CN102219849A

CN102219849A - 一种大规模分离纯化艾塞那肽的方法

Info

Publication number: CN102219849A
Application number: CN2011101059761A
Authority: CN
Inventors: 徐红岩; 张德志; 张宏伟; 杨翼
Original assignee: Glbetter Biochemical (shanghai) Co Ltd; WUXI ASIAPEPTIDE BIOTECHNOLOGY CO Ltd; Binhai Gl Peptide Co Ltd
Current assignee: Glbetter Biochemical (shanghai) Co Ltd; WUXI ASIAPEPTIDE BIOTECHNOLOGY CO Ltd; Binhai Gl Peptide Co Ltd
Priority date: 2011-04-27
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2031-04-27
Also published as: CN102219849B

Abstract

本发明涉及一种大规模分离纯化艾塞那肽的方法，特别涉及一种利用反相高效液相色谱大规模分离纯化艾塞那肽的一种方法。此方法解决了利用反相高相液相色谱法纯化艾塞那肽成本高、收率低、生产周期长等问题。包括以下步骤：1）艾塞那肽粗品溶解在醋酸乙腈水溶液中，超声处理，滤膜过滤，取滤液待用；2）使用高效液相色谱仪器对过滤后的粗品进行分离纯化；3）将分离纯化后的纯度98.5%%以上高浓度目的肽溶液进行减压旋蒸浓缩，浓缩液收集待用；4）将浓缩液经过反相动态轴向压缩柱采用离子交换法转成醋酸盐；5）将转好醋酸盐合格产品进行减压旋蒸浓缩、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检测合格即为最终产品。本发明所述的分离纯化方法适合于工业化分离纯化艾塞那肽。

Description

一种大规模分离纯化艾塞那肽的方法

技术领域

本发明涉及了一种多肽的大规模分离纯化方法，特别涉及一种大规模分离纯化艾塞那肽（Exenatide）的方法。

背景技术

糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血压为特征的代谢紊乱，高血压主要由胰岛素分泌或作用的缺陷引起。糖尿病可分两种，胰岛素依赖型糖尿病（I型糖尿病）和非胰岛素依赖型糖尿病（II型糖尿病），其中II型糖尿病患者占90%以上。WHO统计结果显示，目前全球已经诊断的II型糖尿病达到1.3亿人，我国已超过4000万人，是继印度之后的第二大糖尿病大国。

常用的II型糖尿病治疗药物包括：双胍类、磺脲类、α-葡萄糖甘酶抑制剂、噻唑烷二酮类及胰岛素等。但研究发现，这几类常用药物都有可能造成身体的不良反应，特别是二甲双胍，有导致患者乳性酸酸中毒的危险性：而胰岛素治疗也常导致低血糖的发生。因此迫切需要研制出新的II型糖尿病治疗药物。

1995年，美国专利（US5424286）公开了一种从南美大毒蜥（Gilka monster，Heloderma Horridum）的唾液中分离出来的一种含有39个氨基酸的多肽，Exendin-4（H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2）。其结构与人的胰高血糖素（Glucagon）有48%的同源性，与人的GLP-1（胰高血糖素样肽-1）有53%的同源性。

研究表明，作为GLP-1的类似物，Exendin-4能够与GLP-1受体作用，通过刺激胰岛β细胞再生，促进胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的释放，减慢胃排空速率，抑制食物摄入。其促进胰岛素分泌作用是根据血糖水平进行的，故可降低低血糖的发生率，且对其他促胰岛素分泌剂不敏感的II型糖尿病病人仍有降糖作用，同时GLP-1还可以减轻II型糖尿病患者的体重，是一类全新的糖尿病治疗药物。

2005年4月，美国礼来公司和艾米啉（Amylin）公司共同开发的糖尿病药物倍它（Byetta），化学名艾塞那肽（人工合成的Exendin-4）获美国FDA批准上市。与此同时，国外许多制药公司如诺和诺德制药公司、默克制药公司也在争相研发与倍它属于同类型的药物。另外，国内外少有对Exendin-4进行固相直接合成和分离纯化方法的相关文献，还没有文献具体研究艾塞那肽相关大规模的分离纯化方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一直大规模分离纯化艾塞那肽的方法，其技术思路是利用大型动态轴向压缩柱，根据反相高效液相色谱法大规模分离纯化艾塞那肽，并且利用大型动态轴向压缩柱将其转化成醋酸盐形式，达到生产周期短，效率高，成本低，规模化，主要解决现有分离纯化艾塞那肽存在成本高、收率低、生产周期长的技术问题。

