgánico miscible en agua, preferiblemente un alcohol (tal como metanol, etanol, etc.), más preferiblemente 2 -propanol
(iso-propanol) . En una modalidad particularmente preferida, los amortiguadores que contienen producto para la etapa de CFI (equilibrio, lavado, elución) , contienen un antioxidante, tal como antioxidantes alternos de L-metionina, son mencionados anteriormente . Etapa 0 de purificación adicional opcional -cromatografía de intercambio iónico Además de las 3 etapas de purificación principal-resumidas anteriormente- la presente invención puede incluir etapas de purificación adicionales. En una modalidad, el método de purificación de la
invención, involucra una etapa preliminar de cromatografía de intercambio iónico (0) llevada a cabo, preferiblemente con una resina de intercambio aniónico fuerte, particularmente, preferiblemente una resina de amonio cuaternario, tal como Sefarosa Q FF (que se obtiene de Amersham Biosciences), que tienen las siguientes características: Tipo de intercambiador iónico: Anión fuerte Capacidad total (mmol/ml) : 0.18-0.25 Límite de exclusión (proteínas globulares) : 4 x 106 Forma de lecho: esférico, diámetro 45-165 µm Estructura de lecho: agarosa reticulada, 6% Estabilidad de pH de operación: 2-12 Estabilidad de pH de limpieza: 1-14 Velocidad de flujo lineal a 25°C 1 bar 15 cm de altura de lecho, columna XK 50/30: 400-700 cm/h Alternativamente, la etapa (0) de cromatografía de intercambio iónico, se puede llevar a cabo usando una resina tal como Fractogel EMD TMAE HICAP (que se obtiene de Merck KGaA, Darmstadt Alemania) , o una resina que tiene características similares, véase abajo:
La etapa de cromatografía de intercambio iónico, se lleva a cabo preferiblemente, usando un amortiguador que tiene un pH medianamente alcalino (por ejemplo, en o aproximadamente 7.2 en o aproximadamente 9.0, en o aproximadamente 8.0 en o aproximadamente 9.0, más preferiblemente, en o aproximadamente 8.5). Los amortiguadores adecuados incluyen, por ejemplo, amortiguador de borato, trietanolamina/ácido iminodiacético Tris, acetato de amonio, tricina, bicina, TES, HEPES, TAPS. Más preferido es el amortiguador de borato, a un pH en o aproximadamente
8.5. La elución de la resina de intercambio iónico se logra incrementando la conductividad de la fase móvil a través de
la adición de sal, preferiblemente NaCl. En una modalidad particularmente preferida, los amortiguadores que contactan el producto para la cromatografía de intercambio iónico (equilibrio, lavado, elución) , contienen un antioxidante, preferiblemente L-metionina. Antioxidantes alternativos son mencionados anteriormente. De este modo, en una modalidad preferida, el método de la invención comprende las siguientes etapas: (0) cromatografía de intercambio aniónico, preferiblemente en una resina de intercambio aniónico fuerte,
[preferiblemente una resina de amonio cuaternario, tal como Sefarosa Q FF, o Fractogel EMD TMAE] ; (1) cromatografía de afinidad de tinte [preferiblemente en Sefarosa Azul FF] ; (2) cromatografía de interacción hidrofóbica
[preferiblemente en Toyopearl Butilo 650M] ; (3) cromatografía de fase inversa [preferiblemente en Source 30 CFI] . Etapa de purificación adicional opcional (-1) -ultrafiltración/diafiltración Antes de la etapa de cromatografía de intercambio iónico (0); puede ser deseable llevar a cabo una etapa de ultrafiltración, para concentrar la HFE cruda. La ultrafiltración (o diafiltración) , se lleva a cabo preferiblemente usando una membrana que tiene un valor límite
en o de aproximadamente 3-10 kD, más preferiblemente en o aproximadamente 8 kD. Etapa de purificación adicional opcional (4) - cromatografía de intercambio aniónico En una modalidad preferida adicional, el método de la invención también comprende una segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico (4). Una resina preferida es Fractogel EMD TMAE HICAP (que se obtiene de Merck KGaA, Darmstadt Alemania) , o una resina que tiene características similares, como se mencionó anteriormente. Alternativamente, la segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico, se puede llevar a cabo en Sefarosa Q FF, u otra resina que tiene características similares, como se mencionó anteriormente. Las etapas de cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de afinidad de tinte, cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH) , cromatografía de fase inversa y segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico, se pueden llevar a cabo en cualquier orden, aunque se prefiere llevar a cabo una etapa de cromatografía de intercambio aniónico primero. Las etapas restantes de cromatografía de afinidad de tinte, cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH) , CFI y segunda cromatografía de intercambio aniónico opcional, se pueden llevar a cabo en cualquier orden, aunque se prefiere seguir el orden mostrado
abajo: (0) cromatografía de intercambio aniónico, (1) cromatografía de afinidad de tinte, (2) cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH) , (3) cromatografía de fase inversa (CFI); y (4) segunda cromatografía de intercambio aniónico . Etapa de purificación adicional opcional (_5J -ultrafiltración/diafiltración En una modalidad adicional preferida, después de cualquiera de las etapas de cromatografía (particularmente después de una etapa de cromatografía de fase inversa) , la muestra de HFE es sometida a una etapa de concentración.
