CN106167522A - 一种大规模分离纯化特立帕肽（Teriparatide）的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用反相高效液相色谱大规模分离纯化特立帕肽的一种方法，包括以下步骤：特立帕肽粗品溶解在30%乙腈水溶液中，超声处理，滤膜过滤，取滤液待用；使用高效液相色谱仪器对过滤后的粗品进行分离纯化；将浓缩液经过反相柱换盐转成醋酸盐；将转好醋酸盐且纯度99%以上产品进行减压旋蒸浓缩、冷冻干燥，得到粉末状产品，经检测合格即为最终产品。该方法操作方便，无需过多的生成设备；所得产品纯度高且生产收率高，产品纯度达到99%以上，纯化回收率达到60%以上；此工艺可满足大规模工业化生成的需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种大规模分离纯化特立帕肽的方法，特别涉及一种利用反相高效液相色谱大规模分离纯化特立帕肽（Teriparatide）的一种方法。
背景技术
特立帕肽是一种合成的34肽，为人甲状旁腺素PTH的1-34氨基酸片段，氨基酸顺序如下：
H-Ser1-Val2-Ser3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Met8-His9-Asn10-Leu11-Gly12-Lys13-His14-Leu15-Asn16-Ser17-Met18-Glu19-Arg20-Val21-Glu22-Trp23-Leu24-Arg25-Lys26-Lys27-Leu28-Gln29-Asp30-Val31-His32-Asn33-Phe34-OH
该片段是含有84个氨基酸的内源性甲状旁腺素PTH具有生物活性的N-末端区域。本品的免疫学和生物学特性与内源性甲状旁腺素PTH以及牛甲状旁腺素PTH（bPTH)完全相同。
特立帕肽是第一种获得美国食品与药品监督管理局FDA批准的骨形成剂类新药，这种甲状旁腺激素的衍生物可以通过增加成骨细胞的活性及数量而促进骨成长，而目前的常规骨质疏松药物一般只是作用于破骨细胞而减缓或阻断骨质流失。特立帕肽是由礼来药厂生产的，获准的是经由腿部或腹部的20mcg剂型。近期涉及到1637例绝经后骨质疏松症患者的临床研究结果显示，与那些只服用了钙和维生素D补加剂的患者相比，96%的患者在接受该药治疗后，其脊柱和臀部的骨（矿物质）密度BMD均表现出明显的增加，此外还发现，该药能够分别减少发生脊柱骨折和其它类型骨折危险的65%和53%。该药的另一个特点是副作用小，通常只是恶心、眩晕和腿痛性痉挛。
对于本品的纯化方法，已有专利技术进行公开。中国专利CN102993293A公开了以硫酸、醋酸溶液用氨水调pH值至5.0-6.0后的缓冲液进行纯化，收集95%-99%的样品进行调pH值至5.5-7.0后放置到2-8摄氏度2小时以上，使其析出，离心后取沉淀用60%磷酸水溶液溶解后，再用水稀释一倍，上反相柱后转盐，得到醋酸特立帕肽。其收率未在专利中体现。由于产品在盐析步骤中采用60%磷酸水溶液溶解，易导致多肽降解，造成收率不稳定。
专利CN102731643A公开了一种特立帕肽的纯化方法，采用水作为溶剂，然后以0.2%TFA/乙腈为流动相采用C18柱进行纯化，然后用0.2%醋酸/乙腈C18柱转盐，虽能得到较高纯度的特立帕肽醋酸盐产品，但总收率只有20%左右，不利于工业化生成。
为解决现有技术存在收率低的难题，提高醋酸特立帕肽的纯化收率，降低生成成本，还需要对纯化方法进行进一步的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大规模分离纯化特立帕肽的工艺方法，纯度高且收率好，达到工业化生成的要求。
本发明的技术方案如下：一种大规模分离纯化特立帕肽（Teriparatide）的方法，包括以下步骤：
1）特立帕肽粗品溶解在30%乙腈水溶液中，超声处理，滤膜过滤，取滤液待用；
2）使用高效液相色谱仪器对过滤后的粗品进行分离纯化：通过DAC-CXTH200制备动态轴向加压柱，流动相A为质量浓度0.05%~3.0%的醋酸铵缓冲溶液，并用醋酸或氨水调pH至4.0~7.0。流动相B为乙腈，进行梯度洗脱分离纯化，流速为700-1000ml/min，检测波长为220nm，分段收集目的峰；将分离纯化后的纯度99%以上高浓度目的肽溶液于水温不超过40℃下进行减压旋蒸浓缩，至约20-40mg/ml后备用。
3）将浓缩液经过反相柱换盐转成醋酸盐。
4）将转好醋酸盐且纯度99%以上产品进行减压旋蒸浓缩、冷冻干燥，得到粉末状产品，经检测合格即为最终产品。
具体地步骤2）中纯化条件为：通过DAC-CXTH200制备动态轴向加压柱，流动相A为醋酸铵缓冲溶液，用醋酸或氨水调pH；流动相B为乙腈，进行流动相梯度洗脱分离纯化，流速为700-1000ml/min，检测波长为220nm，分段收集目的峰；
步骤2）中纯化过程为：将色谱柱用流动相A平衡，上样品溶液，线性梯度洗脱60min，收集目的峰；将分离纯化后纯度99%以上高浓度目的肽溶液于不超过40℃的水温下进行减压旋蒸浓缩，浓缩后至约20-40mg/ml后备用；
