CN106543248A - 高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法，所述方法包括以下步骤：(1)莲子心溶液的制备(2)莲子心总黄酮的富集(3)高速逆流色谱分离纯化，得到槲皮素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、异鼠李素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、芹菜素‑6‑C‑β‑D‑木糖基‑8‑C‑β‑D‑葡萄糖苷和芹菜素‑6‑C‑β‑D‑葡萄糖基‑8‑C‑β‑D‑葡萄糖苷。本发明分离纯化黄酮苷类化合物单体纯度高、损失少、操作简单、制备量大、经济环保。

Description

高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法
技术领域
本发明涉及天然药物化学领域，尤其涉及高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法。
背景技术
莲子心为睡莲科水生草本植物莲(NelumbonuciferaGaertn)成熟种子中的胚根及幼叶，为历版《中国药典》所收载的品种，既可入药，也可食用。具有降血压、降血糖、抗心律失常、抗氧化、抗心肌缺血、松弛平滑肌、强心、抗癌、脑缺血损伤保护、改善急性肺损伤及肺纤维化、中枢抑制、降血糖等药理作用。现代研究表明：莲子心主要含有生物碱、黄酮和多糖等活性成分，大量研究表明，黄酮类化合物除具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、清热解毒等作用外，对冠心病、心绞痛等疾病也有较好的治疗效果。黄酮类化合物安全、无毒，已在医药、食品加工等方面得到广泛应用。
对莲子心化学成分的研究多集中在其生物碱上，国内外学者进一步将莲子所含生物碱分为非酚性生物碱和酚性生物碱，主要有莲心碱(liensinine),异莲心碱(isoliensinine)，甲基莲心碱(neferine)，荷叶碱(nuciferine)，牛角花碱(lorusine)，甲基紫堇杷灵(methylcorypalline)，莲子碱(nelumbine)等[莲类药材的化学成分和药理作用研究进展，上海中医药杂志，2010年第12期]。现有报道中，关于莲子心中提取得到的黄酮类化合物都是总黄酮，仅有少量从莲子心中提取单个或者两个黄酮类化合物(仅有吕纱平等[莲子心中二种黄酮类化合物的分离与鉴定，广东化工，2015年第15期]从莲子心95％乙醇提取物中分离得到金丝桃苷和山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷；单世斌[莲子心中黄酮类物质的提取和鉴定，海峡药学，2012年第9期]从莲子心中分离得到木犀草-8-C-β-D-葡萄糖甙和木犀草素-6-C-β-D-葡萄糖甙。)；现有技术中一般采用传统柱层析分离，重结晶等方法从莲子心样品中提取分离单体化合物，这些方法需要经过反复的柱层析分离，操作复杂，耗时长，溶剂消耗量大，而且样品损失大，效果差。高速逆流色谱是最近年来新兴的一种快速分离色谱分离技术，无需固定相为载体是其最大优势，并具有分离量大，回收率高，快速，高效等特点，已经被广泛应用于植物化学、中药化学以及天然产物化学物质的制备分离和纯化。
发明内容
本发明的目的是提供一种高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法，可以从莲子心中分离纯化多个黄酮苷类化合物单体。
为了解决上述技术问题，本发明提供的分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法是这样实现的：
一种高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)莲子心溶液的制备
将莲子心阴干、粉碎，以浓度为50％～90％的乙醇为溶剂进行超声提取1～3次，超声提取的固液比为1：10～1:30，提取时间为1～4h，之后过滤，合并滤液进行真空减压浓缩除去溶剂，得莲子心乙醇提取液；
(2)莲子心总黄酮的富集
所述莲子心乙醇提液经大孔树脂、聚酰胺、硅胶、反向硅胶或凝胶吸附，用水和乙醇的混合溶剂梯度洗脱，收集含有黄酮成分的洗脱液，合并减压回收溶剂，冷冻干燥得莲子心粗黄酮；
(3)高速逆流色谱分离纯化
采用体积比为1:1:1～1:5:10的乙酸乙酯-正丁醇-水溶液为溶剂体系，按将固定相以10～20mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待所述固定相充满整个柱子后，以1～3mL/min的流速注入流动相，调节逆流色谱仪转速至700～900rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将所述莲子心粗黄酮溶于所述两相溶剂体系，进样浓度为10mg/mL～50mg/mL，进样体积为20mL～50mL，进行高速逆流色谱分离；在所述高速逆流色谱分离时，以波长200～350nm的紫外检测器检测，以单个波峰为单位，从出峰开始收集至峰消失停止收集，分别收集不同馏分减压浓缩冷冻干燥，得到槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-木糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷和芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷。
可选的，所述步骤(3)中，所述乙酸乙酯-正丁醇-水的体积比为：1:2～4:3～8。
可选的，所述步骤(3)中，所述乙酸乙酯-正丁醇-水的体积比为：1:2:3。
可选的，所述步骤(3)中，所述进行高速逆流色谱分离时，分离柱转速为900rpm，流动相流速为2ml/min，紫外检测器波长为254nm，进样浓度为20mg/mL，进样体积为20mL。
可选的，所述步骤(1)中，所述超声提取的乙醇水溶液浓度为80％。
可选的，所述超声提取的固液比为：1:20，提取次数为2次。
可选的，所述步骤(2)中，所述大孔树脂为D-101大孔树脂、AB-8大孔树脂或DM-301大孔树脂。
可选的，所述梯度洗脱程序为：
先用10倍柱体积的水洗脱，再用5倍柱体积的10％，30％，50％，70％，90％的乙醇分别洗脱。
可选的，所述收集含有黄酮成分的洗脱液，为30％乙醇部分。
可选的，所述收集含有黄酮成分的洗脱液中含有黄酮成分的测定方法是NaNO2-AlCl3-NaOH比色法测定。
