CN107698637A

CN107698637A - 一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法

Info

Publication number: CN107698637A
Application number: CN201711027123.4A
Authority: CN
Inventors: 张良波; 陆英; 李昌珠; 李培旺; 彭晓英; 陈景震; 皮兵; 刘强
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-10-27
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2018-02-16
Anticipated expiration: 2037-10-27
Also published as: CN107698637B

Abstract

一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法，具体包括制备提取液、浓缩、初步纯化、分离白檀果花色苷、分离白檀果黄酮等步骤，分离得到四种化合物。经过结构鉴定认为其中包括一种花色苷类化合物，具体为飞燕草素‑3‑O‑接骨木二糖苷；还包括三种黄酮类化合物，具体为芦丁、槲皮素‑3‑O‑葡萄糖苷和槲皮素‑3‑O‑鼠李糖苷。本方法分离得到的产品纯度高，且黄酮类化合物具有较强的生物活性，因此研究结果为黄酮标准品制备及白檀果进一步开发利用奠定基础。

Description

一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法

技术领域

本发明涉及化合物的分离提纯技术领域，具体为一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法。

背景技术

白檀(Symplocos Paniculata(Thunb)Miq.)是山矾科山矾属小乔木或落叶灌木,又称乌子、碎籽树，广泛分布于世界各地，由于其生长力旺盛、抗逆性强、根系发达，是低山丘陵地区防止水土流失、改善生态环境的理想植物；同时其果实、根、花等具有较高的经济价值以及药用价值。其中白檀果实成熟后转变为蓝色或蓝紫色，可食用，可入药。果实中的籽含油率达36.6％，且其中含有人体必备的两种不饱和脂肪酸，即油酸和亚油酸，含量高达85％，而硬脂酸含量又低，是较为理想、有益健康的食用植物油。

目前对白檀果的研究利用主要集中在油脂方面，包括白檀果含油量的测定及其影响因素等。而关于白檀果中含有的其他化学成分的研究和利用则相对较少。文献(“白檀果肉红色素含量测定及其基本理化性质的初步研究”，陈郑镔、刘剑秋、陈炳华等，闽南师范大学学报(自然版),2007,20(1):108-112.)曾公开了白檀果中含有红色素，并对红色素的理化性质进行了探索研究；另有文献 (“白檀叶总黄酮和果肉红色素的初步研究”陈郑镔，福建师范大学,2005.)中曾公开了在白檀叶中发现了黄酮类似物。

虽然，现有技术中已经发现了白檀果肉红色素和白檀叶总黄酮，而其中红色素属于花色苷类化合物，但是却没有从白檀果中提纯并鉴定花色苷类化合物和黄酮类化合物，没有对化合物的具体结构进行探究。而且现有技术中没有公开利用高速逆流色谱(HSCCC)从白檀果中分别分离出高纯度的飞燕草素-3-O- 接骨二木糖苷、芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷。因此，需要提供一种白檀果中黄酮类似物和花色苷类化合物的分离提纯方法，为白檀果进一步的开发利用奠定基础。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明公开了一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法，可以从白檀果中同时分离出一种花色苷类化合物和三种黄酮类化合物。

一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备提取液：由白檀鲜果制备白檀果粗提取液；

(2)浓缩：对步骤(1)制得的白檀果粗提取液进行浓缩处理，制得浓缩提取液；

(3)初步纯化：利用大孔吸附树脂柱对由步骤(2)得到的浓缩提取液进行洗脱处理，通过控制洗脱液的组成和加入顺序，将浓缩提取液分离成花色苷粗提取物和黄酮粗提取物；

(4)分离白檀果花色苷：利用高速逆流色谱对由步骤(3)得到的花色苷粗提取物进行分离提纯，得到一种花色苷类化合物，具体为飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷；

(5)分离白檀果黄酮：利用高速逆流色谱对由步骤(3)得到的花色苷粗提取物进行分离提纯，得到三种黄酮类化合物，分别为芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷。