Preferiblemente, la etapa se realiza usando ultrafiltración combinada por diafiltración, para obtener un volumen que tiene la composición deseada. La ultrafiltración (o diafiltración) se lleva a cabo preferiblemente, usando una membrana que tiene un valor límite en o aproximadamente 3-10 kD, más preferiblemente, en o aproximadamente 5 kD. En una modalidad particularmente preferida, se llevan a cabo las siguientes etapas para mostrar lo siguiente: (-1) Ultrafiltración (preferiblemente con una membrana que tiene un valor límite en o aproximadamente 8 kD) , (0) cromatografía de intercambio aniónico
(preferiblemente usando una columna de Sefarosa Q FF (1) cromatografía de afinidad de tinte (preferiblemente usando una columna de Sefarosa Azul FF (2) cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH) (preferiblemente usando una columna Butilo 650M) ; (3) cromatografía de fase inversa (CFI) (preferiblemente usando una columna Source 30 de CFI) ; (4) cromatografía de intercambio aniónico sobre una resina de intercambio aniónico fuertemente básica (preferiblemente usando una resina hicap TMAE) ; y (5) ultrafiltración (preferiblemente con una membrana que tiene un valor límite de 5 kD) . Puede ser deseable someter la muestra de HFE a una etapa de nanofiltración, en particular, como una etapa de separación de virus; es decir, para reducir el riesgo de contaminación de la preparación de HFE con virus o partículas similares a virus que se originan del cultivo celular. La nanofiltración se puede hacer en cualquier etapa del proceso de purificación, sin embargo, es particularmente preferido, llevar a cabo la nanofiltración después de la 2da. etapa de cromatografía de intercambio iónico, o después de cromatografía de fase inversa o después de cromatografía de interacción hidrofóbica. La nanofiltración se puede realizar más de una vez, por ejemplo, se puede realizar dos veces. En una modalidad particularmente preferida, el
método de la invención comprende las siguientes etapas : (-1) Ultrafiltración (preferiblemente con una membrana que tiene un valor límite en o aproximadamente 8 kD) , (0) cromatografía de intercambio aniónico
(preferiblemente con Sefarosa Q FF) , (1) cromatografía de afinidad de tinte (preferiblemente, con Sefarosa Azul FF) , (2) cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH) (preferiblemente con Butilo 650M) , (3) cromatografía de fase inversa (CFI) (preferiblemente con Source 30 CFI) , (4) cromatografía de intercambio aniónico en una resina de intercambio aniónico fuertemente básica (preferiblemente resina TMAE hicap) ; (4') nanofiltración, (5) ultrafiltración (preferiblemente con una membrana que tiene un valor límite de 5 kD) . La ventaja de la presente invención es que el método de purificación está desprovisto de una etapa de cromatografía de inmunoafinidad de costo intensivo y proporciona de todos modos, un alto grado de pureza y bioactividad específica de la HFE. También, la HFE purificada de la presente invención, no contiene impurezas indeseadas agregadas por la cromatografía de inmunoafinidad (por
ej emplo , inmunoglobulinas lixiviadas de la resina) . Almacena e/ Liof ilización La composición líquida que resulta del proceso de purificación como se describe anteriormente y que contiene HFE purificada, se puede congelar para almacenaj e como está, o después de la purificación, el eluato puede someterse a liofilización ( "secado por congelamiento" ) , para remover el solvente . El líquido resultante o producto liofilizado es llamado "Volumen de HFE" . Formulaciones de HFE La HFE o una variante de la HFE de la invención o purif icada de conformidad con el método de la invenció , puede ser formulada para inyección , ya sea intramuscular o subcutánea , preferiblemente subcutánea . La formulación de HFE puede ser secada por congelamiento , en tal caso , se disuelve en agua para inyección solo antes de la inyección. La formulación de HFE puede también ser una formulación líquida, en tal caso, puede ser inyectada directamente, sin previa disolución. La formulación de HFE puede ser de dosis única o de dosis múltiple. Si es de dosis múltiple, debe contener preferiblemente, un agente bacterioestático tal como, por ejemplo, alcohol bencílico, meta-cresol, timol o fenol, preferiblemente alcohol bencílico o meta-cresol . Formulaciones de dosis única pueden también comprender un agente bacterioestático . La HFE de la invención, puede ser formulada con excipientes
