CN110658289B

CN110658289B - 一种含有多个半胱氨酸的rgd肽的纯化方法

Info

Publication number: CN110658289B
Application number: CN201911022218.6A
Authority: CN
Inventors: 王锡平
Original assignee: Chinapeptides Co ltd
Current assignee: Chinapeptides Co ltd
Priority date: 2019-10-25
Filing date: 2019-10-25
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2039-10-25
Also published as: CN110658289A

Abstract

本发明提供一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，这种RGD环肽具有的特征为含有2个以上的半胱氨酸，‑RGD‑序列，以及在此基础上的各种修饰肽。溶解的步骤包括将多肽溶于水和乙腈混合溶剂得到多肽溶液，并在其中加入少量还原性试剂；反相色谱柱分析的步骤包括将RGD多肽溶液接反相色谱分析柱进行梯度检测，得到分析图谱；反相制备色谱柱吸附及洗脱收集包括根据分析图谱设置制备色谱柱的制备梯度以及将RGD多肽溶液接制备色谱柱进行进样吸附并洗脱收集的步骤,的制备流动相需经过脱气及充氮气处理。纯化过程中解决了此类RGD多肽纯化过程中容易氧化以及氧化后形成同分异构体的问题，能够得到纯度大于98％的产品。

Description

一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法

技术领域

本发明涉及多肽技术领域，尤其涉及含有多个半胱氨酸易氧化的-RGD-多肽的纯化方法。

背景技术

癌症在世界上的发病率近年来呈急剧上升的趋势。研究发现肿瘤在生长过程中依赖于血管的生成，含有RGD序列的小肽即是穿膜肽，可以穿越细胞膜，又可以起到抑制血管生成的作用，从而抑制肿瘤细胞血管的形成、生长以及转移。因此，RGD多肽在癌症治疗中具有重大作用，有很大的市场价值。目前含有RGD序列的多肽研究越来越成熟，出现了一些RGD多肽的衍生多肽，例如在RGD多肽上偶联紫杉醇、金刚烷甲酸、吉西他滨等，还有一类为iRGD相似的序列，含有2个以上的半胱氨酸。

含有多个半胱氨酸的RGD多肽纯化比较困难，是由于多肽本身的性质决定的，在纯化过程中非常容易氧化。目前对这类多肽的制备方法报道很少，一般采用反相制备的方法纯化得到成品，但该方法无可避免的会导致在纯化过程中多肽已经氧化。而且，具有一对二硫键、多个半胱氨酸的RGD多肽在纯化时，会由于含有裸露的巯基而发生副反应而形成同分异构体。发生氧化后后续的还原过程比较繁琐，成本消耗较高。有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种RGD多肽的纯化方法，能够降低氧化的风险，使其更具有产业上的利用价值。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种克服现有生产工艺的不足、解决了含有多个巯基RGD多肽在纯化过程中容易氧化的问题的RGD序列多肽的纯化方法。

根据本发明的一方面提供了一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，该方法包括多肽的溶解、反相色谱柱分析和反相制备色谱柱吸附及洗脱收集的步骤。

根据本发明的另一方面提供了一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，上述溶解的步骤包括将RGD肽溶于溶剂中得到多肽溶液。

根据本发明的另一方面提供了一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，上述反相色谱柱分析的步骤包括将上述RGD多肽溶液接反相色谱分析柱进行梯度检测，得到分析图谱。

当作为反相色谱柱分析的梯度检测时，溶解后得到的多肽溶液过滤后进行粗品分析检测。

当作为反相制备色谱柱吸附及洗脱收集时，溶解后得到的多肽溶液用水稀释到合适的比例，进行进样吸附并洗脱收集。

当作为反相制备色谱柱吸附及洗脱收集时，洗脱多肽的溶液应进行脱除氧气，并充氮气处理。

根据本发明的另一方面提供了一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，上述反相制备色谱柱吸附及洗脱收集包括以下步骤：

