CN108745321A - 用于分离花色苷的虚拟模板分子印迹磁性微球的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于分离花色苷的虚拟模板分子印迹磁性微球的制备方法，所述方法首先在硅烷化磁纳米表面引入双键基团制备双键化磁性载体；然后通过双键聚合反应，使分子印迹层包覆到硅胶的表面。本发明选取与花色苷结构相似的芦丁作为虚拟模板特异性吸附花色苷，解决了花色苷作为模板分子不稳定的问题。本发明提供的分离材料结构新颖，对花色苷具有高识别性能，简化了花色苷繁琐的分离纯化步骤，提高了分离纯化效率低。经过DMMIPs的纯化后，花色苷的纯度可达到89％，解决了花色苷分离纯化步骤繁琐、分离纯化效率低的问题。

Description

用于分离花色苷的虚拟模板分子印迹磁性微球的制备方法
技术领域
本发明涉及一种虚拟模板分子印迹填料的合成方法，具体涉及一种用于分离花色苷的虚拟模板分子印迹磁性微球的制备方法。
背景技术
花色苷是花色素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物。近年来随着研究的深入，花色苷的生物活性逐渐被发现，如抗氧化、抗辐射、抗炎、抗癌、预防糖尿病、保护视力等。花色苷作为一种天然色素，安全、无毒，且对人体具有许多保健功能，已被应用于食品、保健品、化妆品、医药等行业。而花色苷其种类多，结构上只有细微的差别，化学性质不稳定。对于花色苷的分离一直面临巨大的挑战。目前，所用于分离花色苷的色谱填料(大孔树脂、离子交换树脂等)分离效果多不理想，分离周期长，使得单品产率极低，大大限制了对其生物活性研究和应用。所以急需开发一种可以简化花色苷纯化工艺、提高花色苷产率的新型分离纯化方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于分离花色苷的虚拟模板分子印迹磁性微球的制备方法，利用分子印迹对分子形状、大小、功能基团的选择性从而高效、快速、特异性识别花色苷，达到纯化目的。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种用于分离花色苷的虚拟模板分子印迹磁性微球的制备方法，包括如下步骤：
一、双键修饰磁纳米Fe3O4@SiO2-C＝C的合成；
(1)超顺磁性Fe3O4磁性纳米粒子的制备
采用水热法制备超顺磁性Fe3O4纳米粒子，具体步骤如下：
a、称取13～15g FeCl3·6H2O溶于400～600mL乙二醇中，超声20～40min得到黄色透明溶液；
b、加入35～37g无水乙酸钠，机械搅拌20～40min后，将所得溶液转移到不锈钢反应釜中，在180～220℃下反应6～12h；
c、反应完后所得产物分别用双蒸水和水乙醇清洗，真空冻干，得到超顺磁性Fe3O4磁性纳米粒子；
(2)磁性纳米粒子的烷基化的制备
采用改进的法在Fe3O4磁性纳米粒子表面包覆二氧化硅层，得到核-壳式Fe3O4@SiO2磁性硅球，具体步骤如下：
a、取150～250mg Fe3O4于离心管中，加入20～40mL的1～3mol/L盐酸，超声5～15min后，用磁铁分离除去上清液；
b、加入20～40mL的0.4～0.6mol/L的柠檬酸三钠溶液超声5～15min进行分散，去除上清液，用双蒸水清洗，然后加入40～60mL异丙醇与水的混合液(异丙醇和水的体积比为3～5:1)，将混合物倒入三颈瓶中；
c、在机械搅拌作用下，逐滴加入2～4mL氨水和1～2mL TEOS，室温下持续搅拌10～15h；
d、停止反应，用双蒸水和无水乙醇分别清洗，用钕-铁-硼强磁收集制得的超顺磁性Fe3O4@SiO2微球；
e、将超顺磁性Fe3O4@SiO2微球于真空干燥箱中40～60℃真空干燥10～15h，得到Fe3O4@SiO2磁性硅球；
(3)Fe3O4@SiO2-C＝C磁性载体的制备
a、准确称取0.1～0.3g Fe3O4@SiO2磁性硅球于250mL三颈瓶中，加入80～120mL无水甲苯；
b、超声5～15min后进行机械搅拌，边搅拌边加入1.5～2.5mL甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPS)，室温反应10～15h；
c、待反应结束后，将反应产物移至500mL烧杯中，用无水乙醇洗涤，强磁铁收集Fe3O4@SiO2-C＝C磁性硅球；
d、40～60℃真空干燥10～15h，得到Fe3O4@SiO2-C＝C磁性载体；
二、虚拟模板分子印迹DMMIPs的合成：
(1)将0.05～0.1mmol芦丁与0.5～1mmol 4-乙烯基吡啶溶于10～25mL的致孔溶剂(乙腈)中；
(2)室温下预聚合4～8h后加入30～60mg Fe3O4@SiO2-C＝C磁性载体，超声10～20min，室温振荡0.5～1.5h；
(3)加入2～4mmol交联剂和10～30mg引发剂，超声10～20min脱气，再充氮10～20min，密封后置于40～80℃恒温振荡器反应20～30h；
(4)将得到的聚合物先用甲醇和乙酸的混合液(甲醇和乙酸的体积比为8～9：1～2)洗脱去除模板分子，再用甲醇洗去残留的乙酸，40～60℃真空干燥箱中烘干10～15h，得到磁性分子印迹聚合微球。