优选的，所述步骤(1)制备提取液具体包括如下步骤：

①称取1.0-2.0Kg白檀鲜果，捣碎备用，量取5-10L质量浓度为40％-70％的乙醇或甲醇水溶液作为提取剂，备用；

②将捣碎的白檀鲜果加入到提取剂中，超声避光浸提20-40min，适时搅拌，过滤；

③取上述过滤所得滤渣，重复进行上述步骤①和②的浸提过程1-2次；

④合并上述滤液，即可得到白檀果粗提取液。

优选的，所述步骤①中称取白檀果鲜果1.5Kg，量取7L质量浓度为60％乙醇水溶液；所述步骤③中重复浸提2次。

优选的，所述步骤(2)浓缩具体包括：

(a)设置浓缩温度在45-55℃之间；

(b)对由步骤(1)得到的白檀果粗提取液进行减压浓缩，至浓缩提取液体积为粗提取液体积的1/5-1/15，得到浓缩提取液。

优选的，所述浓缩温度55℃，所述浓缩提取液的体积为粗提取液体积的1/7。

优选的，所述步骤(3)初步纯化具体步骤如下：

(A)将由步骤(2)得到的浓缩提取液以1-4BV/h的流速加入到大孔吸附树脂柱中；

(B)浓缩提取液完全加入后，静置20-40min；

(C)然后依次使用3BV水、4-6BV质量浓度为10-15％乙醇和4-6BV质量浓度为60-70％的乙醇以3BV/h的流速对上述浓缩提取液进行洗脱，分别收集 10-15％乙醇洗脱液和60-70％乙醇洗脱液；

(D)分别对上述洗脱液进行减压浓缩、冷冻干燥处理，由10-15％乙醇洗脱液得到白檀果花色苷粗提取物，由60-70％乙醇洗脱液得到白檀果黄酮粗提取物。

优选的，所述大孔吸附树脂柱包括NKA-9树脂柱或D101树脂柱。

优选的，所述静置时间为30min，所述大孔吸附树脂柱包括D101树脂柱。

优选的，所述步骤(A)中使用的流速为3BV/h；所述步骤(C)为依次使用3BV水、4BV质量浓度15％乙醇和4BV质量浓度70％乙醇以3BV/h的流速对上述浓缩提取液进行洗脱，分别收集15％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液。

优选的，所述步骤(4)分离白檀果花色苷具体步骤如下：

a、分别量取4体积份正丁醇、0.3体积份甲基叔丁基醚、1体积份乙腈和5 体积份三氟乙酸水溶液混匀，配制成溶剂体系,所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的体积分数为0.1％，所述溶剂体系会形成上下两层，上层为上相，下层为下相；

b、设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为800-900rpm/min，恒温器温度为20℃，检测器的检测波长为280nmnm，下相的流速为1.5mL/min；

c、称取花色苷粗提取物120mg溶解于20mL下相中，进样，然后根据色谱流出图在142-144min流出液，即得到飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷流出液；

d、取上述飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷流出液加入大量蒸馏水，混合均匀，在50℃条件下旋转蒸发，至溶液由红色恢复至蓝色，得到飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷水溶液；

e、对上述飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷水溶液进行浓缩，冷却，干燥，即可得到飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷。

优选的，所述步骤b中主机转速为850rpm/min。

优选的，所述步骤(5)分离白檀果黄酮具体步骤如下：

A、分别量取4体积份乙酸乙酯、1体积份乙醇和5体积份冰乙酸水溶液，配置成溶剂体系，所述冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积分数为0.5％；

C、称取黄酮粗提取物200-250mg溶解于20mL下相中，进样，然后根据色谱流出图分别在160-186min和284-294min收集流出液，分别得到芦丁流出液和槲皮素-3-O-葡萄糖苷流出液；

D、待收集完槲皮素-3-O-葡萄糖苷流出液，下相的流速改变为2.0mL/min，根据色谱图在423-473min收集流出液，即得到槲皮素-3-O-鼠李糖苷流出液；

E、对芦丁流出液进行浓缩处理，然后按照A-C所述体系和方法进行第二次分离，按照色谱流出图在169-183min收集流出液，即为高纯度的芦丁流出液；

F、分别取上述高纯度芦丁流出液、槲皮素-3-O-葡萄糖苷流出液和槲皮素 -3-O-鼠李糖苷流出液，在55℃条件下旋转蒸发，即得到芦丁溶液、槲皮素-3-O- 葡萄糖苷溶液和槲皮素-3-O-鼠李糖苷溶液；

G、分别对上述溶液进行浓缩，冷却，干燥，即可得到芦丁、槲皮素-3-O- 葡萄糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷。

优选的，所述步骤B中主机转速为850rpm/min；所述步骤C中上样量为 200mg。

优选的，一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法，还包括对由分离得到的花色苷类化合物和黄酮类化合物的结构鉴定。