本发明的技术方案如下：一种大规模分离纯化艾塞那肽的方法，包括以下步骤：

1）将艾塞那肽粗品溶解在醋酸乙腈水溶液中，超声处理，滤膜过滤，取滤液待用；

2）使用高效液相色谱仪器对过滤后的粗品进行分离纯化：通过DAC-HB200动态轴向压缩柱，流动相A为质量百分浓度0.1%-0.3%醋酸水溶液，B为质量百分浓度0.1%-0.3%醋酸乙腈溶液，进行梯度洗脱分离纯化，采用紫外检测器对样品进行检测，分段收集目的峰值的肽溶液；

3）将分离纯化后的纯度98%以上高浓度目的肽溶液进行减压旋蒸浓缩，浓缩液收集待用；

4）将浓缩液经过反相动态轴向压缩柱采用离子交换法转成醋酸盐；

5）将转好醋酸盐合格产品进行减压旋蒸浓缩、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检测合格即为最终产品。

步骤1）所述的艾塞那肽粗品其溶解条件体积比：醋酸∶乙腈∶水=1∶5∶40。

步骤1）所述的艾塞那肽粗品的一次上样量为80g-100g。

步骤2）所使用的DAC-HB200制备动态轴向压缩柱内装固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶。

步骤2）中的流动相梯度选择0到40分钟 A∶B由（90～70）∶（10～30 ）到（10～30）∶（90～70）。

步骤2）所述的流动相其体系为水、乙腈体系，加入质量百分浓度0.1%～0.3%醋酸作为离子对试剂。

步骤4）所述的反相动态轴向压缩柱转醋酸盐使用流动相为20～50mmol醋酸胺缓冲盐体系。

本发明的有益效果：本发明提出了一种大规模分离纯化艾塞那肽的方法，使用反相高效液相色谱分离纯化艾塞那肽，并在转盐环节借助与本身色谱系统，无需另外购买仪器和色谱柱，使用的流动相也是反相高效液相色谱中非常常用的试剂。通过此方法可以一次性生产成百上千克纯度达到98.5%的艾塞那肽纯品，此方法既大大提高了产品产量和收率，节省成本又能够简单、快速的得到纯度98.5%艾塞那肽的纯品，而且能够进行更大规模的工业化生产。

具体实施方式

实施例1

1、样品处理：称取80-100g艾塞那肽粗品溶解于10L体积比：醋酸∶乙腈∶水=1∶5∶40的醋酸乙腈水溶液中，超声处理，待样品完全澄清，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。

2、纯化：

纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-HB200动态轴向压缩柱，柱子直径和装填长度为：20cm×28cm。流动相：A：质量百分浓度0.1%醋酸水溶液；B：质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液。流速：1000ml/min。检测波长：230nm。梯度：0到40分钟A∶B由90∶10到10∶90。上样量为80g 。

纯化过程：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约8分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样80g。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集的目的肽溶液减压旋转蒸发至约10-50mg/ml后待用。

3、转盐：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约8分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液平衡柱子2个柱体积；上样100g-200g，用20mmol醋酸胺水溶液冲洗柱子3个柱体积；后用占本次冲洗体积总量95%超纯水和占本次体积总量5%色谱纯乙腈冲洗2个柱体积；最后用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液，把样品冲，把转好醋酸盐的肽溶液收集在旋转蒸发装置中进行，减压旋蒸至约5-10g/ml后转至大小合适的不锈钢盘中。冷冻干燥后得到纯度大于98.5%的醋酸艾塞那肽，最终计算分离纯化收率为40%。

实施例2

2、纯化：

纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-HB200动态轴向压缩柱，柱子直径和装填长度为：20cm×28cm。流动相：A：质量百分浓度0.2%醋酸水溶液；B：质量百分浓度0.2%醋酸乙腈溶液。流速：1000ml/min。检测波长：230nm。梯度：0到40分钟A∶B由80∶20到20∶80。上样量为90g 。

纯化过程：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度0.2%醋酸乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约8分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度0.2%醋酸乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样90g。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集的目的肽溶液减压旋转蒸发至约10-50mg/ml后待用。

3、转盐：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度0.2%醋酸乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约8分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度0.2%醋酸乙腈溶液平衡柱子2个柱体积；上样100g-200g，用30mmol醋酸胺水溶液冲洗柱子3个柱体积，后用占本次冲洗体积总量95%超纯水和占本次冲洗体积总量5%色谱纯乙腈冲洗2个柱体积；最后用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度0.2%醋酸乙腈溶液，把样品冲，把转好醋酸盐的肽溶液收集在旋转蒸发装置中进行，减压旋蒸至约5-10g/ml后转至大小合适的不锈钢盘中。冷冻干燥后得到纯度大于98.5%的醋酸艾塞那肽，最终计算分离纯化收率为45%。

实施例3

2、纯化：

纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-HB200动态轴向压缩柱，柱子直径和装填长度为：20cm×28cm。流动相：A：质量百分浓度0.3%醋酸水溶液；B：质量百分浓度0.3%醋酸乙腈溶液。流速：1000ml/min。检测波长：230nm。梯度：0到40分钟A∶B由70∶30到30∶70。上样量为100g。