步骤3）中转盐具体过程为：将色谱柱用流动相A平衡后上样，醋酸铵水溶液冲洗柱子3个柱体积，每一个柱体积约8分钟；最后用占本次冲洗体积总量50%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液，把样品冲洗下来；
步骤4）样品终处理：收集转好醋酸盐的肽溶液进行减压旋蒸浓缩至30-40mg/ml，得到纯度99%以上产品，再经过冷冻干燥，得到粉末状产品，经检测合格即为最终产品。
步骤1）所述的特立帕肽粗皮其溶解条件体积比：乙腈：水=30:70
步骤1）所述的特立帕肽粗品的一次上样量为60-100g。
步骤1）所述的滤膜的孔径为0.4-0.5μm。
步骤2）所使用的DAC-CXTH200制备动态轴向加压柱内装固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶。
步骤2）所述的流动相梯度选择0到60分钟A：B由（80~70）：（20~30）到（30~20）：（70~80）。
步骤2）所述的流动相其体系为水、乙腈体系，且水体系中加入质量百分浓度0.05%~3.0%醋酸铵作为离子对试剂,其pH值为4.0~7.0。
更为优选的方案是，步骤2）所述的流动相A，其醋酸铵的质量百分浓度为0.3%-0.8%，pH值为5.0-6.0%。醋酸铵浓度过低，影响分离效果；醋酸铵浓度过高，在生产过程中易析出，造成仪器和柱子损坏。pH值过高或过低，均影响部分缺失肽和封端肽的分离效果。
步骤3）所述的反相动态轴向加压柱转盐所用到的流动相为20~400mmol/L醋酸铵缓冲盐体系。
步骤3）中上样量为100-150g。
本发明的有益效果：本发明提出了一种大规模分离纯化特立帕肽的方法，使用反相高效液相色谱分离纯化特立帕肽，并在转盐过程中仍借助纯化色谱系统；操作方便，无需过多的生成设备；所得产品纯度高且生产收率高，产品纯度达到99%以上，纯化回收率达到60%以上；此工艺可满足大规模工业化生成的需求。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本发明的部分实施方式，而不是全部，不能理解为对本发明内容的限制。
实施例1
1.样品处理：每克特立帕肽粗品溶解于50ml体积比：乙腈：水=30：70的乙腈水溶液中，超声处理，待样品完全溶解后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
2.纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-CXTH200动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：质量百分浓度0.2%醋酸铵水溶液，用醋酸调pH值至5.0；B相：乙腈。流速700~1000ml/min。检测波长220nm。梯度：B%：20~70%（60min）。进样量为60g。
纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡后上样，上样量3L样品溶液。线性梯度洗脱60min，收集目的峰。将收集的纯度大于99%目的肽溶液于不超过40℃下进行减压旋蒸浓缩，至约20-40mg/ml后备用。
3.转盐：将色谱柱用流动相A平衡后上样，上样量100-150g，用40mmol/L醋酸铵水溶液冲洗柱子3个柱体积（一个柱体积约8分钟）；最后用占本次冲洗体积总量50%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液，把样品冲洗下来，收集转好醋酸盐的肽溶液进行减压旋蒸至30-40mg/ml，转至大小合适的不锈钢盘中。冷冻干燥后得到纯度大于99%的醋酸特立帕肽，纯化收率为60.2%。
实施例2
1.样品处理：每克特立帕肽粗品溶解于50ml体积比：乙腈：水=30：70的乙腈水溶液中，超声处理，待样品完全溶解后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
2.纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-CXTH200动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：质量百分浓度0.4%醋酸铵水溶液，用醋酸调pH值至5.5；B相：乙腈。流速700~1000ml/min。检测波长220nm。梯度：B%：25~75%（60min）。进样量为80g。
纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡后上样，上样量4L样品溶液。线性梯度洗脱60min，收集目的峰。将收集的纯度大于99%目的肽溶液于不超过40℃下进行减压旋蒸浓缩，至约20-40mg/ml后备用。
