CN105223296B - 一类多肽的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类多肽的纯化方法，属于蛋白质与多肽纯化技术领域，通过制备型高效液相色谱仪纯化多肽，在制备型高效液相色谱仪的流动相的有机相中加入三氟乙醇或四氢呋喃，设定洗脱的梯度、流速及检测波长，得到高纯度的肽。该方法缩短了洗脱时间，减少了有机溶剂的用量，纯度高，分离效果好，节约了成本。

Description

一类多肽的纯化方法

技术领域

本发明公开了一类多肽的纯化方法，属于蛋白质与多肽纯化技术领域。

背景技术

多肽是一类介于氨基酸和蛋白质之间的物质，由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。已发现存在于生物体内的多肽达数万种。多肽是一种蛋白质的结构片段，能起到蛋白质的活性基团作用，是人体新陈代谢、调节活动的重要物质。随着生物技术的发展，多肽合成技术的日益成熟，但仍然存在多肽初品纯度较低，杂质复杂，尤其是杂质的理化性质和目标多肽十分相近，为分离纯化带来较大困难。传统的分离纯化技术，如通过溶液沉淀、萃取、层析、离子交换、重结晶等存在操作过程复杂，时间长，易失活，原料消耗多，回收率低等问题。而多肽的纯度是保证其生物活性的重要因素，因此，对多肽分离纯化技术的要求也进一步提高。

反相高效液相层析(RP-HPLC)是多肽分离纯化中经常采用的一种技术，特别适用于质量不大的蛋白质和多肽物质的分离纯化。这是因为:该法以水为基本组成部分, 这与多肽的生物学性质很相宜, 虽然流动相中的酸和有机溶剂, 以及固定相均可使肽的天然构象发生变化, 但当这些因素除去后, 肽的构象一般能恢复原状。因此在RP-HPLC中, 肽的活性回收率很高, 一般在85 %以上;与通常的柱层析等分离方法相比,RP-HPLC 具有速度快, 灵敏度高, 分辨率强等优点, 使之成为分离纯化生物样品的最有效方法之一, 在生化领域起着重要的作用。

卢鹤发表的《高效液相色谱法分离大豆蛋白肽》中用反相高效液相色谱法纯化分离纯化大豆多肽，最佳的分离条件为流动相从水：TFA=100:0.1到乙腈：TFA=100:0.1,梯度洗脱方式为凸形梯度，时间为80分钟，进样量5微升，检测波长：220nm,流速为1ml/min,最终得到单一的产物。可以见得，在纯化类似于大豆多肽这样的疏水氨基酸较多的高疏水肽时，需要大量的时间来走梯度，耗费了很多流动相，成本大大提高。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明通过调整流动相的组成和比例提供了一类疏水氨基酸含量百分比在25-40%的多肽纯化方法。

具体而言，本发明提供了一种利用反相高效液相色谱纯化疏水氨基酸含量百分比在25-40%的肽方法，在本发明中疏水氨基酸含量百分比等于疏水氨基酸的个数比上肽的总氨基酸个数。本发明通过在有机相中添加三氟乙醇或四氢呋喃，可减少流动相的使用量，降低成本，并且对于疏水肽来说，很好的控制保留时间和优化峰型，提高纯度。三氟乙醇能与水和多种有机溶剂相混溶，其粘度小，可以作为一种很好的溶剂，可做羧酸的保护性基团，正是因为三氟乙醇低亲核性和氟原子带来的化学稳定性，也是一些氟化反应和亲核性聚合物的优良溶剂，一些烯烃聚合时，三氟乙醇不仅可以比常规的溶剂如甲苯或甲醇高产率和反应速率，而且能大大改善聚合物的立体规整性。由于三氟乙醇独特的理化性质，能抑制肽的脱氨基作用或外消旋化等化学反应还能使多肽转化为稳定的α-螺旋结构，可以起到稳定肽的作用。

本发明的具体方案是：在多肽纯化的洗脱剂中加入三氟乙醇或四氢呋喃，优选在流动相的有机相中加入三氟乙醇或四氢呋喃，本发明所述的多肽为疏水氨基酸含量在25-40%的多肽，多肽的氨基酸个数小于等于50个，多肽分子量小于等于6000Da效果更好。其中尤其以多肽氨基酸个数在20-30个内效果更好。该类多肽可以是：卡贝缩宫素、比伐卢定、胸腺肽α1，醋酸艾赛那肽、醋酸替可克肽、醋酸阿肽地尔等。