本发明提供的分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法，能分离纯化槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-木糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷和芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷四种黄酮苷类单体，相对于现有技术，本发明可以一次性从莲子心中分离纯化四种黄酮苷类化合物单体，分离纯化黄酮苷类化合物单体效率高、操作简单、综合成本低、分离量大、产品纯度高、样品损失小；本发明分离纯化得到黄酮苷类单体经高效液相色谱法(HPLC，High Performance LiquidChromatography)纯度达到80％以上，各馏分经制备液相色谱提纯可得到90％以上的纯品槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-木糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷和芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷。
附图说明
图1是采用体积比1:2:3.的乙酸乙酯-正丁醇-水为溶剂体系的高速逆流色谱分离纯化莲子心的色谱图；
图2是分离纯化得到的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱图；
图3是分离纯化得到的异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱图；
图4是分离纯化得到的芹菜素-6-C-β-D-木糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱图；
图5是分离纯化得到的芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如下详细介绍本发明提供的分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法：
实施例1
步骤一：莲子心乙醇提取液的制备
取自然阴干的莲子心1.0kg，粉碎，以浓度为80％乙醇为溶剂进行超声提取，固液比为1:20，提取时间2h，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并真空减压浓缩至无乙醇味，得莲子心乙醇提取液。
步骤二：莲子心粗黄酮制备
过滤莲子心乙醇提取液，选用大孔树脂、聚酰胺、硅胶、反向硅胶或凝胶作为吸附材料吸附过滤后的莲子心乙醇提取液，然后先用水再用浓度为10％～90％乙醇进行梯度洗脱；具体是：先用10倍柱体积的水洗脱，再用5倍柱体积的10％，30％，50％，70％，90％的乙醇分别洗脱。收集30％乙醇部分含有黄酮成分的洗脱液，减压浓缩得莲子心粗黄酮，4℃冰箱保存备用；其中测定含有黄酮成分的洗脱液中含有黄酮的测定方法是：NaNO2-AlCl3-NaOH比色法测定。本发明可选实施例，大孔树脂使用D-101大孔树脂。
步骤三：黄酮苷类单体分离
采用体积比1:1:1～1:5:10的乙酸乙酯-正丁醇-水为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以10～20mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以1～3mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节逆流色谱仪转速至700～900rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将莲子心粗黄酮溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为10mg/mL～50mg/mL，进样体积为20mL～50mL，对莲子心粗黄酮进行高速逆流色谱(High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC)分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为200～350nm nm，根据色谱峰分别收集相应的峰组分，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物，如图1所示；本发明可选实施例，乙酸乙酯-正丁醇-水的体积比为：1:2:3，流动相流速为2mL/min，分离柱转速为900rpm，进样浓度为20mg/mL，进样体积为20mL，检测波长为254nm。
槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅰ)、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅱ)、芹菜素-6-C-β-D-木糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷(Ⅲ)和芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷(Ⅳ)。
步骤四：黄酮苷类单体纯度测定及结构测定
收集到的各馏分别经1H-NMR(核磁共振，Nuclear Magnetic Resonance)和13C-NMR鉴定，所得单体化合物分别为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷13mg、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷13mg、芹菜素-6-C-β-D-木糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷18mg和芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷48mg；收集到各分馏物分别经HPLC检测，以色谱峰面积归一化法计算，测量各杂质峰的面积和总色谱峰面积，计算各杂质峰面积及其之和占总峰面积的百分率，样品纯度即为去掉杂质峰之和所占的百分率。如图2所示，色谱峰面积归一化法计算可知杂质峰的峰面积为13％，总色谱峰面积为1，计算可得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷纯度为87％，同理可知异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷纯度为84％，芹菜素-6-C-β-D-木糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷纯度为88％，芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷纯度为89％；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷，异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷，芹菜素-6-C-β-D-木糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷和芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱图分别如图2～图5所示。
