CN106749456B - 一种从荷叶中分离高纯度金丝桃苷的方法 - Google Patents

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Abstract

一种从荷叶中分离高纯度金丝桃苷的方法。涉及一种从天然植物具体是从荷叶中分离高纯度金丝桃苷并同步制取荷叶总黄酮的方法，特别是采用常温弱碱水溶液超声辅助连续动态逆流浸提取代常规醇水热溶剂浸提，配合超滤去杂、纳滤溶剂回收、多组大孔吸附树脂分离技术提取，并分步洗脱收集高纯度金丝桃苷和其它荷叶总黄酮的方法。提供了一种功能因子明确、适合于工业化生产、成本低、纯度高、且环保节能的从荷叶中分离高纯度金丝桃苷的方法。本发明适合荷叶黄酮资源工业化开发利用。

Description

一种从荷叶中分离高纯度金丝桃苷的方法
技术领域
本发明涉及一种从天然植物具体是从荷叶中分离高纯度金丝桃苷并同步制取荷叶总黄酮的方法，特别是采用常温弱碱水溶液超声辅助连续动态逆流浸提取代常规醇水热溶剂浸提，配合超滤去杂、纳滤溶剂回收、多组大孔吸附树脂分离技术提取，并分步洗脱收集高纯度金丝桃苷和其它荷叶总黄酮的方法。
背景技术
从天然植物中提取有医疗保健价值的功能性活性黄酮，安全可靠，在国际市场上非常热销，开发的保健品也多种多样。国内市场上开发的荷叶减肥降血脂药品、保健品大多数也都添加了荷叶。荷叶中含有丰富的黄酮化合物，荷叶黄酮具有抑菌、抗氧化、抗癌变等生理活性，可有效防治高血压、高血脂等顽疾，降低心血管疾病、糖尿病、癌症和传染病导致的死亡率。荷叶黄酮作为原料或中间体，主要用于医药，也可用于功能食品和化妆品中。目前，国际市场上各种天然黄酮类化合物需求活跃，价格昂贵，估计市场价格约人民币6000元/kg。国内保守价格3000元/kg，相当于每亩荷叶精制黄酮的产值达到1.2万元，加工市场利润潜力巨大。
金丝桃苷又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，属于黄酮醇苷类化合物，具有保肝作用、心脑血管保护作用、神经系统保护作用、抗炎、防癌抗癌等药理活性。金丝桃苷具有广泛的药理活性和潜在的应用前景。
中国专利201310453086.9公开了“一种提取高纯度荷叶黄酮的方法”，荷叶粗粉加乙醇溶液取、大孔树脂进行纯化、高效液相色谱仪进行制备荷叶黄酮。
中国专利200610085626.2公开了“一种提取荷叶黄酮的工艺”，采用有机溶剂浸提-沉淀—萃取—超滤—大孔吸附树脂吸附联用技术精制荷叶黄酮的方法。
中国专利200610069039.4提供“一种采用聚酰胺分离纯化荷叶黄酮和荷叶生物碱的制备方法与用途”。包括聚酰胺分离纯化荷叶黄酮和荷叶生物碱的制备方法,其特征在于:以荷叶粗提物、膜分离除杂、树脂分离纯化、聚酰胺吸附荷叶黄酮,未被吸附部分得到荷叶生物碱。
中国专利02146370.0公开了“一种金丝桃苷的制备方法及药物新用途”，所用药材为黄蜀葵花，经加热回流或冷浸渗滤提取，提取液上聚酰胺树脂柱，真空干燥后用乙酸乙酯和乙醇混合溶剂提取，干燥后用醇复结晶得到金丝桃苷。
中国专利200810195922.7公开了“一种金丝桃苷的提取方法及其制剂和用途”，以黄蜀葵花为原料，用乙醇回流提取，再用正丁醇或乙酸乙酯萃取，真空干燥后用乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂回流提取，干燥后用乙醇重结晶得到金丝桃苷。
中国专利201010158044.9公开了“一种分离金丝桃苷的方法”，以山里红或山楂叶为原料，经回流提取，上大孔树脂柱，减压浓缩后上硅胶柱直接得到金丝桃苷。
中国专利201110075635.4公开了“罗布麻叶中金丝桃苷的制备方法”，罗布麻叶经加热回流提取、醇沉、上大孔树脂柱、萃取、重结晶得到金丝桃苷。