y estabilizadores conocidos, por ejemplo, sacarosa y manitol. Puede también comprender un antioxidante, tal como metionina. Puede además, comprender un tensoactivo, tal como TWEEN (preferiblemente TWEEN 20) , o Pluronic (preferiblemente Pluronic F68) . En una formulación de dosis múltiple particularmente preferida, la HFE producida por el método de la invención, se formula disolviéndola en agua para inyección con sacarosa, amortiguador de fosfato (pH 7) , Pluronic F68, metionina y meta-cresol o alcohol bencílico. Una formulación de dosis múltiple líquida preferida particular de la HFE recambinante para inyección subcutánea o intramuscular es la siguiente:
Indicaciones La HFE de la invención, es adecuada para uso en todos los tratamientos en donde está indicada la HFE. Es particularmente adecuada para administración subcutánea en la inducción de ovulación, hiperestimulación ovárica controlada por tecnologías reproductivas asistidas y en el tratamiento de oligoespermia . Puede ser usada en conjunto con otras gonadotropinas, tales como HL y hCG. Puede también ser usada con compuestos adicionales, los cuales aumentan la respuesta a la HFE, tal como citrato de clomifen, inhibidores de aromatasa, tales como Anastrozol, Letrozol, Fadrozol y YM-511. Secuencias: SEC ID NO. 1: subunidad a de glicoproteína humana SEC ID NO. 2: subunidad ß de HFEh SEC ID NO . 3 : subunidad ß de HFEh variante 1 SEC ID NO . 4 : subunidad ß de HFEh variante 2 SEC ID NO. 5: subunidad ß de HFEh variante 3 La hormona folículo estimulante, u HFE, como se usa en este documento, se refiere a la HFE humana (HFEh) producida como una proteína madura de longitud completa. La HFE es un dímero compuesto de la subunidad alfa de glicoproteína humana. La secuencia de proteína de la subunidad alfa de glicoproteína humana se proporciona en la SEC ID NO: 1, y la secuencia de proteína de la subunidad beta
de la HFE humana se da en la SEC ID NO : 2. El uso del término "recombinante", se refiere a preparaciones de la HFE que son producidas a través del uso de tecnología de ADN recombinante (véase por ejemplo, documento WO 85/01958). Un ejemplo de un método para expresar la HFE usando tecnología recombinante es por transfección de células eucarióticas con secuencias de ADN que codifican una subunidad alfa y beta de HFE, sean proporcionadas en un vector o en dos vectores con cada subunidad que tiene un promotor separado, como se describe en las Patentes Europeas Nos. EP 0 211 894 y EP 0 487 512. El ADN que codifica la HFE puede ser un ADNc o puede contener intrones. Otro ejemplo del uso de tecnología recombinante para producir HFE es por el uso de recombinación homologa para insertar un segmento regulatorio heterólogo en conexión operativa a secuencias endógenas que codifican una o ambas subunidades de la HFE, cromo se describe en la Patente Europea No. EP 0 505 500 (Applied Research Systems ARS Holding NV) . También se contemplan métodos tales como aquellos descritos en el documento WO 99/57263 (Transkarotyc Therapies) , en donde una de las subunidades es insertada heterólogamente en una célula, y la otra subunidad es como se expresa por activación de secuencias genómicas por inserción de un segmento regulatorio heterólogo por recombinación homologa. El método de la invención puede ser usado para purificar la HFE expresada usando cualquiera de estos métodos
y otros métodos. La expresión "célula recombinante", se refiere a una célula producida insertando ADN heterólogo, que incluye cualquiera de los métodos mencionados anteriormente de manipulación genética. Preferiblemente, la HFE es producida recombinantemente en células de ovario de hámster Chino (CHO) , transfectadas con un vector o vectores que comprenden ADN que codifica para la subunidad alfa de glicoproteína humana y la subunidad beta de la HFE. El ADN que codifica las subunidades alfa y beta, puede estar presente en el mismo o diferentes vectores. La expresión "variante de HFE", significa abarcar estas moléculas que difieren en la secuencia de aminoácido, patrón de glicosilación o en enlace inter-subunidad a partir de la HFE humana, pero exhiben actividad de HFE. Ejemplos incluyen CTP-HFE, una HFE recombinante modificada de larga acción, que consiste de una subunidad a tipo nativa y una subunidad ß de tipo híbrida en la cual, el péptido carboxi terminal de la hCG ha sido fusionado al C-terminal de la subunidad ß de la HFE, como se describe en LaPolt et al . ; Endocrinology; 1992, 131, 2514-2520; o Klein et al.; Development and characterization of a long-acting recombinant hFSH agonist (por sus siglas en inglés, Desarrollo y caracterización de un agonista de HFEh recombinante de larga