优选的，所述结构鉴定包括核磁共振谱检测、质谱检测和高效液相色谱 (HPLC)检测。

有益效果：本申请提供一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法，具体包括制备提取液、浓缩、初步纯化、分离白檀果花色苷、分离白檀果黄酮等步骤，分离得到四种化合物，分别为飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷、芦丁、槲皮素-3-O- 葡萄糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷，分离产物的纯度高，整体步骤操作简单，在通过高速逆流色谱分离之前先进行初步纯化，可以降低高速逆流色谱的分离压力，加快分离效率，节省分离成本。

在制备提取液过程中，选用乙醇或甲醇水溶液作为提取剂，设置合理提取液配比，使得提取剂的提取效果好且成本低；通过浓缩过程，可以除去多余的提取剂，提高目标产物的浓度，为后续步骤降低难度；在初步提纯过程，通过大孔吸附树脂对白檀果粗提取物进行初步提纯，可以从其中分离得到花色苷粗提取物和黄酮粗提取物，为后续高速逆流色谱分离降低难度，节省时间和成本；在分离白檀果花色苷过程中，通过设置合理的溶剂体系、上样量和下相流速，使得分离效果和分离效率同时达到相对较佳的状态；在分离白檀果黄酮过程中，待收集槲皮素-3-O-葡萄糖苷完成后调高下相流速，可以节省时间提高分离效率，对于芦丁流出液进行第二次高速逆流色谱分离，是为了提高芦丁的纯度，有利于提高化合物结构分析的准确度。并且还对分离得到的化合物的结构进行了分析鉴定，通过高效液相色谱检测，可以确定化合物所属种类和化合物的纯度；通过质谱检测可以确定化合物的相对分子质量；通过核磁共振波谱检测，可以确定化合物中含有不同环境的氢元素及其相对含量；多种检测结果相互结合，即可推断出化合物的结构式。

附图说明

图1白檀果原料HPLC色谱图；

图2大孔吸附树脂15％乙醇洗脱物HPLC图谱；

图3大孔吸附树脂70％乙醇洗脱物HPLC图谱；

图4HSCCC分离飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷图；

图5HSCCC分离芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷图；

图6芦丁的HSCCC第二次分离图；

图7飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷HPLC检测图；

图8飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷的紫外光谱(UV)图；

图9芦丁的HPLC检测图；

图10芦丁的紫外光谱(UV)图；

图11槲皮素-3-O-葡萄糖苷的HPLC检测图；

图12槲皮素-3-O-葡萄糖苷的紫外光谱(UV)图；

图13槲皮素-3-O-鼠李糖苷的HPLC检测图；

图14槲皮素-3-O-鼠李糖苷的紫外光谱(UV)图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

确定高速逆流色谱分离花色苷的溶剂体系，配制多个不同配比的溶剂系体系，并对其进行表征分析，计算体系K值，结果如表1所示。由表1可知，体系5的K值较为合理，可以用作高速逆流色谱分离的溶剂体系。上样量为60mg 时，样品分离效果好，但分离效率低；上样量为200mg时，高速逆流色谱出现过载现象，分离效果差；上样量为120mg时，样品分离效果好，且分离效率相对较高。

表1

确定高速逆流色谱分离黄酮类化合物的溶剂体系，分析并计算在多个不同配比的溶剂系体系中各成分的K值，并计算分离度，结果如表2所示。三个目标组分的K值差异较大，组分1偏小，组分3偏大。综合考虑K值和分离度，最终选择体系4进行上机分离。

表2

实施例2

(1)制备提取液

①称取1.0Kg白檀鲜果，捣碎备用，量取5L质量浓度为40％的乙醇作为提取剂，备用；

②将捣碎的白檀鲜果加入到提取剂中，超声避光浸提20min，适时搅拌，过滤；有利于白檀果中的有效成分进入提取液中，且采用避光浸提可以避免光照对有效成分产生影响；

③取上述过滤所得滤渣，重复进行上述步骤①和②的浸提过程1次，使滤渣中的有效成分能进入到提取液中；

④合并上述滤液，即可得到白檀果粗提取液。

(2)浓缩

(a)设置浓缩温度为45℃；

(b)对由步骤(1)得到的白檀果粗提取液进行减压浓缩，至浓缩提取液体积为粗提取液体积的1/15，得到浓缩提取液；浓缩提取液的浓度高，有效成分含量高，有利于提高后续分离的效率。