现有技术黄酮类化合物的提取存在如下缺点：1)黄酮类化合物种类较多，功能不尽相同，在开发应用中，应该明确功能因子以达到更好的使用效果，而现有技术中关于荷叶黄酮分离纯化技术都是以总黄酮含量为指标，缺少明确的功能因子，缺少关于黄酮单体提取方法；2)无论是荷叶中总黄酮提取，还是从其他天然植物中提取金丝桃苷，目前的技术都是用热的有机溶剂，而荷叶比重轻、体积大，因此在浸提阶段消耗的溶剂量较大，这样热量消耗量、溶剂消耗量与排放量就较大，难以满足节能减排的现代深加工要求；3)现有荷叶黄酮提取技术还停留在实验室阶段，很难实现工业化生产。
发明内容
本发明针对以上问题，提供了一种功能因子明确、适合于工业化生产、成本低、纯度高、且环保节能的从荷叶中分离高纯度金丝桃苷的方法。
本发明的技术方案是：包括如下步骤：
1)、粉碎：将洁净鲜荷叶干燥、粉碎，制得荷叶碎片；
2)、浸提：
2.1)、荷叶碎片常温下浸没在0.07～0.15moL/L碱性水溶液中预浸润12～24小时后得到浸润料和浸润液；
2.2)、将浸润料从超声逆流浸取器投料入口端投入，浸润液从残渣出口端补入，料液比为1:20～50，超声波动态逆流浸提槽中连续浸提荷叶有效成分30～50min，得到浸提液和残渣；
2.3)、对残渣进行压榨，然后用与残渣体积1:1的清水洗涤1～2次，洗水补入浸提液中得到料液；
3)、除杂：
3.1)、将料液pH调至中性，静置后，先用0.1～0.2μm的微滤膜去除残留微粒；
3.2)、再用截留分子量在2～10万的超滤膜在常温下进行超滤，至料液剩15～25％时，加水透析2～4次，加水量的限度为使超滤透过液中总黄酮浓度为0.8～1.5mg/mL，制得超滤液；
4)、上柱：
4.1)、大孔树脂聚酰胺树脂湿法装入树脂柱，水洗涤平衡后，将超滤液通入树脂柱，待检测漏出液的黄酮浓度达到初始浓度的12～18％时停止上柱，得吸附饱和的聚酰胺树脂柱；
4.2)、对吸附饱和的聚酰胺树脂柱采用2.0～4.0倍树脂体积的pH值为4～6、温度为10～15℃的水进行快速洗涤，去除杂质；
5)、梯度洗脱：
5.1)、用2.0～4.0倍树脂体积的8～12％体积溶度的乙醇水溶液洗脱步骤4)中聚酰胺树脂柱吸附的黄酮甙类化合物，得组分1；
5.2)、接着用2.0～4.0倍树脂体积的20～40％体积溶度的乙醇水溶液洗脱树脂吸附的中等极性的黄酮类黄酮化合物，得组分2；
5.3)、再用2.0～4.0倍树脂体积的45～50％体积溶度的乙醇水溶液洗脱，得组分3，该洗脱液弃用；
5.4)最后用2.0～4.0倍树脂体积的62～65％体积溶度的乙醇水溶液洗脱树脂中吸附的极性弱的黄酮类化合物，得组分4；
6)、再次上柱：
6.1)、蒸发掉组分2中的乙醇，补充水分使总黄酮浓度在1.0～2.0mg/mL，上HZ806树脂柱再次吸附，上柱流速为1.5～3BV/h，待检测漏出液的黄酮浓度达到初始浓度的10～20％时停止上柱；用蒸馏水或纯净水10～15℃下对HZ806树脂进行洗脱，除去水溶性杂质，得吸附饱和的HZ806树脂柱；
6.2)、对吸附饱和的HZ806树脂柱，后接处理好的直径与之相同的XDA-6大孔树脂柱，用流速为1.5～3BV/h的70％乙醇进行洗脱，乙醇用量为4～6BV，收集洗脱液得组分5；
7)、浓缩、干燥：
对组分1、组分4和组分5分别依次采用纳滤膜浓缩和真空浓缩后，进一步进行真空干燥或喷雾干燥制得荷叶总黄酮和金丝桃苷精细粉。
所述步骤1)中的荷叶碎片的尺度为2～4mm。
所述步骤2.2)中超声逆流浸取器的工作状态为：绞龙转速为0.1～0.5r.p.m，超声波功率为2.0～3.0kW/m3。
所述步骤3.1)中微滤的操作压力0.10～0.30Mpa；所述步骤3.2)中超滤的操作压力为0.10～0.20Mpa。
