CN107312073A - 一种纯化分离西曲瑞克的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种纯化分离西曲瑞克的方法，包括如下步骤：将西曲瑞克粗品溶解于乙腈水溶液中，滤膜过滤，得粗品溶液待用；流动相A为磷酸二氢钠水溶液，流动相B为乙腈；用流动相A平衡反相色谱柱后，将粗品溶液载入到反相色谱柱中，采用梯度洗脱分离纯化；将纯度达99.5％以上目的肽溶液于水温不超过38℃下进行减压旋蒸浓缩；用醋酸水溶液平衡反相色谱柱后，将浓缩液上样至反相色谱柱中，用醋酸水溶液/乙腈体系进行转盐；转好醋酸盐且纯度99.5％以上目的肽溶液于水温不超过38℃下进行减压旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到粉末状西曲瑞克。获得的西曲瑞克不仅纯度高，而且收率好，达到工业化生成的要求，具有良好的经济价值和广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及多肽药物制备技术领域，具体涉及一种纯化分离西曲瑞克的方法。
背景技术
西曲瑞克是一种合成的10肽，是一种有效的黄体酮释放激素抑制素(LHRH)受体拮抗剂，它能控制卵巢的刺激作用，预防不成熟卵泡过早排出，帮助受孕。并可用于治疗乳腺癌和妇科癌，子宫内膜异位症、性早熟、子宫肌瘤、卵巢雄激素过多和经前综合症。由于西曲瑞克的自身物理性质而易被胃肠道中的酵素分解破坏，不能通过口服使用，因此常作注射用西曲瑞克制剂，通过皮下或肌肉注射吸收，迅速发挥作用。
西曲瑞克的序列如下：
Ac-D-2-Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2
目前尚未有西曲瑞克纯化方法的专利或文献，但从西曲瑞克的质量标准看，毒性杂质：脱酰胺西曲瑞克和乙酰化西曲瑞克杂质是产品纯度控制的关键点。
在生产西曲瑞克的过程中，我们也发现脱酰胺西曲瑞克杂质和乙酰化西曲瑞克杂质比较难分离，严重影响产品收率。
发明内容
本发明的目的是提供一种纯化分离西曲瑞克的方法，以解决现有技术的不足。
本发明采用以下技术方案：
一种纯化分离西曲瑞克的方法，包括如下步骤：
步骤1、将西曲瑞克粗品溶解于乙腈水溶液中，超声处理，滤膜过滤，得到粗品溶液待用；
步骤2、使用高效液相色谱法对粗品溶液进行分离纯化：色谱柱为反相色谱柱，流动相A为磷酸二氢钠水溶液，流动相B为乙腈；用流动相A平衡反相色谱柱后，将粗品溶液载入到反相色谱柱中，采用梯度洗脱分离纯化；
步骤3、将分离纯化后，纯度达99.5％以上目的肽溶液于水温不超过38℃下进行减压旋蒸浓缩，得到浓缩液待用；
步骤4、用醋酸水溶液平衡反相色谱柱后，将浓缩液上样至反相色谱柱中，用醋酸水溶液/乙腈体系进行转盐；
步骤5、转好醋酸盐且纯度99.5％以上目的肽溶液于水温不超过38℃下进行减压旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到粉末状西曲瑞克产品。
进一步地，步骤2流动相A为质量浓度0.03wt％～6.0wt％的磷酸二氢钠水溶液，并用磷酸调pH至2.5～4.5。
进一步地，步骤2流动相A为质量浓度0.2wt％～0.8wt％的磷酸二氢钠水溶液，并用磷酸调pH至3.0～4.0。
进一步地，步骤2按体积分数设置流动相梯度，0到60分钟A：B由80～65：20～35到40～25：60～75。
进一步地，步骤1中西曲瑞克粗品纯度不低于80％，脱酰胺西曲瑞克杂质含量不高于5％，乙酰化西曲瑞克杂质含量不高于1.5％。
进一步地，步骤1中乙腈水溶液为20-40v/v％乙腈水溶液。
进一步地，步骤1中用孔径为0.45μm滤膜过滤。
进一步地，反相色谱柱内的固定相为C18或C8反相填料。
进一步地，步骤4用0.05～1.0v/v％醋酸水溶液平衡反相色谱柱后，将浓缩液上样至反相色谱柱中，用0.05～1.0v/v％醋酸水溶液冲洗柱子3个柱体积；再用50％的乙腈和50％的0.05～1.0v/v％醋酸水溶液洗脱，收集洗脱液即转好醋酸盐的肽溶液。
进一步地，平衡、洗脱、冲洗反相色谱柱的流速根据反相色谱柱的规格进行设定，2*25cm反相色谱柱采用5～20ml/min的流速，其它规格的反相色谱柱流速线性放大。
本发明的有益效果：