(1)根据分析图谱设置制备色谱柱的制备梯度；

(2)将RGD多肽溶液接制备色谱柱进行进样吸附并洗脱收集。

进一步的，反相色谱柱分析的步骤包括将RGD多肽溶液接反相色谱分析柱进行梯度检测，得到分析图谱。

反相梯度检测分析条件为：

流动相：A液：0.05％～0.2％三氟乙酸的水溶液；B液：乙腈；

分析柱：Kromasil 100-5C18-MS 5um 4.6*250mm；

时间：0～20min；

流速：1mL/min；

A：B为：95～99：1～5到1～5：95～99；

波长：200～240nm。

进一步的，反相制备色谱柱吸附及洗脱收集包括以下步骤：

(1)根据分析图谱设置制备色谱柱的制备梯度。

(2)根据分析图谱对多肽粗品进行溶解，并加入相应的还原剂。

(3)洗脱缓冲液进行脱气以及充氮气处理。

(4)将RGD多肽溶液接制备色谱柱进行进样吸附并洗脱收集。

(5)收集洗脱出来的所有峰进行质谱确认及产品纯度检测。

反相制备条件为：

流动相：A液0.05％～0.2％三氟乙酸的水溶液，B液甲醇；

时间：0～60min；

流速：20.00mL/min；

A：B为：99～40：1～60到1～60：40～99；

波长：200～240nm。

产品纯度检测条件为：

色谱柱为C18柱，柱子型号为Innoval ODS-2 5μm 4.6*250mm，

流动相：A液：浓度为0.1-0.2％三氟乙酸水溶液，B液：乙腈；

时间：0～20min；

流速：1.00mL/min；

A：B为：98～68：2～32到2～32：68～98；

波长：200～240nm；

进样量：20μL。

根据本发明的另一方面提供了一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，上述RGD肽为具有-RGD-系列氨基酸的多肽，含有2个以上的半胱氨酸，或在此基础上的修饰肽；并分别具有如下的氨基酸序列：

SEQ ID No.1:CCRGDKGPDC(Disulfide Bridge:C2-C10)、

或SEQ ID No.2:CRGDRGPDC、

或SEQ ID No.3:CRGDRGCFGCG-(吉西他滨)。

根据本发明的另一方面提供了一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，上述溶剂为水、乙腈、甲醇、异丙醇、二甲基亚砜和甲酸中的一种或几种。

当作为反相色谱柱分析的梯度检测时，溶解RGD多肽的溶剂优选水-乙腈混合液。

当作为反相制备色谱柱吸附及洗脱收集时，溶解RGD多肽的溶剂优选水-甲醇混合液，多肽的浓度为1-20mg/ml，加水稀释后，甲醇的浓度为5％-15％。

根据本发明的另一方面提供了一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，上述溶剂含有二硫苏糖醇和巯基乙醇的一种或两种。

进一步的，溶解液中应加入巯基乙醇或二硫苏糖醇的一种或两种，多肽质量与还原剂质量比为1/40～1/1。

根据本发明的另一方面提供了一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，上述制备缓冲液需要脱除氧气，并充入氮气。

根据本发明的另一方面提供了一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，上述梯度检测的检测器为紫外检测器，且检测波长200～240nm。

根据本发明的另一方面提供了一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，上述反相制备色谱柱为C4柱、C8柱、聚合物柱和C18柱中的一种或几种。

进一步的，洗脱缓冲液需要脱去氧气，及充氮气处理。

根据本发明的另一方面提供了一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，上述反相制备色谱柱的流速为5～100ml/min。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1、本发明提供了一种用反相色谱系统纯化容易氧化的RGD多肽的简便方法，在容易氧化肽纯化中能够得到广泛的应用，解决了纯化过程中容易氧化，以及含多个半胱氨酸的多肽纯化过程中不稳定的问题，且冻干产品不需要另外的还原处理；

2、降低了样品在反相柱中的质量变化，提高了产品的收率，生产周期缩短，降低了能耗，降低了生产成本，能够一步实现产品的纯化，快速，简便，高效温和，缩短操作时间和可操作性，通过高效液相纯化，能够直接、简便地得到纯度为98％的RGD多肽单体；

3、能够直接、简便地从研发规模放大到生产容量。

附图说明

图1是本发明的一实施例中RGD肽的粗品分析图；

图2是本发明的一实施例中RGD肽的制备图；

图3是本发明的一实施例中纯品的质谱分析图；

图4是本发明的一实施例中纯品的液相分析图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

下述的实施例是对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

RGD序列多肽SEQ ID No.1：CCRGDKGPDC(Disulfide Bridge:C2-C10)

L-半胱氨酰-L-半胱氨酰-L-精氨酰-L-甘氨酰-L-天门冬氨酰-L-赖氨酰-L-甘氨酰-L-脯氨酰-L-天门冬氨酰-L-半胱氨酸(2号位半胱氨酰与10号位半胱氨酸巯基形成分子内二硫键)