利用制备型高液液相色谱仪纯化多肽，包括如下步骤：

（1）样品的处理。将样品加入有机溶剂中溶解，再加入纯水超声搅拌溶解直至澄清透明，用0.45u微孔滤膜过滤。

（2）流动相的配置。洗脱的流动相A为水相，流动相B为有机相，其中水相为体积分数0.1%三氟乙酸水溶液，有机相为三氟乙醇乙腈溶液或四氢呋喃乙腈溶液，三氟乙醇或四氢呋喃比乙腈体积比为1~3：5~8。

（3）设定洗脱的梯度、流速及检测波长。

（4）收集产物出峰位置的洗脱液。

（5）将洗脱液干燥后称重，计算收率。

本发明的方法达到如下有益效果：洗脱时间缩短，有机溶剂用量减少，纯度高，分离效果好，节约成本。

具体实施方式

以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。

以下实施例所使用的主要仪器、检测条件如下：

肽类制备仪器及条件

仪器：北京创新通恒LC6000制备型液相色谱，配备紫外检测器

制备柱：C18柱，柱长：30×250mm（填料粒径10um，孔径100 Å）

流动相：A相即水相，B相即有机相

时间及流动相梯度：制备梯度B%为15%-35%，制备时间5-40min

流速：25mL/min

检测波长：220nm

柱温：25℃

进样量：5mL

实施例一：

在上述肽类制备仪器及条件下，配置体积分数0.1%三氟乙酸（以下简称TFA）的纯水溶液作A相，用纯色谱级乙腈和色谱级三氟乙醇体积比7：3作为B相；将溶解过滤后的10mg/ml胸腺α1，粗品纯度为20%加入仪器进行制备,样品的出峰时间为15min ,将收集液干燥后进行称量分析，分离度为2.27，理论塔板数73157，信噪比419.1，回收率为31%，纯度为90%。

在相同的制备仪器及条件下，用相同浓度纯度的胸腺α1样品进行制备，将流动相改为A相为0.1%TFA水溶液，B相为纯乙腈，样品出峰时间为30min,将收集液干燥后进行称量分析，分离度为3.68，理论塔板数67492，信噪比687，回收率为23%，纯度为91%。与利用流动相为0.1%TFA水-体积比为7:3的乙腈、三氟乙醇混合溶液的制备方法相比纯度相当，回收率低8%，且多用了大约380ml 的流动相。

在相同的制备仪器及条件下，用相同浓度纯度的胸腺α1样品进行制备，将流动相改为A相为0.1%TFA水溶液，B相为三氟乙醇，样品出峰时间为13min, 将收集注干燥后进行称量分析，分离度为1.85，理论塔板数65325，信噪比373.89，回收率为23%，纯度为75%。与利用流动相为0.1%TFA水-体积比为7:3的乙腈、三氟乙醇混合溶液的制备方法相比流动相用量相当但纯度降低了15%。

实施例二：

称取胸腺肽α1粗品200mg, 粗品纯度16%，加入10ml乙腈充分搅拌直至浑浊，再加入30 ml纯水，超声搅拌直至澄清透明，用0.45u微孔滤膜过滤后，将样品全部打入LC6000型高效液相色谱中，其它条件不变，流动相改为A：0.1%TFA水， B：体积比为7:3的乙腈、四氢呋喃混合溶液，制备梯度变成0-5-45min,5-25-35%. 出峰时间为16min，得到样品纯度为99%，冻干后称重为14mg纯品，收率可达40%以上。

其它条件不变，将流动相换成A：0.1%TFA水， B：纯乙腈，样品出峰时间为28min，纯度为98%，冻干后称重为9mg，收率为28.1%。

实施例三：

称取胸腺肽α1粗品200mg, 粗品纯度20%，加入10ml乙腈充分搅拌直至浑浊，再加入30 ml纯水，超声搅拌直至澄清透明，用0.45u微孔滤膜过滤后，将样品全部打入LC6000型高效液相色谱中，其它条件不变，流动相改为A：0.1%TFA水，B：体积比为7:3的乙腈、三氟乙醇混合溶液，制备梯度为0-5-45min,5-25-35%.所收样品纯度为99%，冻干后称重为15mg纯品，收率可达37.5%。按照客户要求将流动相A置换为醋酸盐，流动相A为：5%醋酸水，流动相B：体积比为7:3的乙腈、三氟乙醇混合溶液，制备梯度为0-5-45min,5-25-35%.其它条件不变,所收样品纯度为99%，冻干后称重为16mg纯品，收率可达40%。