(3)初步纯化

(A)将由步骤(2)得到的浓缩提取液以1BV/h的流速加入到NKA-9树脂柱中，以较小的流速加入到大孔吸附树脂柱中，有利于浓缩提取液在大孔吸附树脂柱中快速达到平衡；

(B)浓缩提取液完全加入后，静置20min，与步骤(A)中的流速相互配合，使浓缩提取液完全进入大孔吸附树脂柱且达到平衡；

(C)然后依次使用3BV水、4BV质量浓度为10％乙醇和4BV质量浓度为 60％乙醇以3BV/h的流速对上述浓缩提取液进行洗脱，分别收集质量浓度为10％乙醇洗脱液和质量浓度为60％乙醇洗脱液；先使用3BV水进行洗脱可以除去一些易溶于水的杂质，再依次使用6BV10％乙醇、6BV60％乙醇进行洗脱是为了使花色苷类化合物与黄酮类化合物分离开；

(D)分别对上述洗脱液进行减压浓缩、冷冻干燥处理，由10％乙醇洗脱液得到白檀果花色苷粗提取物，由60％乙醇洗脱液得到白檀果黄酮粗提取物；由于不同浓度乙醇洗脱液对白檀果提取物的花色苷及黄酮分离效果不同，花色苷类化合物主要集中在10％乙醇洗脱液，黄酮类化合物主要集中在60％乙醇洗脱液中。

(4)分离白檀果花色苷

a、分别量取4体积份正丁醇、0.3体积份甲基叔丁基醚、1体积份乙腈和5 体积份三氟乙酸水溶液，配制成溶剂体系，所述水溶液中三氟乙酸体积分数为 0.1％，该溶剂体系下样品的分离效果好，分离速率较高；

b、设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为800rpm/min，恒温器温度为 20℃，检测器的检测波长为280nm，下相的流速为1.5mL/min，下相流速低，分离效果好；

c、称取花色苷粗提取物120mg溶解于20mL下相中，进样，然后根据色谱流出图在142-144min流出液，即得到飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷流出液，进样量低，分离效果好，流出液的流出时间区间大，操作更方便；

d、取上述飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷流出液加入大量蒸馏水，混合均匀，在50℃条件下旋转蒸发，至溶液由红色恢复至蓝色，得到飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷水溶液；加入大量蒸馏水可以充分稀释三氟乙酸，旋转蒸发可以使三氟乙酸随水蒸气蒸发掉，防止强酸对花色苷的结构产生影响；

(5)分离白檀果黄酮

A、分别量取4体积份乙酸乙酯、1体积份乙醇和5体积份冰乙酸水溶液，配置溶剂体系，所述溶剂体系会形成上下两层，上层为上相，下层为下相；所述水溶液中冰乙酸体积分数为0.5％，该溶剂体系下样品的分离效果好，分离速率较高；

B、设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为900rpm/min，恒温器温度为 20℃，检测器的检测波长为280nmnm，下相的流速为1.5mL/min，在该流速下可以将芦丁和槲皮素-3-O-葡萄糖苷完全分离，且效率相对较高；

C、称取黄酮粗提取物250mg溶解于20mL下相中，进样，然后根据色谱流出图分别在160-186min和284-294min收集流出液，分别得到芦丁流出液和槲皮素-3-O-葡萄糖苷流出液；

D、待收集完槲皮素-3-O-葡萄糖苷流出液，下相的流速改变为2.0mL/min，根据色谱图在423-473min收集流出液，即得到槲皮素-3-O-鼠李糖苷流出液，加快下相流速，使槲皮素-3-O-鼠李糖苷流出速度增大，节省时间；

E、对芦丁流出液进行浓缩处理，然后按照A-C所述体系和方法进行第二次分离，按照色谱图在169-183min收集流出液，即为高纯度的芦丁流出；对芦丁流出液再次进行分离可以提高化合物的纯度；

F、分别取上述高纯度芦丁流出液、槲皮素-3-O-葡萄糖苷流出液和槲皮素 -3-O-鼠李糖苷流出液，在55℃条件下旋转蒸发，即得到芦丁溶液、槲皮素-3-O- 葡萄糖苷溶液和槲皮素-3-O-鼠李糖苷溶液；通过旋转蒸发可以达到通过蒸馏去除冰乙酸的目的；

