CN110256534B - 一种多臂抗癌偶联物的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种式(Ⅰ)化合物的纯化方法:
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,涉及可药用化合物的制备方法,具体涉及一种多臂抗癌偶联物的纯化方法。
背景技术
中国专利申请201710263114.9公开了一种多臂抗癌偶联物BGC0222,该化合物的结构如式(Ⅰ)所示:
该化合物为多臂偶联物化合物,其药物载体的基本结构为四臂聚乙二醇,该四臂聚乙二醇被称为4ARM-PEG-20K,其分子量约为20kDa左右,分子量大,结构复杂。在制备BGC0222的过程中,BGC0222的粗品中含有较多杂质,这些杂质主要为没有偶联完全的化合物,这些杂质的存在直接影响药物的载药量。为了提高药物的载药量,唯一的方法就是将这些没有偶联完全的化合物除去,以提高BGC0222的纯度,但是由于这些杂质分子量大,结构复杂,使用常规的分离方法很难将这些杂质去除干净。
本申请研发人员通过深入研究发现,利用离子对色谱法,使用反相HPLC纯化,并使用庚烷磺酸钠/磷酸二氢钠/水/乙腈体系做流动相,可以将这些杂质很好的去除,提高药物纯度,并应用到相关生产工艺上。但是由于庚烷磺酸钠在HPLC制备纯化后转化成庚烷磺酸,庚烷磺酸属于强酸,会和BGC0222成盐,利用弱酸无法将庚烷磺酸完全置换出来,使得在后续纯化的脱盐过程中,无法将庚烷磺酸彻底脱除干净,还有较多的庚烷磺酸和BGC0222成盐,直接影响了药物的纯度及后续成药用盐的稳定性。
发明内容
本发明的目的在于解决上述在纯化BGC0222的过程中,无法将庚烷磺酸彻底脱除干净的问题,提供一种能够纯化BGC0222的方法,从而达到最终纯化的目的,得到的纯品可以选择性的成盐。
该方法为:
(1)将BGC0222的粗品,利用离子对色谱法,使用反相HPLC进行第一步纯化,使用流动相进行梯度洗脱;
(2)第一步纯化后,进行预脱盐处理,使用流动相进行梯度洗脱;
(3)预脱盐处理完毕,使用流动相冲洗离子交换柱,达到平衡的目的;
(4)利用离子交换色谱法进行离子交换,进行第二步纯化,将残留的庚烷磺酸除去,得到纯的BGC0222。
其中,步骤(1)所使用的填料为苏州纳微科技的Unisil 10-300 C18,流动相水相为加入磷酸二氢钠作为缓冲盐的庚烷磺酸钠水溶液,流动相有机相为乙腈。优选0.02M磷酸二氢钠/0.0075M庚烷磺酸钠水溶液为流动相水相。
步骤(2)中,预脱盐的目的是将制备纯化分离得到的馏分中大量的盐先除掉一部分,因为太多的盐用离子交换方法无法脱除干净,超出填料的离子交换量。
预脱盐使用的流动相水相可以为醋酸水溶液、甲酸水溶液,有机相可以为甲醇、乙醇、乙腈中的一种或其混合溶液,优选5‰(v/v)醋酸水溶液作为流动相水相,乙腈作为流动相有机相。
由于BGC0222样品的水溶液呈粘稠状,步骤(4)分离纯化前的步骤(3),需要使用有机溶剂与水的混合溶液(即流动相)对离子交换柱进行冲洗,以达到降低样品过柱时的粘稠度,平衡离子交换柱的目的。使用的流动相水相为含有有机酸的水溶液,流动相有机相为乙腈、甲醇、乙醇中的一种或其混合溶液。
其中,有机酸可以为醋酸、甲酸、丙酸等,优选醋酸。最优选的流动相水相为5‰(v/v)醋酸水溶液,流动相有机相为乙腈,且醋酸水溶液和乙腈的体积比为3:2。
步骤(4)中,所使用的填料为阴离子交换填料,优选强碱型阴离子交换填料,更优选苏州纳微科技的UniGel-80Q填料。流动相和步骤(3)中所使用的流动相相同。
本发明最佳的纯化方案为:
(1)将BGC0222的粗品,利用离子对色谱法,使用反相HPLC进行第一步纯化,使用流动相进行梯度洗脱,所使用的填料为苏州纳微科技的Unisil 10-300C18,流动相水相为0.02M磷酸二氢钠/0.0075M庚烷磺酸钠水溶液,流动相有机相为乙腈;
(2)第一步纯化后,进行预脱盐处理,使用流动相进行梯度洗脱,5‰(v/v)醋酸水溶液作为流动相水相,乙腈作为流动相有机相;
(3)预脱盐处理完毕,使用流动相冲洗离子交换柱,流动相水相为5‰(v/v)醋酸水溶液,流动相有机相为乙腈,且醋酸水溶液和乙腈的体积比为3:2;
(4)利用离子交换色谱法进行离子交换,进行第二步纯化,所使用的填料为苏州纳微科技的UniGel-80Q,流动相水相为5‰(v/v)醋酸水溶液,流动相有机相为乙腈,且醋酸水溶液和乙腈的体积比为3:2,将残留的庚烷磺酸除去,得到纯的BGC0222。
经过上述纯化,可以得到纯度高达99%以上的BGC0222。经纯化后的BGC0222可选择性成盐,包括药学上可接受的无机盐和有机盐,典型的盐包括硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、甲酸盐、乳酸盐、苯甲酸盐、醋酸盐、三氟乙酸盐、二氯乙酸盐、三氯乙酸盐、混合的氯氟乙酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、磺酸盐、甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐等。