实施例四：

称取比伐卢定粗品200mg, 粗品纯度17%，加入15ml乙腈充分搅拌直至浑浊，再加入40 ml纯水，超声搅拌直至澄清透明，用0.45u微孔滤膜过滤后，将样品全部打入LC6000型高效液相色谱中，其它条件不变，流动相改为A：0.1%TFA水，B：体积比为8:1的乙腈、三氟乙醇混合溶液，制备梯度为0-7-50min,5-30-40%,所收样品纯度为98.5%，分离度为10.7，理论塔板数92501，信噪比462.5，冻干后称重为12mg纯品，收率可达35%以上。

将流动相换成A: 0.1%TFA水，B：三氟乙醇，制备梯度为0-7-50min,5-30-40%,所收样品纯度为78%，分离度为5.1，理论塔板数53204，信噪比412.9，冻干后称重为10mg纯品，收率不足30%。

实施例五：

称取卡贝缩宫素粗品200mg, 粗品纯度10%，加入100ml乙腈充分搅拌直至浑浊，再加入100 ml纯水，超声溶解后搅拌环化，环化浓度为1mg/ml.，将环化液的PH值调节至8-9之间，环化时间为30小时，通过LC-MS检测确认环化结束，将PH调节为5-6之间，用0.45u微孔滤膜过滤后，将样品打入LC6000型高效液相色谱中，流动相A为：0.1%TFA水，流动相B：体积比为8:3的乙腈、三氟乙醇混合溶液，制备梯度为0-7-50min,5-30-40%.所收样品纯度为98.5%，冻干后称重为8mg纯品，收率可达40%。

实施例六：

分别称取醋酸艾赛那肽、醋酸替可克肽、醋酸阿肽地尔粗品各400mg, 粗品纯度22%，加入100乙腈充分搅拌直至浑浊，再加入40 ml纯水，超声搅拌直至澄清透明，用0.45u微孔滤膜过滤后，将样品打入LC6000型高效液相色谱中，流动相A为：0.1%TFA水，流动相B：体积比分别为5：1的乙腈、三氟乙醇混合溶液，5：2的乙腈、四氢呋喃混合溶液、7：2的乙腈、四氢呋喃混合溶液，制备梯度均为0-5-45min,5-30-40%.所收样品纯度分别为92%、98%、97%，收率可分别达到37%、29%、35%。

Claims (2)

1.一类多肽的纯化方法，其特征在于利用制备型液相色谱仪纯化多肽，在流动相的有机相部分加入三氟乙醇或四氢呋喃；

包括如下步骤：

（1）将样品加入有机溶剂中溶解，再加入纯水超声搅拌溶解直至澄清透明，用0.45u微孔滤膜过滤；

（2）将样品放入制备型高效液相色谱仪中，洗脱的流动相A为水相，流动相B为有机相，其中水相为体积分数0.1%三氟乙酸水溶液，有机相为三氟乙醇乙腈溶液或四氢呋喃乙腈溶液，三氟乙醇或四氢呋喃比乙腈体积比为1~3：5~8；

（3）制备柱为C18柱，柱长30×250mm；设定洗脱的梯度B%为5%-25%-35%，制备时间0-5-45min或者B%为5%-30%-40%，制备时间为0-7-50min；流速25mL/min及检测波长220nm；柱温25℃；进样量：5mL；

（4）收集产物出峰位置的洗脱液；

（5）将洗脱液干燥后称重，计算收率；

所述多肽的为疏水氨基酸含量在25-40%的多肽且氨基酸个数为不大于50个；

所述多肽的分子量不大于6000Da。

2.根据权利要求所述的多肽，其特征在于所述多肽为卡贝缩宫素或比伐卢定或胸腺肽α1或醋酸艾赛那肽或醋酸替可克肽或醋酸阿肽地尔。