实施例3

(1)制备提取液：

①称取2.0Kg白檀鲜果，捣碎备用，量取10L质量浓度为70％的甲醇水溶液，备用；

②将捣碎的白檀鲜果加入到提取剂中，超声避光浸提40min，适时搅拌，过滤，有利于白檀果中的有效成分进入提取液中，且有效成分不会失去活性；

③取上述过滤所得滤渣，重复进行上述步骤①和②的浸提过程2次，使白檀鲜果中的有效成分充分进入到提取液中；

④合并上述滤液，即可得到白檀果粗提取液。

(2)浓缩：

(a)设置浓缩温度为50℃；

(b)对由步骤(1)得到的白檀果粗提取液进行减压浓缩，至浓缩提取液体积为粗提取液体积的1/5，得到浓缩提取液；浓缩提取时间短，效率高。

(3)初步纯化

所述步骤(3)初步纯化具体步骤如下：

(A)将由步骤(2)得到的浓缩提取液以4BV/h的流速加入到D101树脂柱中，流速高，节省时间；

(B)浓缩提取液完全加入后，静置40min；

(C)然后依次使用3BV水、6BV质量浓度为15％乙醇和6BV质量浓度为 70％乙醇以3BV/h的流速对上述浓缩提取液进行洗脱，分别收集15％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液；先使用3BV水进行洗脱可以除去一些易溶于水的杂质，再依次使用4BV15％乙醇、4BV70％乙醇进行洗脱是为了使花色苷类化合物与黄酮类化合物分离开；

(D)分别对上述洗脱液进行减压浓缩、冷冻干燥处理，由15％乙醇洗脱液得到白檀果花色苷粗提取物，由70％乙醇洗脱液得到白檀果黄酮粗提取物；由于不同浓度乙醇洗脱液对白檀果提取物的花色苷及黄酮分离效果不同，花色苷类化合物主要集中在15％乙醇洗脱液，黄酮类化合物主要集中在70％乙醇洗脱液中。

(4)分离白檀果花色苷：具体步骤同实施例2所述，其中步骤b中的主机转速为900rpm/min。

(5)分离白檀果黄酮：具体步骤同实施例2所述，其中步骤B中主机转速为900rpm/min。

实施例4

(1)制备提取液：

①称取1.5Kg白檀鲜果，捣碎备用，量取7L质量分数为60％的乙醇水溶液，备用，提取剂用量适中，快速溶解白檀果中的有效成分的同时，降低浓缩难度，节省时间；

②将捣碎的白檀鲜果加入到提取剂中，超声避光浸提30min，适时搅拌，过滤；有利于白檀果中的有效成分进入提取液中，且有效成分不会失去活性；

④合并上述滤液，即可得到白檀果粗提取液；

对白檀果粗提取液进行高效液相色谱检测，结果如图1所示，从图中可以看出分别在13min、30min、31min以及35min位置出现较高的色谱峰，分别为四种化合物的色谱峰。

(2)浓缩：

(a)设置浓缩温度为55℃；

(b)对由步骤(1)得到的白檀果粗提取液进行减压浓缩，至浓缩提取液体积为粗提取液体积的1/7；得到浓缩提取液，浓缩提取液的浓度高，有效成分含量高，有利于提高后续分离的效率，且浓缩时间短，浓缩效率高。

(3)初步纯化：

(A)将由步骤(2)得到的浓缩提取液以3BV/h的流速加入到D101树脂柱中，节省加入提取液的时间，且提取液能相对较快的进入平衡状态；

(B)浓缩提取液完全加入后，静置30min，与步骤(A)中的流速相互配合，使得浓缩提取液加入到大孔吸附树脂柱后能达到平衡状态；

(C)然后依次使用3BV水、4BV质量浓度为15％乙醇和4BV质量浓度为 70％乙醇以3BV/h的流速对上述浓缩提取液进行洗脱，分别收集质量浓度为15％乙醇洗脱液和质量浓度为70％乙醇洗脱液；先使用3BV水进行洗脱可以除去一些易溶于水的杂质，再依次使用4BV15％乙醇、4BV70％乙醇进行洗脱是为了使花色苷类化合物与黄酮类化合物分离开；