本发明采用反相C18或C8柱、磷酸二氢钠缓冲体系(pH＝2.5-4.5)进行纯化分离。此纯化方法能有效分离西曲瑞克中的毒性杂质：脱酰胺杂质和乙酰化西曲瑞克杂质。本发明可有效解决现有技术中由于脱酰胺杂质和乙酰化西曲瑞克杂质未有效分离而存在收率低的难题，大大提高西曲瑞克的纯化收率，收率高达45％，降低生产成本。且所得西曲瑞克产物纯度高达99.5％。本发明方法只需要一次过柱即可同时分离西曲瑞克产品中的毒性杂质：脱酰胺西曲瑞克和乙酰西曲瑞克杂质，控制杂质含量小于0.1％，有效提高西曲瑞克产品的安全性。获得的西曲瑞克不仅纯度高，而且收率好，达到工业化生成的要求，具有良好的经济价值和广泛的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
一种纯化分离西曲瑞克的方法，包括如下步骤：
步骤1、将西曲瑞克粗品溶解于20-40v/v％乙腈水溶液中，超声处理，用孔径为0.45μm滤膜过滤，得到粗品溶液待用；西曲瑞克粗品纯度不低于80％，脱酰胺西曲瑞克杂质含量不高于5％，乙酰化西曲瑞克杂质含量不高于1.5％。
步骤2、使用高效液相色谱法对粗品溶液进行分离纯化：色谱柱为反相色谱柱，固定相为C18或C8反相填料，流动相A为磷酸二氢钠水溶液，磷酸二氢钠水溶液为质量浓度0.03wt％～6.0wt％的磷酸二氢钠水溶液，并用磷酸调pH至2.5～4.5，磷酸二氢钠浓度过低，影响洗脱能力，磷酸二氢钠浓度过高，在生产过程中易析出，造成仪器和柱子损坏，pH值过高或过低，会影响毒性杂质：脱酰胺西曲瑞克和乙酰化西曲瑞克的分离；优选地，为质量浓度0.2wt％～0.8wt％的磷酸二氢钠水溶液，并用磷酸调pH至3.0～4.0；流动相B为乙腈；用流动相A平衡反相色谱柱后，将粗品溶液载入到反相色谱柱中，采用梯度洗脱分离纯化，按体积分数设置流动相梯度，0到60分钟A：B由80～65：20～35到40～25：60～75。平衡、洗脱、冲洗反相色谱柱的流速根据反相色谱柱的规格进行设定，2*25cm反相色谱柱采用5～20ml/min的流速，其它规格的反相色谱柱流速线性放大。
步骤3、将分离纯化后，纯度达99.5％以上目的肽溶液于水温不超过38℃下进行减压旋蒸浓缩至浓度约10-20mg/ml，得到浓缩液待用；
步骤4、用0.05～1.0v/v％醋酸水溶液平衡反相色谱柱后，将浓缩液上样至反相色谱柱中，用0.05～1.0v/v％醋酸水溶液冲洗柱子3个柱体积；再用50％的乙腈和50％的0.05～1.0v/v％醋酸水溶液洗脱，收集洗脱液即转好醋酸盐的肽溶液。
步骤5、转好醋酸盐且纯度99.5％以上目的肽溶液于水温不超过38℃下进行减压旋蒸浓缩至10-20mg/ml，冷冻干燥，得到粉末状西曲瑞克产品。
根据西曲瑞克序列，采用Fmoc(N-芴甲氧羰基)策略，固相合成法逐步偶联获得西曲瑞克肽树脂，经裂解后得到386g西曲瑞克粗品，其纯度为86％，脱酰胺西曲瑞克杂质含量为2.8％和乙酰化西曲瑞克杂质含量为1.1％，用于以下实施例。
实施例1
1、取西曲瑞克粗品50g，每克西曲瑞克粗品溶解于100ml 35v/v％乙腈水溶液中，超声处理，待粗品完全溶解后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
2、纯化：反相色谱柱：以C18为固定相，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：质量浓度0.4wt％的磷酸二氢钠水溶液，用磷酸调pH值至3.3；B相：乙腈。流速800ml/min。检测波长220nm。将反相色谱柱用流动相A平衡后，将步骤1的滤液载入到反相色谱柱中。采用梯度：B％：22～62％(60min)进行洗脱，收集洗脱峰。
3、浓缩：将收集的纯度达99.5％以上目的肽溶液于不超过38℃下进行减压旋蒸浓缩，至约10-20mg/ml后备用。
4、转盐：将反相色谱柱用0.1v/v％醋酸水溶液平衡后，将步骤3浓缩液载入到反相色谱柱中，用0.1v/v％醋酸水溶液冲洗柱子3个柱体积；再用50％的乙腈和50％0.1v/v％醋酸水溶液洗脱，收集转好醋酸盐的肽溶液。
5、将步骤4转好醋酸盐的肽溶液进行减压旋蒸浓缩至10-20mg/ml，转至大小合适的不锈钢盘中，冷冻干燥后得到纯度大于99.5％的西曲瑞克，收率为45％。本实施例制备的西曲瑞克未检测出乙酰化西曲瑞克，脱酰胺西曲瑞克检测低于0.1％。
实施例2