所述步骤4.1)中聚酰胺树脂柱的高径比为4～8:1，超滤液的上柱流速为1.5～4BV/h。
所述步骤步骤6.2)中HZ806树脂柱和XDA-6大孔树脂柱的高径比为4～8:1，二者装填量比为1:3～5。
所述步骤步骤7)中的采纳膜的截留分子量为100～200。
将使用过的聚酰胺树脂柱、HZ806树脂柱和XDA-6大孔树脂柱分别依次用2.0～4.0倍树脂体积，浓度为2％的碱、清水、浓度为2％的酸洗涤，使漏过液呈中性，再用95％的乙醇和清水洗涤，使树脂恢复吸附性能。
本发明在考虑提高浸提率的同时，以低能耗、低有机溶剂为研究方向，开发一条适合高效高纯度提取荷叶金丝桃苷的工业化生产技术路线。采用碱性水溶液常温超声波辅助逆流浸提，使得总黄酮提取率与传统有机热溶剂浸提工艺相当，采用微滤、超滤去除大分子杂质，提高吸附树脂的吸附容量，延长树脂的使用寿命。采用多个吸附树脂柱的吸附及梯度洗脱技术，最终分别得到得到较高浓度的金丝桃苷单体，并同步收集到了其它荷叶总黄酮。该过程洗脱液经过纳滤膜浓缩，减少了能量消耗，减少排放，其发明方法适合荷叶黄酮资源工业化开发利用。
本发明的有益效果是：1)根据荷叶黄酮主要是糖苷类化合物，亲水性强的特点，通过超声逆流浸提，除了超声空化作用加速有效成分的溶出，绞龙向前推进过程中，物料渣中有效成分减少，而逆流的溶剂中有效成分越来越多，逆流动态强化对流传质的优势得到充分体现，提高浸提率，并可实现连续化操作，减轻劳动强度，提高工作效率；
2)用常温碱性水溶液来提取荷叶黄酮，不需要采用有机溶剂，也不需要消耗大量热量，碱性水溶液可通过纳滤后循环使用，不仅降低开发利用成本，还减少了废液排放，满足节能减排的要求，保护环境；
3)采用超滤膜技术，截留了大分子杂质，提高了后续树脂的吸附容量和使用寿命纳滤膜浓缩，使得大量浸提水得到内循环使用；
4)采用至少3种吸附纯化树脂，其具有吸附容量大、选择性好、机械强度高、再生处理简单、吸附速度快、操作简单等特点，能分离高纯度的金丝桃苷，并同时获得了其他荷叶总黄酮，提高了分离效率。
附图说明
图1为本发明实施例1的HZ806和XDA-6大孔树脂处理前金丝桃苷HPLC图，
图2为本发明实施例1的HZ806和XDA-6大孔树脂处理后金丝桃苷HPLC图。
具体实施方式
本发明的从荷叶中分离高纯度金丝桃苷的方法，包括如下步骤：
1)、粉碎：将洁净荷叶干燥、粉碎，制得荷叶碎片，碎片的尺度为2～4mm，尺度太大总黄酮和金丝桃苷的浸出率低，粉碎太细，杂质溶出多，渣液分离困难；
2)、浸提：
2.1)、荷叶碎片常温(10～25℃，下同)下浸没在0.07～0.15moL/L碱性水溶液中预浸润12～24小时后得到浸润料(即浸润过的荷叶)和浸润液；
2.2)、将浸润料从超声逆流浸取器投料入口端投入，浸润液从残渣出口端补入，料液比为1:20～50(荷叶以质量计，碱液以体积计)，超声波动态逆流浸提槽中浸提荷叶有效成分，绞龙转速为0.1～0.5r.p.m，超声波功率为2.0～3.0kW/m3，连续操作30～50min，得到浸提液和残渣；碱性(如氢氧化钠、氢氧化钙或氢氧化钾等)水溶液预浸润后，淋出的可用于从残渣出口端补入；不够，可再补充配制好的碱性溶液；
2.3)、对残渣进行压榨，然后用与残渣体积1:1的清水洗涤1～2次，洗水补入浸提液中得到料液，所得到的荷叶总黄酮得率与传统乙醇热水溶液浸出率相当。
3)、除杂：
3.1)、将料液pH调至中性，静置后，先用0.1～0.2μm的微滤膜去除残留微粒，操作压力0.10～0.30Mpa；
3.2)、再用截留分子量在2～10万的超滤膜在常温下进行超滤，操作压力为0.10～0.20Mpa，至料液剩15～25％时，加水透析2～4次，加水量的限度为使超滤透过液中总黄酮浓度为0.8～1.5mg/mL(后续吸附上柱时的合适浓度)，制得超滤液；