附图说明
图1:BGC0222粗品HPLC谱图,纯度<80%。
图2:BGC0222纯品HPLC谱图,纯度>99%。
具体实施例
在下面将对本发明进行详细描述。然而,本发明可能具体体现为许多不同的形式,而且它不应该被局限于此处所描述的实施例中,提供这些实施例中的目的是使所披露内容更完整与全面。所用试剂和原料,除了提供制备方法的除外,其余均为市售。除非另有定义,否则本文中所有科技术语具有的含义与权利要求主题所属技术领域人员通常理解的含义相同。
其中,BGC0222粗品按照201710263114.9所公开的方法制备。
实施例1
第一步纯化:
制备柱:300DAC 300×250mm,填料:Unisil 10-300 C18,流动相水相:0.02M磷酸二氢钠+0.0075M庚烷磺酸钠水溶液,流动相有机相:乙腈,检测波长:220nm;
BGC0222粗品200g,用10%(V/V)乙腈/水溶解后上样,HPLC制备纯化,梯度洗脱(时间:0~100min;流动相有机相浓度:20%~60%)收集纯度大于95%的组分作为第一步纯化的产物。
实施例2
预脱盐:
制备柱:300DAC,填料:Unisil 10-300 C18,流动相水相:5‰醋酸水溶液,流动相有机相:乙腈,检测波长:220nm;
将第一步纯化收集的纯品混合,进样,梯度洗脱(时间:0~80min;流动相有机相浓度:5%~80%),收集样品。
实施例3
平衡并进行第二步纯化:
填料:阴离子交换填料,型号:UniGel-80Q,数量:2L,柱子:玻璃柱(10*110cm),离子交换填料再生处理后,流动相洗涤离子交换柱,流动相水相为5‰(v/v)醋酸水溶液,流动相有机相为乙腈,且醋酸水溶液和乙腈的体积比为3:2,平衡后,上样,使用相同的流动相离子交换除盐,洗脱并收集产品。
实施例4
BGC0222盐酸盐的制备
加入盐酸水溶液搅拌均匀;将盐调整后的溶液浓缩后冻干,甲基叔丁基醚搅拌打浆,过滤,并用甲基叔丁基醚洗涤滤饼,干燥得BGC0222盐酸盐。
Claims (6)
1.一种式(Ⅰ)化合物的纯化方法,该纯化方法包括:
(1)将式(Ⅰ)化合物的粗品,利用离子对色谱法,使用反相HPLC进行第一步纯化,使用流动相进行梯度洗脱,所使用的填料为Unisil 10-300C18,流动相水相为加入磷酸二氢钠作为缓冲盐的庚烷磺酸钠水溶液,流动相有机相为乙腈;
(2)第一步纯化后,进行预脱盐处理,使用流动相进行梯度洗脱,所使用的填料为Unisil 10-300C18,流动相水相为醋酸水溶液或甲酸水溶液,流动相有机相为乙腈;
(3)预脱盐处理完毕,使用流动相冲洗离子交换柱,达到平衡的目的,流动相水相为醋酸、甲酸或丙酸水溶液,流动相有机相为乙腈;
(4)利用离子交换色谱法进行离子交换,进行第二步纯化,所使用的填料为UniGel-80Q,流动相为醋酸、甲酸或丙酸水溶液,流动相有机相为乙腈,将残留的庚烷磺酸除去,得到纯的式(Ⅰ)化合物。
2.如权利要求1所述的方法,步骤(1)中,流动相水相为0.02M磷酸二氢钠/0.0075M庚烷磺酸钠水溶液。
3.如权利要求1所述的方法,步骤(2)中,流动相水相为5‰醋酸水溶液。
4.如权利要求1所述的方法,步骤(3)中,流动相水相为5‰醋酸水溶液,流动相水相和有机相的体积比为3:2。
5.如权利要求1所述的方法,步骤(4)中,流动相水相为5‰醋酸水溶液,流动相水相和有机相的体积比为3:2。
6.如权利要求1-5任一所述的方法,其为:
(1)将式(Ⅰ)化合物的粗品,利用离子对色谱法,使用反相HPLC进行第一步纯化,使用流动相进行梯度洗脱,所使用的填料为苏州纳微科技的Unisil10-300 C18,流动相水相为0.02M磷酸二氢钠/0.0075M庚烷磺酸钠水溶液,流动相有机相为乙腈;
(2)第一步纯化后,进行预脱盐处理,使用流动相进行梯度洗脱,5‰(v/v)醋酸水溶液作为流动相水相,乙腈作为流动相有机相;
(3)预脱盐处理完毕,使用流动相冲洗离子交换柱,流动相水相为5‰(v/v)醋酸水溶液,流动相有机相为乙腈,且醋酸水溶液和乙腈的体积比为3:2;
(4)利用离子交换色谱法进行离子交换,进行第二步纯化,所使用的流动相水相为5‰(v/v)醋酸水溶液,流动相有机相为乙腈,且醋酸水溶液和乙腈的体积比为3:2,将残留的庚烷磺酸除去,得到纯的式(Ⅰ)化合物。
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液相色谱法纯化固相合成戈那瑞林;肖建国;阮振兴;王林鹏;籍晓涛;桑幼敏;宋成慧;万龙岩;宣坚钢;;化学与生物工程(第09期);全文 * |
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