纯化过程：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度0.3%醋酸乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约8分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度0.3%醋酸乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样100g，线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集的目的肽溶液减压旋转蒸发至约10-50mg/ml后待用。

3、转盐：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度0.3%醋酸乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约8分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度0.3%醋酸乙腈溶液平衡柱子2个柱体积；上样100g-200g，用40mmol醋酸胺水溶液冲洗柱子3个柱体积；后用占本次冲洗体积总量95%超纯水和占本次冲洗体积总量5%色谱纯乙腈冲洗2个柱体积；最后用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度0.3%醋酸乙腈溶液，把样品冲，把转好醋酸盐的肽溶液收集在旋转蒸发装置中进行，减压旋蒸至约5-10g/ml后转至大小合适的不锈钢盘中。冷冻干燥后得到纯度大于98.5%的醋酸艾塞那肽，最终计算分离纯化收率为50%。

实施例4

2、纯化：

纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-HB200动态轴向压缩柱，柱子直径和装填长度为：20cm×28cm。流动相：A：质量百分浓度0.1%醋酸水溶液；B：质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液。流速：1000ml/min。检测波长：230nm。梯度：0到40分钟A∶B由80∶20到20∶80。上样量为90g 。

纯化过程：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约8分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样90g。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集的目的肽溶液减压旋转蒸发至约10-50mg/ml后待用。

3、转盐：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约8分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液平衡柱子2个柱体积；上样100g-200g，用50mmol醋酸胺水溶液冲洗柱子3个柱体积；后用占本次冲洗体积总量95%超纯水和占本次冲洗体积总量5%色谱纯乙腈冲洗2个柱体积；最后用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液，把样品冲，把转好醋酸盐的肽溶液收集在旋转蒸发装置中进行，减压旋蒸至约5-10g/ml后转至大小合适的不锈钢盘中。冷冻干燥后得到纯度大于98.5%的醋酸艾塞那肽，最终计算分离纯化收率为52%。

实施例5

2、纯化：

纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-HB200动态轴向压缩柱，柱子直径和装填长度为：20cm×28cm。流动相：A：质量百分浓度0.3%醋酸水溶液；B：质量百分浓度0.3%醋酸乙腈溶液。流速：1000ml/min。检测波长：230nm。梯度：0到40分钟A∶B由90∶10到10∶90。上样量为100g。

纯化过程：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度0.3%醋酸乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约8分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度0.3%醋酸乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样100g。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集的目的肽溶液减压旋转蒸发至约10-50mg/ml后待用。

3、转盐：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约8分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度0.1%醋酸乙腈溶液平衡柱子2个柱体积；上样100g-200g，用50mmol醋酸胺水溶液冲洗柱子3个柱体积，后用占本次冲洗体积总量95%超纯水和占本次冲洗体积总量5%色谱纯乙腈冲洗2个柱体积；最后用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度0.3%醋酸乙腈溶液，把样品冲，把转好醋酸盐的肽溶液收集在旋转蒸发装置中进行，减压旋蒸至约5-10g/ml后转至大小合适的不锈钢盘中。冷冻干燥后得到纯度大于98.5%的醋酸艾塞那肽，最终计算分离纯化收率为55%。

Claims

1.一种大规模分离纯化艾塞那肽的方法，包括以下步骤：

1）艾塞那肽粗品溶解在醋酸乙腈水溶液中，超声处理，滤膜过滤，取滤液待用；

2）使用高效液相色谱仪器对过滤后的粗品进行分离纯化：通过DAC-HB200制备动态轴向压缩柱，流动相A为质量百分浓度0.1%-0.3%醋酸水溶液，流动相B为质量百分浓度0.1%-0.3%醋酸乙腈溶液，进行梯度洗脱分离纯化，采用紫外检测器对样品进行检测，分段收集目的峰值的肽溶液；

3）将分离纯化后的纯度98.5%以上高浓度目的肽溶液进行减压旋蒸浓缩，浓缩液收集待用；

2.如权利要求1所述的一种大规模分离纯化艾塞那肽的方法，其特征在于：DAC-HB200动态轴向压缩柱内装固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶。

3.如权利要求1所述的一种大规模分离纯化艾塞那肽的方法，其特征在于：醋酸乙腈水溶液配置时体积比：醋酸∶乙腈∶水=1∶5∶40。

4.如权利要求1所述的一种大规模分离纯化艾塞那肽的方法，其特征在于：步骤2）中的流动相梯度选择0到40分钟 A∶B由（90～70）∶（10～30 ）到（10～30）∶（90～70）。

5.如权利要求1所述的一种大规模分离纯化艾塞那肽的方法，其特征在于：步骤4）中将浓缩液经过反相动态轴向压缩柱完成离子交换转成醋酸盐，所用到的流动相为20～50mmol醋酸缓冲盐体系。