分别对质量浓度为15％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液进行高效液相色谱检测，结果分别如图2和图3所示；从图2中可以看出花色苷类化合物的色谱峰最高，其他的色谱峰都不太明显，可以证明15％乙醇洗脱液中花色苷类化合物的含量比较高，而黄酮类化合物含量非常少；从图3中可以看出黄酮类化合物的色谱峰比较明显，而花色苷类化合物的色谱峰比较低，可以证明70％乙醇洗脱液中黄酮类化合物含量高，而花色苷类化合物含量低；

(4)分离白檀果花色苷：具体步骤同实施例2所述，其中步骤b中主机转速为850rpm/min，得到飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷高速逆流色谱图(HSCCC) 如图4所示，根据高速逆流色谱图确定收集时间为142-144min。

(5)分离白檀果黄酮：具体步骤同实施例2所述，其中步骤B中主机转速为850rpm/min，得到高速逆流色谱分离芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素 -3-O-鼠李糖苷的HSCCC图如图5所示，根据高速逆流色谱图确定分别在 160-186min、284-294min和423-473min收集产物，高速逆流色谱第二次分离芦丁的结果如图6所示，确定收集产物的时间区间为169min-183min。

(6)进一步的，对分离产物进行结构鉴定，具体包括如下步骤：

①飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷结构鉴定：取由步骤e得到飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷分离产物，对其分别进行高效液相色谱检测、质谱检测和核磁共振氢谱检测。

通过高效液相色谱检测可以得到飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷的高效液相色谱图(HPLC)结果如图7所示，以及紫外光谱图(UV)结果如图8所示，UV 图中显示在275nm和525nm处出现特征吸收峰，可以推测出该产物为花色苷类化合物。

质谱检测结果显示：出峰位置中最大的质荷比(m/z)为597.1446，由于花色苷具有黄酮结构母核，1号位的氧原子易带上1个正电荷产生黄烊离子，因此在质谱图中所见为该化合物的分子离子峰，即该花色苷的分子量为597。另外质谱中可见其他离子碎片，m/z303.0498，为[M-295+H]⁺，是分子离子峰失去3-O 位上结合的二糖基所得的碎片，推测为飞燕草素母核；m/z465.1027，为 [M-133+H]⁺,推测是分子离子峰失去一个糖基所得的碎片。

核磁共振氢谱检测结果显示1HNMR(400MHz，MeOD，δ)：8.54(1H，H-4， s)，6.82(1H，H-6，d，4.0Hz)，6.87(1H，H-8，d，2.0Hz)，7.65(2H，H-2’，H-6’， s)，5.86(1H，H-1”，d，4.0Hz)，4.89(1H，H-1”’，d，8.1Hz)，4.08～2.97(11H， H-2”～H-7”，H-2”’～H-7”’，m)。

根据文献2(“高速逆流色谱法分离玫瑰茄中的花色苷”，刘雪辉,王振,吴琪,刘林峰,李佳银,陆英，现代食品科技，2014(01):190-194)和文献4 (AntonioSegura-Carretero,MiguelA.Puertas-Mejía1,SoniaCortacero-Ramírez,etal.Selectiveextraction,separation,andidentificationofanthocyaninsfromHibiscussabdariffaL.usingsolidphaseextraction-capillaryelectrophoresis-massspectrometry(time-of-fligh t/iontrap).Electrophoresis2008,29,2852–2861.)公开的内容，对比分析得出，该产物确定为飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷，其化学结构如下所示。

②芦丁结构鉴定：对由步骤G得到的芦丁分离产物，分别进行高效液相色谱检测、质谱检测和核磁共振氢谱检测。

通过高效液相色谱检测可以得到芦丁高效液相色谱图(HPLC)结果如图9 所示，以及紫外光谱图(UV)结果如图10所示，其中UV图中显示在256nm 和352nm处出现吸收峰，推测为5,7,4’-三羟基黄酮醇苷。

质谱检测结果显示：ESI-MSm/z609.1429[M－H]^-，MS²m/z:301，271，255， 243，178，151，108，65；核磁共振氢谱结果显示1H-NMR(400MHz， MeOD)δ:6.10(1H，d，J＝1.2Hz，H-6)，6.44(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.85(1H，d， J＝2.0Hz，H-5')，7.52(1H，d，J＝1.2Hz，H-6')，7.88(1H，d，J＝1.0Hz，H-2')， 5.40(1H，d，J＝7.2Hz，H-1″)，4.30(1H，d，J＝1.2Hz，H-1”’)。再根据文献5(“普洱茶中黄酮类化学成分研究”，张梁,屠鹏飞，中国中药杂志,2013,38(10):1552-1555)公开的内容，比对分析得出该分离产物确定为芦丁，其结构式如下所示。