分子量：1051.19

分子式：C38H62N14O15S3

结构图：

将1mg该RGD肽检测样品溶解于水和乙腈混合溶剂中(v：v＝9:1)，使用C18柱Kromasil 100-5C18-MS 5um 4.6*250mm进行梯度检测分析。反相分析条件为：流动相A液0.05％-0.2％三氟乙酸的水溶液，B液乙腈；时间：0-20min；流速：1.00mL/min；A：B为：99:1到5:95；波长：220n m。分析结果如图1所示，表明该流动相适合该肽的分析，粗品中的峰能够得到分离,粗品中杂质较多。

RGD多肽样品的溶解并处理：200mg RGD多肽粗品用30mL甲醇溶解，20℃下放置8h，加水稀释使甲醇浓度为10％。再加入10mg巯基乙醇，溶解完全后，用0.45μm有机相滤膜过滤后等待上样制备。

色谱条件为创新通恒公司的LC3000I高效液相色谱仪；流动相：浓度为0.05-0.2％三氟乙酸水溶液(A液)和甲醇(B液)；0到60min，A:B由96:4到70:30；流速20mL/min；波长220nm；色谱柱为Haobo D-C18 30*250mm，10μm。流动相A和B均先脱除气体，然后在充入氮气。将RGD多肽溶液通过6通道阀进行进样，制备柱吸附并洗脱收集。制备如图2所示，表明上述流动相和梯度适合Aβ1-42的制备分离，目标峰出峰时间为20.191min，峰型比较好。

由于样品稍微有点亲水，甲醇较乙腈洗脱能力弱，样品在柱中保留时间更长，制备峰型会更好。

收集洗脱出来的所有峰进行质谱确认及反相色谱检测纯度。质谱如图3所示，表明收集到的洗脱峰为目标峰，质谱正确；反相色谱检测如图4所示，表明：经纯化后RGD多肽的纯度为98.15％，该方法能够得到纯度比较高的产品。

反相检测条件：检测柱为Innoval ODS-2 5μm 4.6*250mm；流动相A液0.05％-0.2％三氟乙酸的水溶液，B液乙腈；时间：0-20min；流速：1.00mL/min；A：B为：95:5到60:40；波长：220nm。

将收集液冻干，称取质量，计算收率，收率为33.2％。

使用以上方法纯化SEQ ID No.2:CRGDRGPDC和SEQ ID No.3:CRG DRGCFGCG-(吉西他滨)都具有显著的效果。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州强耀生物科技有限公司

<120> 一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法

<141> 2019

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Cys Cys Arg Gly Asp Lys Gly Pro Asp Cys

1 5 10

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Cys Arg Gly Asp Arg Gly Pro Asp Cys

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Cys Arg Gly Asp Arg Gly Cys Phe Gly Cys Gly

1 5 10

Claims

1.一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，其特征在于：包括多肽的溶解、反相色谱柱分析和反相制备色谱柱吸附及洗脱收集的步骤；

所述溶解的步骤包括将RGD肽溶于溶剂中得到多肽溶液；

所述反相色谱柱分析的步骤包括将所述多肽溶液接反相色谱分析柱进行梯度检测，得到分析图谱；

所述反相制备色谱柱吸附及洗脱收集包括以下步骤：

(1)根据所述分析图谱设置制备色谱柱的制备梯度；

(2)将RGD多肽溶液接制备色谱柱进行进样吸附并洗脱收集；

色谱条件为：浓度为0.05-0.2％三氟乙酸水溶液A液和甲醇B液；0到60min，A:B由96:4到70:30；流速20mL/min；流动相需要脱除氧气，并充入氮气；

所述RGD肽为具有-RGD-系列氨基酸的多肽，含有2个以上的半胱氨酸；并分别具有如下的氨基酸序列：

SEQ ID No .1:CCRGDKGPDCDisulfide Bridge:C2-C10、或SEQ ID No .2:CRGDRGPDC、或SEQ ID No .3:CRGDRGCFGCG-吉西他滨；

所述溶剂为水、乙腈、甲醇、异丙醇和二甲基亚砜中的一种或几种；

所述溶剂含有巯基乙醇；

所述梯度检测的检测器为紫外检测器，且检测波长220nm；所述反相制备色谱柱为C18柱。