duración); Human Reprod. 2003, 18, 50-56]. También está incluida CTP-HFE de cadena única, una molécula de cadena única, que consiste de las siguientes secuencias (de N-terminal a C-terminal) :
en donde ßHFE significa la subunidad ß de la HFE, ßCCh CTP (113-145) , significa el péptido carboxiterminal de la CGh y aHFE significa la subunidad a de la HFE, como se describe por Klein et al . [ Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chain recombinant human follicle-stimula ting hormone containing the human chor ionic gonadotrophin carboxyterminal peptide in the rhesus monkey
(por sus siglas en inglés, Farmacocinéticas y farmacodinámicas de hormona folículo estimulante humana recombinante de cadena única gue contiene el péptido carboxi terminal de gonadotropina coriónica en monos rhesus) ; Fertili ty & Sterili ty; 2002, 77, 1248-1255] . Otros ejemplos de variantes de HFE incluyen moléculas de HFE que tienen sitios de glicosilación adicionales incorporados en la subunidad a y/o ß, como se describe en el documento WO 01/58493 (Maxygen) , y moléculas HFE con enlaces S-S intersubunidades , como se describe en el documento WO 98/58957. Ejemplos adicionales de variantes de HFE incluyen moléculas quiméricas que comprenden secuencias a partir de la
HFE y secuencias a partir de hCG u HL, tales como aquellas descritas en los documentos WO 91/16922 y WO 92/22568. Las variantes de HFE referidas en este documento, también incluyen las supresiones carboxi terminal de la subunidad beta que son más cortas que la proteína madura de longitud completa de la SEC ID NO: 2. Las supresiones carboxi terminales de la subunidad beta humana, se proporcionan en las SEC IDS NOS: 3, 4 y 5. Se entiende que las variantes carboxi terminal de la cadena beta forman complejos con una subunidad alfa conocida para formar un heterodímero variante de la HFE. En una modalidad preferida, la HFE se produce recombinantemente en células CHO, ya sea en un suero o en un medio libre de suero. En una modalidad preferida, la HFE purificada producida de conformidad con el método de la invención, es adecuada para administración subcutánea, permitiendo la autoadministración por el paciente. La expresión "HFE recombinante cruda", se refiere al sobrenadante de cultivo celular a partir de células recombinantes que expresan HFE, antes de que se someta a cualquier etapa cromatográfica. La expresión abarca la forma pura del sobrenadante (como se aisla de las células) , así como también sobrenadante concentrado y/o filtrado y/o ultrafiltrado.
El término "actividad biológica" con relación a la actividad de la HFE, se refiere a la capacidad de una formulación de HFE para provocar respuestas biológicas asociadas con HFE, tal como ganancia de peso de ovario en ensayo Steelman-Pohley [Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chrorionic gonadotropin (por sus siglas en inglés, Ensayo de la hormona folículo estimulante basado en el aumento con gonadotropina coriónica humana); Endocrinology; 1953, 53, 604-616], o crecimiento folicular en un paciente femenino. El crecimiento folicular en un paciente femenino puede ser evaluado por ultrasonido, por ejemplo, en términos del número de folículos que tienen un diámetro medio en o aproximadamente 16 mm al día 8 de estimulación. La actividad biológica es evaluada con respecto a un estándar aceptado para HFE. El contenido de HL en una preparación de HFE puede ser medido, por ejemplo, usando un inmunoensayo específico de HL, tal como el Delfia HLh Spec (Wallac Oy, Turku, Finlandia) . El término "actividad específica", con referencia a
HFE, significa la actividad biológica en IU de la preparación en un ensayo biológico reconocido para HFE, tal como el bioensayo Steelman-Pohley [dividido por la cantidad de proteína, como se determina por un ensayo para el contenido total de proteína, tal como el ensayo Lowry [O. H. Lowry, N.