实施例2
步骤一：莲子心乙醇提取液的制备
取自然阴干的莲子心1.0kg，粉碎，以浓度为70％乙醇为溶剂进行超声提取，固液比为1:30，提取时间1h，过滤，滤渣重复处理1次；合并滤液并真空减压浓缩至无乙醇味，得莲子心粗乙醇提取液。
步骤二：莲子心粗黄酮制备
过滤莲子心乙醇提取液，选用大孔树脂、聚酰胺、硅胶、反向硅胶或凝胶作为吸附材料吸附过滤后的莲子心粗提取液，然后先用水再用浓度为10％～90％乙醇进行梯度洗脱；具体是：先用10倍柱体积的水洗脱，再用5倍柱体积的10％，30％，50％，70％，90％的乙醇分别洗脱。收集30％乙醇部分含有黄酮成分的洗脱液，减压浓缩得莲子心粗黄酮，4℃冰箱保存备用；其中测定含有黄酮成分的洗脱液中含有黄酮的测定方法是：NaNO2-AlCl3-NaOH比色法测定。本发明可选实施例，大孔树脂使用AB-8大孔树脂。
步骤三：黄酮苷类单体分离
采用体积比1:3:5的乙酸乙酯-正丁醇-水为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以10mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以1mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节逆流色谱仪转速至700rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将莲子心粗黄酮溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为30mg/mL，进样体积为30mL，对莲子心粗黄酮进行HSCCC分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为285nm，根据色谱峰分别收集相应的峰组分，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。
步骤四：黄酮苷类单体纯度测定及结构测定
应用高效液相色谱检测单体化合物的纯度同实施1中步骤四。
实施例3
步骤一：莲子心乙醇提取液的制备
取自然阴干的莲子心1.0kg，粉碎，以浓度为90％乙醇为溶剂进行超声提取，固液比为1:10，提取时间3h，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并真空减压浓缩至无乙醇味，得莲子心乙醇提取液。
步骤二：莲子心粗黄酮制备
过滤莲子心乙醇提取液，选用大孔树脂、聚酰胺、硅胶、反向硅胶或凝胶作为吸附材料吸附过滤后的莲子心乙醇提取液，然后先用水再用浓度为10％～90％乙醇进行梯度洗脱；具体是：先用10倍柱体积的水洗脱，再用5倍柱体积的10％，30％，50％，70％，90％的乙醇分别洗脱。收集30％乙醇部分含有黄酮成分的洗脱液，减压浓缩得莲子心粗黄酮，4℃冰箱保存备用；其中测定含有黄酮成分的洗脱液中含有黄酮的测定方法是：NaNO2-AlCl3-NaOH比色法测定。本发明可选实施例，大孔树脂使用DM-301大孔树脂。
步骤三：黄酮苷类单体分离
采用体积比1:4:8的乙酸乙酯-正丁醇-水为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以20mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以3mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节逆流色谱仪转速至900rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将莲子心粗黄酮溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为10mg/mL，进样体积为50mL，对莲子心粗黄酮进行HSCCC分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为210nm，根据色谱峰分别收集相应的峰组分，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。步骤四：黄酮苷类单体纯度测定及结构测定
应用高效液相色谱检测单体化合物的纯度同实施1中步骤四
实施例4
步骤一：莲子心乙醇提取液的制备
取自然阴干的莲子心1.0kg，粉碎，以浓度为50％乙醇为溶剂进行超声提取，固液比为1:20，提取时间3h，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并真空减压浓缩至无乙醇味，得莲子心乙醇提取液。
步骤二：莲子心粗黄酮制备
过滤莲子心乙醇提取液，选用大孔树脂、聚酰胺、硅胶、反向硅胶或凝胶作为吸附材料吸附过滤后的莲子心乙醇提取液，然后先用水再用浓度为10％-90％乙醇进行梯度洗脱；具体是：先用10倍柱体积的水洗脱，再用5倍柱体积的10％，30％，50％，70％，90％的乙醇分别洗脱。收集30％乙醇部分含有黄酮成分的洗脱液，减压浓缩得莲子心粗黄酮，4℃冰箱保存备用；其中测定含有黄酮成分的洗脱液中含有黄酮的测定方法是：NaNO2-AlCl3-NaOH比色法测定。本发明可选实施例，大孔树脂使用DM-301大孔树脂。
步骤三：黄酮苷类单体分离
采用体积比1:1:1的乙酸乙酯-正丁醇-水为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以10mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以2mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节逆流色谱仪转速至800rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将莲子心粗黄酮溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为50mg/mL，进样体积为40mL，对莲子心粗黄酮进行HSCCC分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为200nm，根据色谱峰分别收集相应的峰组分，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。