4)、上柱：
4.1)、大孔树脂聚酰胺树脂(聚酰胺树脂为酰胺聚合而成的高分子物质，中等偏强极性树脂，为扬州制药厂生产，粒径分布0.25-1.15mm，比表面积600-800m2/g，孔容0.75～0.95mL/g，平均孔径6～8nm)湿法装入树脂柱，聚酰胺树脂柱的高径比为4～8:1，水洗涤平衡后，将超滤处理液通入树脂柱，上柱流速为1.5～4BV/h，待检测漏出液的黄酮浓度达到初始浓度的12～18％时停止上柱，得吸附饱和的聚酰胺树脂柱；
4.2)、对吸附饱和的聚酰胺树脂柱采用2.0～4.0倍树脂体积的pH值为4～6、温度为10～15℃的水进行快速洗涤，去除水溶性杂质；
5)、梯度洗脱：
5.1)、用2.0～4.0倍树脂体积的8～12％体积溶度的乙醇水溶液洗脱步骤4)中树脂吸附的黄酮甙类化合物，得到组分1，组分1为纯度>55％的黄酮甙类化合物；
5.2)、接着用2.0～4.0倍树脂体积的20～40％体积溶度的乙醇水溶液洗脱树脂吸附的中等极性的黄酮类黄酮化合物，得到组分2，组分2为纯度>84％的中等极性的黄酮类黄酮化合物，其中金丝桃苷含量>65％；
5.3)、再用2.0～4.0倍树脂体积的45～50％体积溶度的乙醇水溶液洗脱，得到组分3，该洗脱液弃用；
5.4)最后用2.0～4.0倍树脂体积的62～65％体积溶度的乙醇水溶液洗脱树脂中吸附的极性弱的黄酮类化合物，得到组分4，组分4为纯度>59％的极性弱的黄酮类化合物，几乎不含金丝桃苷。
6)、再次上柱：
6.1)、蒸发掉组分2中的乙醇，补充水分使总黄酮浓度在1.0～2.0mg/mL，上HZ806树脂柱再次吸附(HZ806树脂材料为聚丙烯酸酯型合成树脂中等极性，为华东理工大学华震公司生产，粒径分布0.3-1.25mm，比表面积400-600m2/g，孔容0.80～1.0mL/g，平均孔径7～8nm)，上柱流速为1.5～3BV/h，待检测漏出液的黄酮浓度达到初始浓度的10～20％时停止上柱；用蒸馏水或纯净水10～15℃下对HZ806树脂进行洗脱，除去水溶性杂质，得吸附饱和的HZ806树脂柱；
6.2)、对吸附饱和的HZ806树脂柱，后接处理好的直径与之相同的XDA-6大孔树脂柱(XDA-6为聚酰胺树脂弱极性树脂，郑州勤实科技有限公司生产，比表面积为550～650m2/g，平均孔径为3.2～4.2nm，粒径分布0.5～1.0mm)，HZ806树脂柱和XDA-6大孔树脂柱的高径比为4～8:1，两者装填量比为1:3～5，然后用流速为1.5～3BV/h的70％乙醇进行洗脱，乙醇用量为4～6BV，收集洗脱液得到丝桃苷纯度>90％的组分5。
7)、浓缩、干燥：
对组分1、组分4和组分5分别依次采用纳滤膜(截留分子量为100～200)浓缩和真空浓缩后，进一步进行真空干燥或喷雾干燥制得荷叶总黄酮和金丝桃苷精细粉。
将使用过的聚酰胺树脂柱、HZ806树脂柱和XDA-6大孔树脂柱分别依次用2.0～4.0倍树脂体积，浓度为2％的碱、清水、浓度为2％的酸洗涤，使漏过液呈中性，再用95％的乙醇和清水洗涤，使树脂恢复吸附性能。
下面结合实施例对本发明作具体说明。
以下实施例中，荷叶总黄酮测定采用的是以芦丁为标样的AlCl3—KAc比色法；金丝桃苷测定采用的是以金丝桃苷为标样的高效液相色谱法(HPLC)；检测仪器为安捷伦科技有限公司6460液质联用仪；色谱条件：Ultimate XB-C18色谱柱，流动相A：0.5％甲酸水溶液，流动相B：乙腈溶液，洗脱梯度：0min，12％B，0-22min，20％B，22-30min，30％B，30-38min，60％B，38-39min，12％B，39-43min，12％B；流速为1min/mL；柱温30℃；检测波长350nm，进样量为10μL。