J. Rosebrough, A. L. Farr and R. J. Randall (1951) J". Biol . Chem . 193: 265; Hartree E. E. (1972). Anal . Biochem . 48: 422; J. R. Dulley and P. A. Grieve (1975) Anal. Biochem . 64: 136], el ensayo Bradford [Bradford, M. M. { 1916 ) Anal . Biochem . 72, 248] , o por absorbancia a 280 nm. Preferiblemente, la HFE obtenida por la invención, tiene una actividad específica mayor de o aproximadamente 8000 IU/mg, más preferiblemente mayor de o aproximadamente 9000 IU/mg, aún más preferiblemente mayor de o aproximadamente 10000 IU/mg, aún más preferiblemente en o aproximadamente 14000 IU/mg, en donde la actividad biológica se mide por el bioensayo Steelman-Pohley y el contenido de proteína se mide por SE-CLAR. Las muestras de HFE pueden ser analizadas con respecto a su pureza en varias etapas del procedimiento usando, por ejemplo, técnicas tales como aquellas listadas abajo: Cuantificación de HFEh-r/subunidad alfa libre/pureza/formas oxidadas: FI-CLAR Como se mencionó anteriormente, la HFE es una glicoproteína heterodimérica, compuesta de una subunidad a y ß. Alguna disociación de las subunidades puede ocurrir, y esta puede ser monitoreada observando la cantidad de la subunidad a libre presente en una muestra. Además, las subunidades de HFE pueden llegar a oxidarse. Los
contaminantes oxidados pueden ser cuantificados usando FI-CLAR, mientras las subunidades libres pueden ser valoradas usando SDS-PAGE. Cuantificación de HFEh-r: Inmunoensayo El contenido de HFE en una muestra, puede ser determinado usando un inmunoensayo específico para HFE, tal como el inmunoensayo de HFE DELFIA. Proteína total: ensayo Bradford, Ensayo Lowry, Absorbancia a 280 nm Como con cualquier preparación de proteína, el contenido total de proteína se puede determinar usando técnicas tales como un ensayo Bradford, un ensayo Lowry o por absorbancia a 280 nm. Patrones de isoformas: IEF Como se mencionó anteriormente, la HFE es una glicoproteína, que tiene residuos de oligosacárido múltiple unido en varios lugares en ambas subunidades. Los residuos de oligosacáridos pueden tener diferentes grados de ramificación y pueden ser tapados con residuos de ácidos siálicos. Los residuos de ácido siálico son negativamente cargados (a pH neutral) . Las diferencias en el tapado conducen a heterogeneidad, con una mezcla de especies que tienen diferentes puntos isoeléctricos (pl) . Esto se puede valorar usando una técnica que separa basada en la carga, tal como un enfoque isoeléctrico (EIE) .