③槲皮素-3-O-葡萄糖苷结构鉴定：对由步骤G得到的槲皮素-3-O-葡萄糖苷产物，分别进行高速液相色谱检测、质谱检测和核磁共振氢谱检测。

通过高效液相色谱检测可以得到槲皮素-3-O-葡萄糖苷高效液相色谱图(HPLC)结果如图11所示，以及紫外光谱图(UV)结果如图12所示，UV图中显示在256nm和352nm位置出现吸收峰。质谱检测结果显示：ESI-MS m/z 463.0869[M－H]^－；MS²m/z:300，271，255，243，227，199，178，151。核磁共振氢谱检测结果显示1H-NMR(400MHz，MeOD)，δ：6.17(1H，d，J＝8.0Hz，H-6)，6.36(1H，d，J＝4.0Hz，H-8)，7.48(1H，d，J＝4.0Hz，H-6')， 6.80(1H，d，J＝4.0Hz，H-5')，7.72(1H，d，J＝4.0Hz，H-2')，5.50(1H，d，J＝7.2Hz，H-1″)。文献5(“普洱茶中黄酮类化学成分研究”，张梁,屠鹏飞，中国中药杂志,2013,38(10):1552-1555)公开的内容，可以确定该化合物为槲皮素-3-O-葡萄糖苷，其结构式如下所示。

④槲皮素-3-O-鼠李糖苷结构鉴定：对由步骤G得到的槲皮素-3-O-鼠李糖苷产物，分别进行高速液相色谱检测、质谱检测和核磁共振氢谱检测。

通过高效液相色谱检测可以得到高效液相色谱图(HPLC)结果如图13所示和紫外光谱图(UV)结果如图14所示，UV图中在260nm和352nm位置出现吸收峰。质谱结果显示：ESI-MSm/z447.0909[M－H]^－；MS²m/z:300，283，271， 255，243，227，199，178，151。核磁共振氢谱检测结果显示1H-NMR(400MHz， MeOD)δ:6.22(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，6.39(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.94(1H，d， J＝8.0Hz，H-5')，7.31(1H，d，J＝8.0Hz，H-6')，7.35(1H，d，J＝2.0Hz，H-2')， 5.35(1H，d，J＝2.0Hz，H-1″)，1.05(3H，d，J＝6.0Hz，H-6″)。根据文献5(“普洱茶中黄酮类化学成分研究”，张梁,屠鹏飞，中国中药杂志,2013,38(10):1552-1555)公开的内容，可以确定该化合物为槲皮素-3-O-葡萄糖苷，其结构式如下所示。

对比例1

(1)制备提取液：同实施例4所述。

(2)浓缩：同实施例4所述。

(3)初步纯化：同实施例4所述。

(4)分离白檀果花色苷：同实施例4所述。

(5)分离白檀果黄酮：

A、分别量取4体积份乙酸乙酯、1体积份乙醇和5体积份冰乙酸水溶液，配置溶剂体系，所述水溶液中冰乙酸体积分数为0.5％；

B、设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为850rpm/min，恒温器温度为 20℃，检测器的检测波长为280nmnm，下相的流速为1.5mL/min；

C、称取黄酮粗提取物200mg溶解于20mL下相中，进样，然后根据色谱流出图分别在160-186min和284-294min收集流出液，分别得到芦丁流出液和槲皮素-3-O-葡萄糖苷流出液；

E、分别取上述芦丁流出液、槲皮素-3-O-葡萄糖苷流出液和槲皮素-3-O-鼠李糖苷流出液，在55℃条件下旋转蒸发，即得到芦丁溶液、槲皮素-3-O-葡萄糖苷溶液和槲皮素-3-O-鼠李糖苷溶液；

F、分别对上述溶液进行浓缩，冷却，干燥，即可得到芦丁、槲皮素-3-O- 葡萄糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷。