实施例1
取粉碎过的干荷叶碎片500g，尺度在3mm左右，碎片常温下与0.09mol/L氢氧化钠水溶液预浸润18小时；将浸润过的荷叶从小型超声逆流浸取器投料入口端投入，浸取弱碱水溶液从残渣出口端补入，料液比1:40，超声波动态逆流浸提槽中浸提荷叶有效成分，绞龙转速0.3r.p.m，超声波功率为3.0kW/m3，荷叶碎片在浸提槽中停留时间35min，连续化操作；对残渣进行压榨，然后用与残渣体积为1:1的清水洗涤2次，洗水补入浸提液，测定总黄酮含量得浸提率为7.89％。而热醇水浸提(优化条件为80℃，60％乙醇浸提120min料液比1:40)总黄酮浸提率为8.42％。醇水浸提率略高，但荷叶使废弃资源，提取成本低。
将浸提液调节pH至中性，静置后，先用0.1μm的微滤膜去除残留微粒，操作压力0.10Mpa，再用截留分子量在5万超滤膜进行超滤，去除水溶性大分子杂质，超滤时为常温，压力为0.10MPa，直至料液剩15％时，加水透析2次，超滤透过液总黄酮浓度为0.8mg/mL，这样制得黄酮超滤处理液。
再将处理好的聚酰胺树脂，湿法装入树脂柱，柱的高径比为8:1，水洗涤平衡后，将超滤处理液缓慢通入树脂柱，荷叶黄酮样液浓度为0.8mg/mL，pH为7.0左右，上柱以流速1.5BV/h上样，检测漏出液黄酮浓度达到料液初始浓度的12％时停止上柱；对吸附饱和的聚酰胺树脂柱采用15℃、2.0倍树脂体积的pH值为4的蒸馏水或纯净水快速淋洗，有效去除杂质；
然后用2.0倍树脂体积的10％的乙醇水溶液洗脱树脂吸附的黄酮甙类化合物，得到组分11；接着用2.0倍树脂体积的30％乙醇水溶液洗脱树脂吸附的中等极性的黄酮类黄酮化合物，得到组分12，组分12的金丝桃苷HPLC图如图1所示，图中可以明确看出金丝桃苷已经得到初步纯化，但还存在多个杂质；再用2.0倍树脂体积的50％的乙醇水溶液洗脱，得到组分13,该洗液弃用；最后，用2.0倍树脂体积的65％的乙醇水溶液洗脱树脂中吸附的极性弱的黄酮类化合物，得到组分14。
蒸发掉组分12中乙醇，补充水分使总黄酮浓度在1.0mg/mL，上HZ806大孔树脂再次吸附，其条件为上柱以流速3BV/h上样，检测漏出液黄酮浓度达到初始浓度的15％时停止上柱；用蒸馏水或纯净水10℃下再次洗脱水溶性强的杂质。对吸附饱和的HZ806大孔树脂柱，后接处理好的XDA-6大孔树脂柱，两树脂柱直径相同，高径比为8:1，HZ806大孔树脂与XDA-6大孔树脂装填量比为1:3，用流速为2BV/h的70％乙醇进行洗脱，洗脱液用量为4BV，收集到组分15，如图2所示，图中可以明确看出：金丝桃苷含量进一步纯化，杂质峰少、含量低。
对组分11、组分14、组分15采用截留分子量为100的纳滤膜进行样品浓缩后，再进行真空浓缩，最后采用真空干燥得到荷叶总黄酮和金丝桃苷精细粉。测定其总黄酮和金丝桃苷含量和得率见表1。
实施例2
取粉碎过的干荷叶碎片1kg，尺度在2mm左右，碎片常温下与0.07mol/L氢氧化钙水溶液预浸润24小时；将浸润过的荷叶从小型超声逆流浸取器投料入口端投入，浸取弱碱水溶液从残渣出口端补入，料液比1:30，超声波动态逆流浸提槽中浸提荷叶有效成分，绞龙转速0.5r.p.m，超声波功率为2.5kW/m3，荷叶碎片在浸提槽中停留时间30min，连续化操作；对残渣进行压榨，然后用与残渣体积为1:1的清水洗涤2次，洗水补入浸提液；
将浸提液调节pH至中性，静置后，用0.2μm的微滤膜去除残留微粒，操作压力0.30Mpa，然后用截留分子量在2万超滤膜进行超滤，去除水溶性大分子杂质，超滤时为常温，压力为0.20MPa，直至料液剩20％时，加水透析3次，超滤透过液总黄酮浓度为1.232mg/mL，这样制得黄酮超滤处理液。