Proteína de célula hospedera (PCH) La proteína de célula hospedera puede ser analizada usando un ensayo ELISA. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden originar en un "cultivo falso", el cual es un cultivo de células hospederas sin gen de la HFE. EJEMPLOS La presente invención será ahora ilustrada por medio de 2 ejemplos. Los diagramas de flujo correspondientes, que ilustran dichos 2 ejemplos, se presentan en las Figuras 1 y 2. La HFEh-r purificada resultante, es llamada el "volumen de HFEh-r" . EJEMPLO 1 (cotéjese Figura 1) Etapa (1): Cromatografía de afinidad de tinte en Sefarosa Azul El material de partida para la HFE para la purificación, se prepara de cultivos celulares colectados que contienen la HFE recombinante, es decir, la HFE la cual se produce recombinantemente en células CHO, ya sea en un suero o en un medio libre de suero. La columna de cromatografía de afinidad de tinte (resina Sefarosa Azul FF) , es primero equilibrada con un amortiguador de baja conductividad a un pH de 8.5 que contiene L-metionina. El líquido que contiene la HFE es entonces aplicado directamente a la resina. Después de la carga, el material no ligado es lavado usando amortiguador
de equilibrio. La HFE es finalmente eluida lavando a chorro la columna con amortiguador de fosfato de sodio a pH 7.0, que contiene NaCl y L-metionina. La combinación de elución es directamente procesada en la siguiente etapa. La etapa se realiza a 2-8°C. Etapa (2): Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (CIH) en Toyopearl Butilo 650M El eluato de Sefarosa Azul FF de la etapa (1) , es cargado en una columna de Toyopearl Butilo 650M y se equilibra contra un amortiguador de fosfato de sodio, a pH 7.0, que contiene sulfato de amonio y L-metionina. El material no ligado es lavado a chorro con amortiguador de equilibrio. La HFE es eluada con el mismo amortiguador, pero con una concentración reducida de sulfato de amonio. El eluato es procesado en la siguiente etapa. La etapa se realiza a TA. Etapa (3): Fase Inversa en Source 30 CFI El eluato de CIH (de la etapa (2)) es primero acondicionado por adición de IPA (isopropanol). Una columna de Source 30CFI es equilibrada contra un amortiguador de acetato de amonio, a pH 7.6, que contiene L-metionina, y 2-propanol a una concentración equivalente a aquella del material cargado acondicionado. Después de lavar a chorro el material no ligado con amortiguador de equilibrio, la resina es lavada con amortiguador de acetato de amonio, a pH 7.6,
que contiene L-metionina, y una concentración incrementada de
2-propanol. La HFE es finalmente eluida incrementando la concentración adicional de 2-propanol. La combinación de elución es finalmente diluida bajo agitación con agua que contiene L-metionina. La combinación diluida es procesada para la siguiente etapa. La etapa se realiza a TA. Después de seguir el procedimiento anterior, el factor de purificación - es decir, la relación de pureza de
HFE en la muestra purificada contra la pureza de HFE en el material de partida (HFE cruda), es aproximadamente 40.000. EJEMPLO 2 (cotéjese Figura 2) Etapa (-1): Ultrafiltración/Diafiltración de HFEh-r concentrada Todas las operaciones se realizaron en condiciones refrigeradas (2-8°C) . La HFE cruda que forma el material de partida para la purificación, se deriva de cultivos celulares colectados que contienen HFE recombinante. Clarificación La HFEh-r cruda, se filtró a través de un filtro de 0.5 µm de profundidad (tal como filtros Perfil II Pall o equivalente) . Ultrafiltración El crudo clarificado se concentró primero por ultrafiltración usando una membrana de poliéter sulfona de 10KD. Lo retenido concentrado entonces se diafiltró contra al
menos, 5 diavolúmenes de amortiguador de borato, a pH 8.5 que contiene L-metionina como antioxidante. La conductividad y pH de lo retenido se midió para monitorear el progreso de la diafiltración. Lo retenido fue entonces concentrado además, antes de drenar el sistema. La unidad de ultra-filtración fue finalmente lavada a chorro con amortiguador de diafiltración y el enjuague mezclado con lo retenido recuperado. La combinación se adelantó a la siguiente etapa. Filtración El producto concentrado se filtró a través de un filtro de poliéter sulfona de 0.2 µm (o equivalente) . Etapa (0) : Intercambio Aniónico en Sefarosa Q FF El material filtrado fue entonces aplicado a una resina de intercambio aniónico fuerte (Sefarosa Q FF) equilibrada contra amortiguador de borato de sodio, a pH 8.5, que contiene L-metionina. Después de la carga, la columna se enjuagó con amortiguador de equilibrio para lavar a chorro todo el material no ligado. La columna fue entonces eluida con amortiguador de borato de sodio, a pH 8.5, que contiene NaCl (para incrementar la conductividad) y L-metionina (como un antioxidante) . La elución de combinación colectada se procesó a la cromatografía de afinidad de tinte. Etapa (1) : Crcmatografía de afinidad de tinte en Sefarosa Azul La columna de cromatografía de afinidad de tinte (resina Sefarosa Azul FF) , fue primero equilibrada con el