1、取西曲瑞克粗品65g，每克西曲瑞克粗品溶解于100ml 35v/v％乙腈水溶液中，超声处理，待粗品完全溶解后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
2、纯化：反相色谱柱：以C18为固定相，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：质量浓度0.8wt％磷酸二氢钠水溶液，用磷酸调pH值至3.8；B相：乙腈。流速1000ml/min。检测波长220nm。将反相色谱柱用流动相A平衡后，将步骤1的滤液载入到反相色谱柱中。采用梯度：B％：20～60％(60min)进行洗脱，收集样品液。
3、浓缩：将收集的纯度达99.5％以上目的肽溶液于不超过38℃下进行减压旋蒸浓缩，至约10-20mg/ml后备用。
4、转盐：将反相色谱柱用0.1v/v％醋酸水溶液平衡后，将步骤3浓缩液载入到反相色谱柱中，用0.1v/v％醋酸水溶液冲洗柱子3个柱体积；再用50％的乙腈和50％0.1v/v％醋酸水溶液洗脱，收集转好醋酸盐的肽溶液。
5、将步骤4转好醋酸盐的肽溶液进行减压旋蒸浓缩至10-20mg/ml，转至大小合适的不锈钢盘中，冷冻干燥后得到纯度大于99.5％的西曲瑞克，收率为41％。本实施例制备的西曲瑞克未检测出乙酰化西曲瑞克，脱酰胺西曲瑞克检测低于0.1％。
Claims (10)
1.一种纯化分离西曲瑞克的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、将西曲瑞克粗品溶解于乙腈水溶液中，超声处理，滤膜过滤，得到粗品溶液待用；
步骤2、使用高效液相色谱法对粗品溶液进行分离纯化：色谱柱为反相色谱柱，流动相A为磷酸二氢钠水溶液，流动相B为乙腈；用流动相A平衡反相色谱柱后，将粗品溶液载入到反相色谱柱中，采用梯度洗脱分离纯化；
步骤3、将分离纯化后，纯度达99.5％以上目的肽溶液于水温不超过38℃下进行减压旋蒸浓缩，得到浓缩液待用；
步骤4、用醋酸水溶液平衡反相色谱柱后，将浓缩液上样至反相色谱柱中，用醋酸水溶液/乙腈体系进行转盐；
步骤5、转好醋酸盐且纯度99.5％以上目的肽溶液于水温不超过38℃下进行减压旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到粉末状西曲瑞克产品。
2.根据权利要求1所述的纯化分离西曲瑞克的方法，其特征在于，步骤2流动相A为质量浓度0.03wt％～6.0wt％的磷酸二氢钠水溶液，并用磷酸调pH至2.5～4.5。
3.根据权利要求1所述的纯化分离西曲瑞克的方法，其特征在于，步骤2流动相A为质量浓度0.2wt％～0.8wt％的磷酸二氢钠水溶液，并用磷酸调pH至3.0～4.0。
4.根据权利要求1或2或3所述的纯化分离西曲瑞克的方法，其特征在于，步骤2按体积分数设置流动相梯度，0到60分钟A：B由80～65：20～35到40～25：60～75。
5.根据权利要求1或2或3所述的纯化分离西曲瑞克的方法，其特征在于，步骤1中西曲瑞克粗品纯度不低于80％，脱酰胺西曲瑞克杂质含量不高于5％，乙酰化西曲瑞克杂质含量不高于1.5％。
6.根据权利要求1或2或3所述的纯化分离西曲瑞克的方法，其特征在于，步骤1中乙腈水溶液为20-40v/v％乙腈水溶液。
7.根据权利要求1或2或3所述的纯化分离西曲瑞克的方法，其特征在于，步骤1中用孔径为0.45μm滤膜过滤。
8.根据权利要求1或2或3所述的纯化分离西曲瑞克的方法，其特征在于，反相色谱柱内的固定相为C18或C8反相填料。
9.根据权利要求1或2或3所述的纯化分离西曲瑞克的方法，其特征在于，步骤4用0.05～1.0v/v％醋酸水溶液平衡反相色谱柱后，将浓缩液上样至反相色谱柱中，用0.05～1.0v/v％醋酸水溶液冲洗柱子3个柱体积；再用50％的乙腈和50％的0.05～1.0v/v％醋酸水溶液洗脱，收集洗脱液即转好醋酸盐的肽溶液。
10.根据权利要求1或2或3所述的纯化分离西曲瑞克的方法，其特征在于，平衡、洗脱、冲洗反相色谱柱的流速根据反相色谱柱的规格进行设定，2*25cm反相色谱柱采用5～20ml/min的流速，其它规格的反相色谱柱流速线性放大。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20171103 |
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