再将处理好的聚酰胺树脂，湿法装入树脂柱，柱的高径比为6:1，水洗涤平衡后，将超滤处理液缓慢通入树脂柱，荷叶黄酮样液浓度为1.22mg/mL，pH为7.0左右，上柱以流速4BV/h上样，检测漏出液黄酮浓度达到料液初始浓度的18％时停止上柱；对吸附饱和的聚酰胺树脂柱采用10℃、4.0倍树脂体积的pH值为5的常温蒸馏水或纯净水快速淋洗，有效去除杂质；
然后用4.0倍树脂体积的8％的乙醇水溶液洗脱树脂吸附的黄酮甙类化合物，得到组分21；接着用4.0倍树脂体积的20％乙醇水溶液洗脱树脂吸附的中等极性的黄酮类黄酮化合物，得到组分22；再用4.0倍树脂体积的45％的乙醇水溶液洗脱，得到组分23,该洗液弃用；最后，用4.0倍树脂体积的62％的乙醇水溶液洗脱树脂中吸附的极性弱的黄酮类化合物，得到组分24。
蒸发掉组分22中乙醇，补充水分使总黄酮浓度在1.5mg/mL，上HZ806大孔树脂再次吸附，其条件为上柱以流速2BV/h上样，检测漏出液黄酮浓度达到初始浓度的10％时停止上柱；用蒸馏水或纯净水15℃下再次洗脱水溶性强的杂质。对吸附饱和的HZ806大孔树脂柱，后接处理好的XDA-6大孔树脂柱，两树脂柱直径相同，高径比为4:1，HZ806大孔树脂与XDA-6大孔树脂装填量比为1:5，用流速为1.5BV/h的70％乙醇进行洗脱，洗脱液用量为6BV，收集到组分25。
对组分21、组分24、组分25采用截留分子量为200的纳滤膜进行样品浓缩后，再进行真空浓缩，最后采用喷雾干燥得到荷叶总黄酮和金丝桃苷精细粉。测定其总黄酮和金丝桃苷含量和得率见表1。
实施例3
取粉碎过的干荷叶碎片5kg，尺度在4mm左右，碎片常温下与0.15mol/L氢氧化钾水溶液预浸润12小时；将浸润过的荷叶从小型超声逆流浸取器投料入口端投入，浸取弱碱水溶液从残渣出口端补入，料液比1:50，超声波动态逆流浸提槽中浸提荷叶有效成分，绞龙转速0.2r.p.m，超声波功率为2.2kW/m3，荷叶碎片在浸提槽中停留时间40min，连续化操作；对残渣进行压榨，然后用与残渣体积为1:1的清水洗涤1次，洗水补入浸提液；
将浸提液调节pH至中性，静置后，用0.2μm的微滤膜去除残留微粒，操作压力为0.20Mpa，然后用截留分子量在8万超滤膜进行超滤，去除水溶性大分子杂质，超滤时为常温，压力为0.10MPa，直至料液剩20％时，加水透析3次，超滤透过液总黄酮浓度为1.50mg/mL，这样制得黄酮超滤处理液。
再将处理好的聚酰胺树脂，湿法装入树脂柱，柱的高径比为5:1，水洗涤平衡后，将超滤处理液缓慢通入树脂柱，荷叶黄酮样液浓度为1.50mg/mL，pH为7.0左右，上柱以流速2.5BV/h上样，检测漏出液黄酮浓度达到料液初始浓度的15％时停止上柱；对吸附饱和的聚酰胺树脂柱采用采用15℃、3.0倍树脂体积的pH值为6的蒸馏水或纯净水快速淋洗，有效去除杂质；
然后用3.0倍树脂体积的12％的乙醇水溶液洗脱树脂吸附的黄酮甙类化合物，得到组分31；接着用3.0倍树脂体积的30％乙醇水溶液洗脱树脂吸附的中等极性的黄酮类黄酮化合物，得到组分32；再用3.0倍树脂体积的50％的乙醇水溶液洗脱，得到组分33,该洗液弃用；最后，用3.0倍树脂体积的65％的乙醇水溶液洗脱树脂中吸附的极性弱的黄酮类化合物，得到组分34。
蒸发掉组分32中乙醇，补充水分使总黄酮浓度在1.6mg/mL，上HZ806大孔树脂再次吸附，其条件为上柱以流速2BV/h上样，检测漏出液黄酮浓度达到初始浓度的15％时停止上柱；用蒸馏水或纯净水15℃下再次洗脱水溶性强的杂质。对吸附饱和的HZ806大孔树脂柱，后接处理好的XDA-6大孔树脂柱，两树脂柱直径相同，高径比为6:1，HZ806大孔树脂与XDA-6大孔树脂装填量比为1:4，用流速为2BV/h的70％乙醇进行洗脱，洗脱液用量为5BV，收集到组分35。