amortiguador de elución de la etapa de Sefarosa Q FF. El eluato capturado fue entonces aplicado directamente a la resina. Después de la carga, el material no ligado se lavó usando amortiguador de equilibrio. La HFE fue finalmente eluida lavando a chorro la columna con amortiguador de fosfato de sodio a pH 7.0, que contiene NaCl y L-metionina. La combinación de elución fue directamente procesada a la siguiente etapa. La etapa se realizó a 2-8°C. Etapa (2): Cromatografía de Interacción Hidrofóbica en Toyopearl Butilo 650M El eluato de sefarosa azul FF se cargó en una columna de Toyopearl Butilo 650M equilibrada contra un amortiguador de fosfato de sodio, a pH 7.0, que contiene sulfato de amonio y L-metionina. El material no ligado se lavó a chorro con amortiguador de equilibrio. La HFE se eluyó con el mismo amortiguador, pero con una concentración reducida de sulfato de amonio. El eluato se procesó a la siguiente etapa. La etapa se realizó a TA. Etapa (3) : Fase Inversa en Source 30 CFI El eluato de CIH (de la etapa (2)), fue primero acondicionado por adición de IPA (isopropanol) . La columna de Source 30CFI fue equilibrada contra un amortiguador de acetato de amonio, a pH 7.6, que contiene L-metionina y 2-propanol a una concentración equivalente a aquella del material de carga acondicionado. Después de lavar a chorro el
material no ligado con amortiguador de equilibrio, la resina se lavó con amortiguador de acetato de amonio, a pH 7.6, que contiene L-metionina, y una concentración incrementada de 2-propanol . La HFE es finalmente eluida incrementando además, la concentración de 2-propanol. La combinación de elución es finalmente diluida bajo agitación, con agua que contiene L-metionina. La combinación diluida es procesada a la siguiente etapa. La etapa se realizó a TA. Etapa (4) cromatografía de intercambio aniónico en resina Fractogel EMD TMAE hicap Una columna de Fractogel EMD TMAE hicap, fue primero equilibrada con amortiguador de borato de sodio, a pH
8.5, que contiene L-metionina. El material post-CFI diluido
(de la etapa (3), fue cargado sobre la columna. El material no ligado se lavó a chorro usando amortiguador de equilibrio. La HFE es eluida de la columna incrementando la concentración de sal en una forma lineal. La etapa se realizó a 2-8°C. Etapa (4') Nanofiltración El eluato de la etapa (4) de Fractogel EMD-TMAE, se aplicó directamente a un dispositivo de nanofiltración de 20 nm a una presión de 3 bar bajo nitrógeno. Lo filtrado es procesado a la siguiente etapa. La operación se realizó a 2-8°C. Etapa (5) Ultrafiltración de Volumen El material de HFE nanofiltrada, se concentró por filtración de flujo tangencial en una membrana de poliéter
sulfona de 5 KD. Cuando lo retenido alcanzó aproximadamente la mitad del volumen final, el material fue intercambiado de amortiguador por diafiltración contra API. La Pureza de las Muestras Se determinó la pureza de las muestras de HFE después de las etapas de purificación:
Muestras de actividad biológica La actividad biológica de la HFEh-r purificada, fue medida usando el método de ganancia de peso de ovario Steelman-Pohley . La actividad específica se calculó usando la actividad biológica dividida por el contenido de HFE como se determina por un método de SE-CLAR, como se describe posteriormente . La actividad específica del volumen final obtenido, está típicamente entre 10 '0000 hasta 17 '000 IU/mg. Los valores
ejemplares para 2 muestras de una HFE de volumen final obtenidos siguiendo el método del Ejemplo 2, se dan en la Tabla 1. Tabla 2. Actividad específica del volumen de HFEhr purificada de la invención
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (28)
- REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Método para purificar HFE recombinante o una variante de HFE, caracterizado porque comprende someter un líquido que contiene HFE a: (1) una cromatografía de afinidad de tinte; (2) una cromatografía de interacción hidrofóbica; y (3) una cromatografía de fase inversa; las cuales pueden llevarse a cabo en cualquier orden.
- 2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cromatografía de afinidad de tinte de la Etapa (1) , se lleva a cabo con una resina que tiene Cibacron Azul F3G-A inmovilizado.
- 3. Método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la resina usada para cromatografía de afinidad de tinte de la Etapa (1) es Sefarosa Azul FF .
- 4. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la cromatografía de afinidad de tinte de la Etapa (1) , se lleva a cabo usando amortiguador de fosfato de sodio a un pH de o aproximadamente 6.5 a 11.5 como eluyente.
- 5. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH) de la Etapa (2), se lleva a cabo usando Toyapearl Butilo 650M, o una resina que tiene características similares.
- 6. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la etapa de cromatografía de interacción hidrofóbica de la Etapa (2), se lleva a cabo usando fosfato de sodio/sulfato de amonio como eluyente .
- 7. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la etapa de cromatografía de fase inversa de la Etapa (3), se lleva a cabo usando Source 30 CFI como resina.