分别对实施例2-4和对比例1得到的产物进行高速液相色谱(HPLC)检测，然后通过面积归一法测定化合物纯度，结果如表3所示。

表3

计算实施例2-4和对比例1得到产物的收率，结果如表4所示。

表4

从上述数据可以看出实施例4分离得到的芦丁纯度明显高于对比例1分离得到的芦丁纯度，因此通过对芦丁流出液的二次分离可以明显提高芦丁的纯度。由表3中数据可以明显得出，在实施例4的实验条件产物的纯度均达到最高值；由表4数据可以明显得出，对比例1和实施例4中各产物的收率均相对较高。综合分析产物的纯度和收率可以得出，在实施例4的实验条件下分离效果最好。

高速逆流色谱检测：

上海同田高速逆流色谱：配有TBE-300A(聚四氟乙烯柱，内径1.6mm，柱容积280ml，主机转速0-1000r/min)，恒流泵TBP-50A，TBD-2000UV检测器，LX-300恒温器。

高效液相色谱检测：

岛津HPLC：配有SPD-M20AUV检测器，色谱柱VenusilASBC18(5μm， 4.6×250mm)，LC-20AT高压泵，CBM-20A控制器，CTO-20A柱温箱；

色谱柱VenusilASBC18(5μm，4.6×250mm)，流动相A为0.1％磷酸水，流动相B为乙腈。二元梯度洗脱，在0-15min内B相的浓度由8％→15％；在 15-40min内B相浓度由5％变为30％；在40-45min时间内B相浓度由30％变为 8％，流速1.0mL/min，柱温25℃。

飞燕草素-3-O-接骨二木糖苷质谱和核磁检测：

化合物质谱采用正离子模式，在Agilent1260UPLC-G6530QTOF液质联用仪测定；核磁共振仪器(300MHz)美国瓦里安公司。

芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷的质谱和核磁检测：

化合物质谱采用负离子模式，在Agilent1260UPLC-G6530QTOF液质联用仪测定；化合物核磁共振谱用Bruke400M核磁共振仪完成。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限制于本文所示的实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干修改和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备提取液：由白檀鲜果制备白檀果粗提取液；

2.根据权利要求1所述的一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法，其特征在于，所述步骤(1)制备提取液具体包括如下步骤：

④合并上述滤液，即可得到白檀果粗提取液。

3.根据权利要求1所述的一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法，其特征在于，所述步骤(2)浓缩具体包括：

(a)设置浓缩温度在45-55℃之间；

4.根据权利要求1所述的一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法，其特征在于，所述步骤(3)初步纯化具体步骤如下：

(B)浓缩提取液完全加入后，静置20-40min；

(C)然后依次使用3BV水、4-6BV质量浓度为10-15％乙醇和4-6BV质量浓度为60-70％乙醇以3BV/h的流速对上述浓缩提取液进行洗脱，分别收集10-15％乙醇洗脱液和60-70％乙醇洗脱液；

5.根据权利要求4所述的一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂柱包括NKA-9树脂柱或D101树脂柱。

6.根据权利要求1所述的一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法，其特征在于，所述步骤(4)分离白檀果花色苷具体步骤如下：

a、分别量取4体积份正丁醇、0.3体积份甲基叔丁基醚、1体积份乙腈和5体积份三氟乙酸水溶液混匀，配制成溶剂体系,所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的体积分数为0.1％，所述溶剂体系会形成上下两层，上层为上相，下层为下相；

7.根据权利要求1所述的一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法，其特征在于，所述步骤(5)分离白檀果黄酮具体步骤如下：

A、分别量取4体积份乙酸乙酯、1体积份乙醇和5体积份冰乙酸水溶液，配置成溶剂体系，所述冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积分数为0.5％，所述溶剂体系会形成上下两层，上层为上相，下层为下相；

F、分别取上述高纯度芦丁流出液、槲皮素-3-O-葡萄糖苷流出液和槲皮素-3-O-鼠李糖苷流出液，在55℃条件下旋转蒸发，即得到芦丁溶液、槲皮素-3-O-葡萄糖苷溶液和槲皮素-3-O-鼠李糖苷溶液；

G、分别对上述溶液进行浓缩，冷却，干燥，即可得到芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷。

8.根据权利要求7所述的一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法，其特征在于，所述步骤B中主机转速为850rpm/min；所述步骤C中上样量为200mg。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法，其特征在于，还包括对由分离得到的花色苷类化合物和黄酮类化合物的结构鉴定。

10.根据权利要求9所述的一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法，其特征在于，所述结构鉴定包括核磁共振谱检测、质谱检测和高效液相色谱检测。