3.转盐：将色谱柱用流动相A平衡后上样，上样量100-150g，用40mmol/L醋酸铵水溶液冲洗柱子3个柱体积（一个柱体积约8分钟）；最后用占本次冲洗体积总量50%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液，把样品冲洗下来，收集转好醋酸盐的肽溶液进行减压旋蒸至30-40mg/ml，转至大小合适的不锈钢盘中。冷冻干燥后得到纯度大于99%的醋酸特立帕肽，纯化收率为64.3%。
实施例3
1.样品处理：每克特立帕肽粗品溶解于50ml体积比：乙腈：水=30：70的乙腈水溶液中，超声处理，待样品完全溶解后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
2.纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-CXTH200动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：质量百分浓度0.6%醋酸铵水溶液，用醋酸调pH值至6.0；B相：乙腈。流速700~1000ml/min。检测波长220nm。梯度：B%：30~80%（60min）。进样量为100g。
纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡后上样，上样量5L样品溶液。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于不超过40℃下进行减压旋蒸浓缩，至约20-40mg/ml后备用。
3.转盐：将色谱柱用流动相A平衡后上样，上样量100-150g，用40mmol/L醋酸铵水溶液冲洗柱子3个柱体积（一个柱体积约8分钟）；最后用占本次冲洗体积总量50%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液，把样品冲洗下来，收集转好醋酸盐的肽溶液进行减压旋蒸至30-40mg/ml，转至大小合适的不锈钢盘中。冷冻干燥后得到纯度大于99%的醋酸特立帕肽，纯化收率为62.5%。
本发明使用反相高效液相色谱法纯化特立帕肽，得到的醋酸特立帕肽，纯度高且收率好，提供了一条适于规模化生产特立帕肽的工艺方法，达到工业化生产要求。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种大规模分离纯化特立帕肽的方法，包括以下步骤：
1）样品处理：将特立帕肽粗品溶解在30%乙腈水溶液中，超声处理，滤膜过滤，取滤液待用；
2）纯化：a、纯化条件：通过DAC-CXTH200制备动态轴向加压柱，流动相A为醋酸铵缓冲溶液，用醋酸或氨水调pH；流动相B为乙腈，进行流动相梯度洗脱分离纯化，流速为700-1000ml/min，检测波长为220nm，分段收集目的峰；
b、纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡，上样品溶液，线性梯度洗脱60min，收集目的峰；将分离纯化后纯度99%以上高浓度目的肽溶液于不超过40℃的水温下进行减压旋蒸浓缩，浓缩后至约20-40mg/ml后备用；
3）转盐：将步骤2）中得到的浓缩液经过反相动态轴向加压柱完成离子交换转成醋酸盐；具体过程为：将色谱柱用流动相A平衡后上样，醋酸铵水溶液冲洗柱子3个柱体积，每一个柱体积约8分钟；最后用占本次冲洗体积总量50%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液，把样品冲洗下来；
4）样品终处理：收集转好醋酸盐的肽溶液进行减压旋蒸浓缩至30-40mg/ml，得到纯度99%以上产品，再经过冷冻干燥，得到粉末状产品，经检测合格即为最终产品。
2.根据权利要求1所述的一种大规模分离纯化特立帕肽的方法，其特征在于：步骤1）中特立帕肽粗品与乙腈溶液的质量体积比为1g/50ml。
3.根据权利要求1所述的一种大规模分离纯化特立帕肽的方法，其特征在于：所述的滤膜的孔径为0.4-0.5μm。
4.根据权利要求1所述的一种大规模分离纯化特立帕肽的方法，其特征在于：DAC-CXTH200制备动态轴向加压柱内装固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶。
5.根据权利要求1所述的一种大规模分离纯化特立帕肽的方法，其特征在于：流动相A的醋酸铵质量浓度为：0.05%~3.0%，pH值为4.0~7.0。
6.根据权利要求1所述的一种大规模分离纯化特立帕肽的方法，其特征在于：流动相A的醋酸铵质量浓度为：0.3%-0.8%，pH值为5.0-6.0。
7.根据权利要求1所述的一种大规模分离纯化特立帕肽的方法，其特征在于：步骤2）中的流动相梯度选择0到60分钟A：B由（80~70）：（20~30）到（30~20）：（70~80）。
8.根据权利要求1所述的一种大规模分离纯化特立帕肽的方法，其特征在于：步骤3）中反相动态轴向加压柱转盐所用到的流动相A为20~400mmol/L醋酸铵缓冲盐体系。
9.根据权利要求1所述的一种大规模分离纯化特立帕肽的方法，其特征在于：步骤2）中上样量为60-100g，步骤3）中上样量为100-150g。
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