- 8. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la etapa de cromatografía de fase inversa de la Etapa (3), se lleva a cabo usando acetato de amonio con 2-propanol como eluyente.
- 9. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque las etapas se llevan a cabo en el siguiente orden: (1) cromatografía de afinidad de tinte; (2) cromatografía de interacción hidrofóbica; y después, (3) cromatografía de fase inversa.
- 10. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque además comprende una etapa de cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (0) .
- 11. Método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la etapa de cromatografía de intercambio aniónico se lleva a cabo antes de las etapas (1), (2) y (3).
- 12. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque las etapas se llevan a cabo en el orden: (0) cromatografía de intercambio aniónico; (1) cromatografía de afinidad de tinte; (2) cromatografía de interacción hidrofóbica; y (3) cromatografía de fase inversa.
- 13. Método de conformidad con la reivindicación 10, 11 ó 12, caracterizado porque la cromatografía de intercambio aniónico de la Etapa (0), se lleva a cabo con resina Sefarosa Q FF o resina de Fractogel EMD TMAE HiCap.
- 14. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque la cromatografía de intercambio iónico de la Etapa (0), se lleva a cabo usando amortiguador de borato como eluyente.
- 15. Método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el amortiguador de borato está a un pH de o aproximadamente 8.5.
- 16. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, caracterizado porque además comprende una segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (4) .
- 17. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico de la Etapa (4) , se lleva a cabo después de las etapas (1), (2) y (3).
- 18. Método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque las etapas se llevan a cabo en el orden: (0) cromatografía de intercambio aniónico; (1) cromatografía de afinidad de tinte; (2) cromatografía de interacción hidrofóbica; (3) cromatografía de fase inversa; y (4) cromatografía de intercambio aniónico.
- 19. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque la segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico de la Etapa (4), se lleva a cabo usando resina Fractogel EMD TMAE HiCap o resina Q Sefarosa FF .
- 20. Método de conformidad con la reivindicación 16 a 19, caracterizado porque la segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico de la Etapa (4), se lleva a cabo usando amortiguador de borato y un gradiente de concentración de NaCl incrementada.
- 21. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizado porque comprende una etapa de nanofiltración de la etapa (4') , que lleva a cabo la segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (4) .
- 22. Método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende una etapa de ultrafiltración (5) , después de la etapa de nanofiltración (4') .
- 23. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque cualquiera de los eluyentes y/o amortiguadores, puede contener un anti-oxidante, en particular, L-metionina.
- 24. Método para purificar la HFE recombinante humana, caracterizado porque comprende las etapas de someter la HFE a: (-1) Ultrafiltración, (0) cromatografía de intercambio aniónico en Sefarosa Q FF con borato /NaCl, L-metionina a pH en o aproximadamente 8.5 como eluyente; (1) someter el eluato de la etapa (0) a una etapa de cromatografía de afinidad de tinte en Sefarosa Azul FF, y fosfato, NaCl, L-metionina, a un pH de o aproximadamente 7 como eluyente; (2) someter el eluato de la etapa (1) a una etapa de cromatografía de interacción hidrofóbica en Toyopearl Butilo 650M, con fosfato, sulfato de amonio, L-metionina, a un pH de o aproximadamente 7 como eluyente; (3) someter el eluato de la etapa (2) a una etapa de cromatografía de fase inversa en una Fuente 30 CFI con acetato de amonio, L-metionina, con 2-propanol a un pH de o aproximadamente 7.6 como eluyente; (4) someter el eluato de la etapa (3) a una etapa de cromatografía de intercambio aniónico en resina de Fractogel EMD TMAE hicap con borato, L-metionina, a un pH de o aproximadamente 8.5, y NaCl; (4') someter el eluato de la etapa (4) a una etapa de nanofiltración; y (5) someter lo permeado de la etapa (4') a una etapa de ultrafiltración.
- 25. HFE humana recombinante o variante de la HFE, caracterizada porque se puede obtener por el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.
- 26. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende HFE humana o una variante de la HFE de conformidad con la reivindicación 25, así como también un excipiente farmacéuticamente aceptable.
- 27. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque comprende la HFE de conformidad con la reivindicación 25, Pluronic F68, sacarosa, metionina, m-cresol y un amortiguador de fosfato acuoso a un pH de o aproximadamente 7.0.
- 28. Uso de una HFE humana recombinante o variante de la HFE de conformidad con la reivindicación 25, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos de fertilidad.
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