CN104513218B - 一种高速逆流色谱分离黑果枸杞中矮牵牛素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高速逆流色谱分离黑果枸杞中矮牵牛素的方法。本发明利用高速逆流色谱并采用了合理的溶剂体系从黑果枸杞中获得高纯度的矮牵牛素，该技术不需要使用固相载体，无不可逆吸附，样品无损失、无污染、高效、快速、低成本分离制备矮牵牛素类花色苷，获得的矮牵牛素纯度可达97％以上。本发明工艺简单、操作方便、安全、重复性好，可工业化生产。

Description

一种高速逆流色谱分离黑果枸杞中矮牵牛素的方法
技术领域
本发明涉及一种利用HSCCC技术从黑果枸杞中提取分离矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷的方法。
背景技术
黑果枸杞所具有的耐干旱、耐盐碱、抗沙埋等特性使得其成为防风固沙、保持水土、改良土壤等不可多得的灌木品种。据藏医典籍《晶珠本草》和《四部医典》均记载：黑果枸杞味甘、性平、清心热、用于治疗心热病、心脏病、月经不调、停经的病症。《维吾尔药志》记载：黑果枸杞果实可治疗尿道结石、癣疥、牙龈出血等病症，民间则用做滋补强壮、明目以及降压药。唐古特白刺果实入药记载于《中国沙漠地区药用植物》，为一种传统的药材，多用于民间。
近来由于黑果枸杞的药效逐渐受到了关注，且我们推测其独特疗效与其果实中所含有的丰富的花青素类天然色素有关。黑果枸杞中花色苷的色谱分离手段不能实现对其高效、快速分离。传统研究中，通常使用多步硅胶柱层析以及联用制备液相等方法分离制备黑果枸杞中的矮牵牛素，不仅耗费时间长，不能在线检测，也会造成死吸附，损失较大，得率较低。
高速逆流色谱(High-speed counter-current chromatography，简称HSCCC)分离技术是一种连续高效的液-液分配色谱分离技术，它不用任何固态的支撑物或载体，利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量的固定相，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，特别适合于天然产物活性成分的分离。
目前还未见有人使用HSCCC技术对黑果枸杞中的矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷进行分离纯化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用HSCCC技术从黑果枸杞中提取分离矮牵牛素的方法。
具体地，本发明提供了一种高速逆流色谱分离黑果枸杞中矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷的方法，它包括如下操作步骤：
(1)粗提物的制备：
取黑果枸杞，用含1％-3％v/v甲酸的甲醇为溶剂提取，提取液过滤，滤液浓缩除去甲醇后，所得浸膏以1％-3％v/v甲酸水溶液溶解，上大孔树脂柱，依次用水、甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，浓缩干燥即得粗提物；
(2)采用高速逆流色谱法分离：
取甲基叔丁基醚∶正丁醇∶乙腈∶水＝1∶2.5∶1.5∶5，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取下相为固定相，上相位流动相；将固定相充满逆流色谱的色谱柱，在25～28℃下，主机正转，转速为800～1000r/min，然后1.0～2.5mL/min的流速泵入流动相，至两相溶剂在柱中达到平衡状态；步骤(1)制备的粗提物，以流动相为溶剂溶解，制备样品溶液；将样品溶液进样，在紫外检测器下监测，收集目标成分即可得到矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷。
进一步地，步骤(1)中，甲酸在甲醇或水中的含量为2％v/v。
进一步地，步骤(1)中，大孔树脂为D101、AB-8或X-5型大孔树脂，优选为D101。
进一步地，步骤(2)中，紫外检测波长为254～360nm，优选为280nm。
进一步地，步骤(2)中，转速为850r/min，流动相流速为2.0mL/min。
进一步地，步骤(2)中，每次进样的样品溶液量，以粗提物计为100～200mg。
进一步地，步骤(2)中，将样品溶液进样，在紫外检测器下接收出峰时间195～205min内的目标成分，即可得到矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷。
本发明利用高速逆流色谱并采用了合理的溶剂体系从黑果枸杞中获得高纯度的矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷，该技术不需要使用固相载体，无不可逆吸附，样品无损失、无污染、高效、快速、低成本分离制备矮牵牛素类花色苷，获得的矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷纯度可达97％以上。
本发明工艺简单、操作方便、安全、重复性好，可工业化生产。
附图说明
图1高速逆流色谱分离矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷谱图
图2矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷单体纯度测定
具体实施方式
实施例一：
1、粗提物制备
将100g黑果枸杞的干燥果实加入100mL甲醇(2％甲酸)提取24h，重复3次。合并3次提取液后用滤纸除去不溶物、蛋白质、多糖。收集滤液后旋转蒸发仪浓缩除去甲醇，浸膏采用蒸馏水(2％甲酸)复溶后上D-101大孔树脂(50mm×800mm)。大孔树脂经甲醇和水预处理。上样后先以3倍柱体积的蒸馏水冲柱以除去糖、氨基酸和其它杂质。然后再以甲醇冲柱，收集流出液后，减压浓缩干燥，即得粗提物。
2、高速逆流分离制备黑果枸杞花色苷
在分液漏斗中配制甲基叔丁基醚∶正丁醇∶乙腈∶水＝1∶2.5∶1.5∶5两相溶剂系统，充分振摇后静置过夜。下相为固定相，上相为流动相，使用前分别超声脱气30min。取100mg待分离样品粉末，震荡完全溶解于10mL下相溶液中，备用。
用15mL/min流速将溶剂系统下相泵入主机并充满分离螺线管，开启循环水浴并将温度设定为25℃。开启主机电源以850r/min正向旋转，待转速稳定后，以2.0mL/min流速泵入流动相，待流动相从管柱出口流出且基线稳定后，将样品溶液由进样圈注入。管柱出口处流出液在280nm波长下连续监测，根据逆流色谱图手动收集各色谱峰组分，从100mg待分离样品中一次性分离制备得到矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷8.9mg(出峰时间195min-205min)。HPLC检测纯度为97.1％。
HPLC分析条件：HPLC/DAD系统为Dionex系统(Sunnyvale，CA，USA)，配有P680HPLC泵；UltiMate 3000自动进样器；TCC-100柱温箱；Dionex PDA100检测器。色谱柱为C18ODS80Ts QA(150×4.6mm，5um i.d，Tosoh，Tokyo，Japan)，保护柱为C18柱(10×4.6mm，5umKromasil C18)。进样量10ul；检测波长为：525nm；DAD扫描波长为200-800nm。
3、矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷的结构鉴定
矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷的核磁数据
质谱数据：M+＝m/z 933
根据以上数据推断出以上化合物为矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷。
实施例二：
1、粗提物制备
将100g黑果枸杞的干燥果实加入100mL甲醇(2％甲酸)提取24h，重复3次。合并3次提取液后用滤纸除去不溶物、蛋白质、多糖。收集滤液后旋转蒸发仪浓缩除去甲醇，浸膏采用蒸馏水(2.％甲酸)复溶后上D-101大孔树脂(50mm×800mm)。大孔树脂经甲醇和水预处理。上样后先以3倍柱体积的蒸馏水冲柱以除去糖、氨基酸和其它杂质。然后再以甲醇冲柱，收集流出液后，减压浓缩干燥，即得粗提物。
2、高速逆流分离
在分液漏斗中配制甲基叔丁基醚∶正丁醇∶乙腈∶水(0.1％三氟乙酸)两相溶剂系统，充分振摇后静置过夜。下相为固定相，上相为流动相，使用前分别超声脱气30min。取100mg待分离样品粉末，震荡完全溶解于10mL下相溶液中，备用。
用16mL/min流速将溶剂系统下相泵入主机并充满分离螺线管，开启循环水浴并将温度设定为27℃。开启主机电源以900r/min正向旋转，待转速稳定后，以2.0mL/min流速泵入流动相，待流动相从管柱出口流出且基线稳定后，将样品溶液由进样圈注入。管柱出口处流出液在280nm波长下连续检测，根据逆流色谱图手动收集各色谱峰组分，从100mg待分离样品中一次性分离制备得到矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷7.2mg。HPLC检测纯度为98.2％。
实施例三：
1、粗提物制备
将100g黑果枸杞的干燥果实加入100mL甲醇(2％甲酸)提取24h，重复3次。提取过程为室温避光状态下进行。合并3次提取液后用滤纸除去不溶物、蛋白质、多糖。收集滤液后旋转蒸发仪浓缩除去甲醇，浸膏采用蒸馏水(2％甲酸)复溶后上D-101大孔树脂(50mm×800mm)。大孔树脂经甲醇和水预处理。上样后先以3倍柱体积的蒸馏水冲柱以除去糖、氨基酸和其它杂质。然后再以甲醇冲柱，收集流出液后，减压浓缩干燥，即得粗提物。
2、高速逆流分离
在分液漏斗中配制甲基叔丁基醚∶正丁醇∶乙腈∶水(0.1％三氟乙酸)两相溶剂系统，充分振摇后静置过夜。下相为固定相，上相为流动相，使用前分别超声脱气30min。取100mg待分离样品粉末，震荡完全溶解于10mL下相溶液中，备用。
用15mL/min流速将溶剂系统下相泵入主机并充满分离螺线管，开启循环水浴并将温度设定为26℃。开启主机电源以950r/min正向旋转，待转速稳定后，以2.5mL/min流速泵入流动相，待流动相从管柱出口流出且基线稳定后，将样品溶液由进样圈注入。管柱出口处流出液在280nm波长下连续检测，根据逆流色谱图手动收集各色谱峰组分，从100mg待分离样品中一次性分离制备得到矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷7.8mg。HPLC检测纯度为97.7％。