步骤四：黄酮苷类单体纯度测定及结构测定
应用高效液相色谱检测单体化合物的纯度同实施1中步骤四。
实施例5
步骤一：莲子心乙醇提取液的制备
取自然阴干的莲子心1.0kg，粉碎，以浓度为60％乙醇为溶剂进行超声提取，固液比为1:25，提取时间3h，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并真空减压浓缩至无乙醇味，得莲子心粗乙醇提取液。
步骤二：莲子心粗黄酮制备
过滤莲子心乙醇提取液，选用大孔树脂、聚酰胺、硅胶、反向硅胶或凝胶作为吸附材料吸附过滤后的莲子心粗提取液，然后先用水再用浓度为10％-90％乙醇进行梯度洗脱；具体是：先用10倍柱体积的水洗脱，再用5倍柱体积的10％，30％，50％，70％，90％的乙醇分别洗脱。收集30％乙醇部分含有黄酮成分的洗脱液，减压浓缩得莲子心粗黄酮，4℃冰箱保存备用；其中测定含有黄酮成分的洗脱液中含有黄酮的测定方法是：NaNO2-AlCl3-NaOH比色法测定。本发明可选实施例，大孔树脂使用AB-8大孔树脂。
步骤三：黄酮苷类单体分离
采用体积比1:5:10的乙酸乙酯-正丁醇-水为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以20mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以3mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节逆流色谱仪转速至750rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将莲子心粗黄酮溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为40mg/mL，进样体积为35mL，对莲子心粗黄酮进行HSCCC分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为350nm，根据色谱峰分别收集相应的峰组分，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。
步骤四：黄酮苷类单体纯度测定及结构测定
应用高效液相色谱检测单体化合物的纯度同实施1中步骤四。
需要说明的是，实施例一～实施例五中所述乙醇的浓度均为乙醇与水的体积比。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)莲子心溶液的制备
将莲子心阴干、粉碎，以浓度为50％～90％的乙醇为溶剂进行超声提取1～3次，超声提取的固液比为1：10～1:30，提取时间为1～4h，之后过滤，合并滤液进行真空减压浓缩除去溶剂，得莲子心乙醇提取液；
(2)莲子心总黄酮的富集
所述莲子心乙醇提液经大孔树脂、聚酰胺、硅胶、反向硅胶或凝胶吸附，用水和乙醇的混合溶剂梯度洗脱，收集含有黄酮成分的洗脱液，合并减压回收溶剂，冷冻干燥得莲子心粗黄酮；
(3)高速逆流色谱分离纯化
采用体积比为1:1:1～1:5:10的乙酸乙酯-正丁醇-水溶液为溶剂体系，按将固定相以10～20mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待所述固定相充满整个柱子后，以1～3mL/min的流速注入流动相，调节逆流色谱仪转速至700～900rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将所述莲子心粗黄酮溶于所述两相溶剂体系，进样浓度为10mg/mL～50mg/mL，进样体积为20mL～50mL，进行高速逆流色谱分离；在所述高速逆流色谱分离时，以波长200～350nm的紫外检测器检测，分别收集不同馏分减压浓缩冷冻干燥，得到槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-木糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷和芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖基-8-C-β-D-葡萄糖苷。
2.根据权利要求1所述的高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述乙酸乙酯-正丁醇-水的体积比为：1:2～4:3～8。
3.根据权利要求2所述的高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述乙酸乙酯-正丁醇-水的体积比为：1:2:3。
4.根据权利要求1至3任一项所述的高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述进行高速逆流色谱分离时，分离柱转速为900rpm，流动相流速为2ml/min，紫外检测器波长为254nm，进样浓度为20mg/mL，进样体积为20mL。
5.根据权利要求1所述的高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述超声提取的乙醇水溶液浓度为80％。
6.根据权利要求1或5所述的高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，所述超声提取的固液比为：1:20，提取次数为2次。
7.根据权利要求1所述的高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述大孔树脂为D-101大孔树脂、AB-8大孔树脂或DM-301大孔树脂。
8.根据权利要求1或7所述的高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：
先用10倍柱体积的水洗脱，再用5倍柱体积的10％，30％，50％，70％，90％的乙醇分别洗脱。
9.根据权利要求1所述的高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述收集含有黄酮成分的洗脱液，为30％乙醇部分。
10.权利要求9所述的高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，所述收集含有黄酮成分的洗脱液中含有黄酮成分的测定方法是NaNO2-AlCl3-NaOH比色法测定。
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