对组分31、组分34、组分35采用截留分子量为100的纳滤膜进行样品浓缩后，再进行真空浓缩，最后采用真空干燥得到荷叶总黄酮和金丝桃苷精细粉。测定其总黄酮和金丝桃苷含量和得率见表1。
实施例4
取粉碎过的干荷叶碎片10kg，尺度在3.5mm左右，碎片常温下与0.11mol/L氢氧化钠水溶液预浸润15小时；将浸润过的荷叶从小型超声逆流浸取器投料入口端投入，浸取弱碱水溶液从残渣出口端补入，料液比1:20，超声波动态逆流浸提槽中浸提荷叶有效成分，绞龙转速0.1r.p.m，超声波功率为2.0kW/m3，荷叶碎片在浸提槽中停留时间50min，连续化操作；对残渣进行压榨，然后用与残渣体积为1:1的清水洗涤2次，洗水补入浸提液；
将浸提液调节pH至中性，静置后，先用0.2μm的微滤膜去除残留微粒，操作压力为0.30Mpa，然后用截留分子量在10万超滤膜进行超滤，去除水溶性大分子杂质，超滤时为常温，压力为0.20MPa，直至料液剩25％时，加水透析4次，超滤透过液总黄酮浓度为1.20mg/mL，这样制得黄酮超滤处理液。
再将处理好的聚酰胺树脂，湿法装入树脂柱，柱的高径比为4:1，水洗涤平衡后，将超滤处理液缓慢通入树脂柱，荷叶黄酮样液浓度为1.20mg/mL，pH为7.0左右，上柱以流速2BV/h上样，检测漏出液黄酮浓度达到料液初始浓度的14％时停止上柱；对吸附饱和的聚酰胺树脂柱采用采用10℃、2.0倍树脂体积的pH值为6的蒸馏水或纯净水快速淋洗，有效去除杂质；
然后用3.0倍树脂体积的10％的乙醇水溶液洗脱树脂吸附的黄酮甙类化合物，得到组分41；接着用3.0倍树脂体积的40％乙醇水溶液洗脱树脂吸附的中等极性的黄酮类黄酮化合物，得到组分42；再用3.0倍树脂体积的48％的乙醇水溶液洗脱，得到组分43,该洗液弃用；最后，用3.0倍树脂体积的63％的乙醇水溶液洗脱树脂中吸附的极性弱的黄酮类化合物，得到组分44。
蒸发掉组分42中乙醇，补充水分使总黄酮浓度在2.0mg/mL，上HZ806大孔树脂再次吸附，其条件为上柱以流速1.5BV/h上样，检测漏出液黄酮浓度达到初始浓度的20％时停止上柱；用蒸馏水或纯净水10℃下再次洗脱水溶性强的杂质。对吸附饱和的HZ806大孔树脂柱，后接处理好的XDA-6大孔树脂柱，两树脂柱直径相同，高径比为5:1，HZ806大孔树脂与XDA-6大孔树脂装填量比为1:4，用流速为3BV/h的70％乙醇进行洗脱，洗脱液用量为5BV，收集到组分45。
对组分41、组分44、组分45采用截留分子量为200的纳滤膜进行样品浓缩后，然后进行真空浓缩，最后采用喷雾干燥得到荷叶总黄酮和金丝桃苷精细粉。测定其总黄酮和金丝桃苷含量和得率见表1。
表1实施例中纯化样品金丝桃苷和总黄酮得率及含量统计
本发明以弱氢氧化钠水溶液为溶剂，常温碎片下，采用超声辅助逆流浸提，强化传质，使得荷叶总黄酮、金丝桃苷净出率与常用的热醇水浸提效果相当，然后采用膜过滤去杂，多级吸附柱进行分离、分步洗脱，在多级吸附柱中一部分树脂起到纯化和浓缩的作用，另一部分起到去除杂质的作用，洗脱液经过膜技术浓缩及真空浓缩，干燥得到蓬松、均匀的棕黄色荷叶金丝桃苷粉体，金丝桃苷的含量大于90％，同时回收荷叶总黄酮，纯度大于55％。

Claims (8)

1.一种从荷叶中分离高纯度金丝桃苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)、粉碎：将洁净鲜荷叶干燥、粉碎，制得荷叶碎片；
2)、浸提：
2.1)、荷叶碎片常温下浸没在0.07～0.15moL/L碱性水溶液中预浸润12～24小时后得到浸润料和浸润液；
2.2)、将浸润料从超声逆流浸取器投料入口端投入，浸润液从残渣出口端补入，料液比为1:20～50，超声波动态逆流浸提槽中连续浸提荷叶有效成分30～50min，得到浸提液和残渣；