Claims (5)

1.一种高速逆流色谱分离黑果枸杞中矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷的方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：
(1)粗提物的制备：
取黑果枸杞，用含1％-3％v/v甲酸的甲醇为溶剂提取，提取液过滤，滤液浓缩除去甲醇后，所得浸膏以1％-3％v/v甲酸水溶液溶解，上D101大孔树脂柱，依次用水、甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，浓缩干燥即得粗提物；
(2)采用高速逆流色谱法分离：
取甲基叔丁基醚∶正丁醇∶乙腈∶水＝1∶2.5∶1.5∶5，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取下相为固定相，上相为流动相；将固定相充满逆流色谱的色谱柱，在25～28℃下，主机正转，转速为800～1000r/min，然后以1.0～2.5mL/min的流速泵入流动相，至两相溶剂在柱中达到平衡状态；步骤(1)制备的粗提物，以流动相为溶剂溶解，制备样品溶液；将样品溶液进样，在紫外检测器下监测，紫外检测波长为280nm，收集目标成分即可得到矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，甲酸在甲醇或水中的含量为2％v/v。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，转速为850r/min，流动相流速为2.0mL/min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，每次进样的样品溶液量，以粗提物计为100～200mg。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，将样品溶液进样，在紫外检测器下接收出峰时间195～205min内的目标成分，即可得到矮牵牛素-3-氧-芸香糖苷(反式-p-香豆酰基)-5-氧-葡萄糖苷。
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