2.3)、对残渣进行压榨，然后用与残渣体积1:1的清水洗涤1～2次，洗水补入浸提液中得到料液；
3)、除杂：
3.1)、将料液pH调至中性，静置后，先用0.1～0.2μm的微滤膜去除残留微粒；
3.2)、再用截留分子量在2～10万的超滤膜在常温下进行超滤，至料液剩15～25％时，加水透析2～4次，加水量的限度为使超滤透过液中总黄酮浓度为0.8～1.5mg/mL，制得超滤液；
4)、上柱：
4.1)、大孔树脂聚酰胺树脂湿法装入树脂柱，水洗涤平衡后，将超滤液通入树脂柱，待检测漏出液的黄酮浓度达到初始浓度的12～18％时停止上柱，得吸附饱和的聚酰胺树脂柱；
4.2)、对吸附饱和的聚酰胺树脂柱采用2.0～4.0倍树脂体积的pH值为4～6、温度为10～15℃的水进行快速洗涤，去除杂质；
5)、梯度洗脱：
5.1)、用2.0～4.0倍树脂体积的8～12％体积溶度的乙醇水溶液洗脱步骤4)中聚酰胺树脂柱吸附的黄酮甙类化合物，得组分1；
5.2)、接着用2.0～4.0倍树脂体积的20～40％体积溶度的乙醇水溶液洗脱树脂吸附的中等极性的黄酮类黄酮化合物，得组分2；
5.3)、再用2.0～4.0倍树脂体积的45～50％体积溶度的乙醇水溶液洗脱，得组分3，该洗脱液弃用；
5.4)最后用2.0～4.0倍树脂体积的62～65％体积溶度的乙醇水溶液洗脱树脂中吸附的极性弱的黄酮类化合物，得组分4；
6)、再次上柱：
6.1)、蒸发掉组分2中的乙醇，补充水分使总黄酮浓度在1.0～2.0mg/mL，上HZ806树脂柱再次吸附，上柱流速为1.5～3BV/h，待检测漏出液的黄酮浓度达到初始浓度的10～20％时停止上柱；用蒸馏水或纯净水10～15℃下对HZ806树脂进行洗脱，除去水溶性杂质，得吸附饱和的HZ806树脂柱；
6.2)、对吸附饱和的HZ806树脂柱，后接处理好的直径与之相同的XDA-6大孔树脂柱，用流速为1.5～3BV/h的70％乙醇进行洗脱，乙醇用量为4～6BV，收集洗脱液得组分5；
7)、浓缩、干燥：
对组分1、组分4和组分5分别依次采用纳滤膜浓缩和真空浓缩后，进一步进行真空干燥或喷雾干燥制得荷叶总黄酮和金丝桃苷精细粉。
2.根据权利要求1所述的一种从荷叶中分离高纯度金丝桃苷的方法，其特征在于，所述步骤1)中的荷叶碎片的尺度为2～4mm。
3.根据权利要求1所述的一种从荷叶中分离高纯度金丝桃苷的方法，其特征在于，所述步骤2.2)中超声逆流浸取器的工作状态为：绞龙转速为0.1～0.5r.p.m，超声波功率为2.0～3.0kW/m3。
4.根据权利要求1所述的一种从荷叶中分离高纯度金丝桃苷的方法，其特征在于，所述步骤3.1)中微滤的操作压力0.10～0.30Mpa；所述步骤3.2)中超滤的操作压力为0.10～0.20Mpa。
5.根据权利要求1所述的一种从荷叶中分离高纯度金丝桃苷的方法，其特征在于，所述步骤4.1)中聚酰胺树脂柱的高径比为4～8:1，超滤液的上柱流速为1.5～4BV/h。
6.根据权利要求1所述的一种从荷叶中分离高纯度金丝桃苷的方法，其特征在于，所述步骤6.2)中HZ806树脂柱和XDA-6大孔树脂柱的高径比为4～8:1，二者装填量比为1:3～5。
7.根据权利要求1所述的一种从荷叶中分离高纯度金丝桃苷的方法，其特征在于，所述步骤7)中的纳滤膜的截留分子量为100～200。
8.根据权利要求1所述的一种从荷叶中分离高纯度金丝桃苷的方法，其特征在于，将使用过的聚酰胺树脂柱、HZ806树脂柱和XDA-6大孔树脂柱分别依次用2.0～4.0倍树脂体积，浓度为2％的碱、清水、浓度为2％的酸洗涤，使漏过液呈中性，再用95％的乙醇和清水洗涤，使树脂恢复吸附性能。
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