本发明提供了一种磁性虚拟模板分子印迹分离填料的合成方法，首先在硅烷化磁纳米表面引入双键基团制备双键化磁性载体；然后通过双键聚合反应，使分子印迹层包覆到硅胶的表面。相比于现有技术，本发明具有如下优点：
1、选取与花色苷结构相似的芦丁作为虚拟模板特异性吸附花色苷，解决了花色苷作为模板分子不稳定的问题。
2、本发明提供的分离材料结构新颖，对花色苷具有高识别性能，简化了花色苷繁琐的分离纯化步骤，提高了分离纯化效率低。
3、经过DMMIPs的纯化后，花色苷的纯度可达到89％，解决了花色苷分离纯化步骤繁琐、分离纯化效率低的问题。
附图说明
图1为分子印迹聚合物合成路线；
图2为DMMIPs制备过程中实验样品的SEM图，A：Fe3O4，B：Fe3O4@SiO2，C：DMMIPs，D：MNIPs；
图3为DMMIPs制备过程中实验样品的红外图谱，(a)Fe3O4，(b)Fe3O4@SiO2，(c)Fe3O4@SiO2-C＝C，(d)DMMIPs，(e)MNIPs；
图4为DMMIPs制备过程中实验样品的XRD图谱，(a)Fe3O4，(b)Fe3O4@SiO2，(c)DMMIPs；
图5为DMMIPs制备过程中样品的热重曲线，(a)Fe3O4，(b)Fe3O4@SiO2，(c)Fe3O4@SiO2-C＝C，(d)DMMIPs；
图6为吸附动力学，A：吸附量-时间曲线，B：时间吸附动力学准一级反应模型，C：时间吸附动力学准二级反应模型，D：分段模拟；
图7为DMMIPs和MNIPs在不同花色苷浓度下的平衡吸附量，A：等温吸附曲线，B：Langmuir模型，C：Freundlich；
图8为DMMIPs特异性吸附；
图9为DMMIPs重复利用率；
图10为蓝靛果提取物高效液相色谱图，A：矢车菊素-3-O-芸香糖苷标准品，B：蓝靛果提取物，C：提取物被DMMIPs吸附后剩余物，D：DMMIPs洗脱物。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明提供了一种用于分离花色苷的虚拟模板分子印迹磁性微球的制备方法，具体内容如下：
一、虚拟模板分子印迹磁性微球的制备
1、超顺磁性Fe3O4磁性纳米粒子的制备(Fe3O4)
称取13.50g FeCl3·6H2O溶于500mL乙二醇中，超声30min得到黄色透明溶液。然后加入36.00g无水乙酸钠，机械搅拌30min后，将所得溶液转移到不锈钢反应釜中，在200℃下反应6h。反应完后所得产物分别用双蒸水和水乙醇清洗，以去除未反应的物质。然后真空冻干备用。
2、磁性纳米粒子的烷基化的制备(Fe3O4@SiO2)
采用溶胶-凝胶法制备Fe3O4磁性纳米粒子表面包覆二氧化硅层，具体步骤如下：
取200mg Fe3O4于离心管中，加入30mL的2mol/L盐酸，超声10min后，用磁铁分离除去上清液后，然后再加入30mL的0.5mol/L的柠檬酸三钠溶液超声10min进行分散，去除上清液，再用双蒸水清洗次，然后加入50mL异丙醇与水的混合液，异丙醇：水＝4:1(v：v)，将混合物倒入三颈瓶中。在机械搅拌作用下，逐滴加入3.0mL氨水和1.5mLTEOS，室温下持续搅拌12h后，停止反应，用双蒸水和无水乙醇分别清洗，用钕-铁-硼强磁收集制得的超顺磁性Fe3O4@SiO2微球，将沉淀于真空干燥箱中60℃真空干燥12h后备用。
3、Fe3O4@SiO2-C＝C磁性载体的制备
准确称取0.2g Fe3O4@SiO2磁性硅球于250mL三颈瓶中，加入100mL无水甲苯，超声10min后进行机械搅拌，边搅拌边加入2.0mL甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPS)，室温反应12h，待反应结束后，将反应产物移至500mL烧杯中，用无水乙醇洗涤5次，每次100mL，强磁铁收集Fe3O4@SiO2-C＝C磁性硅球，于45℃真空干燥12h，备用。
4、DMMIPs(MNIPs)聚合物的制备
将0.075mmol芦丁(Rutin)与0.6mmol功能单体4-乙烯基吡啶(4-VP)溶于15mL乙腈中。室温下，预聚合6h后加入40mg接有双键的磁性载体，超声15min，室温振荡1h，加入3mmol交联剂(EDMA)和20mg引发剂(AIBN)，超声15min脱气，再充氮15min，密封后置于60℃恒温振荡器反应24h。得到的聚合物用甲醇：乙酸＝9:1(v:v)洗脱去除模板分子，反复洗脱，直至在洗脱溶液中检测不出模板分子。再用甲醇洗去残留的乙酸，60℃真空干燥箱中烘干12h，合成路线如图1所示。非分子印迹聚合物MNIPs除了不加模板分子以外，其余的合成步骤和印迹聚合物一致。
二、磁性分子印迹聚合微球的分析与表征
1、磁性分子印迹聚合微球(Rutin-MMIPs)的SEM表征
图2为在Quanta 200FEG场发射扫描电子显微镜，观察得到的磁性分子印迹聚合物在合成过程中的扫描电镜图。
图2A为Fe3O4磁性纳米微球的SEM图。从图中可以看到，采用水热法制备出的超顺磁性Fe3O4纳米粒子表面粗糙，凹凸不平，并发生聚集，并且每个磁性微球都是由大量的Fe3O4纳米颗粒聚集而成。直径约为200nm左右，粒径分布均匀。
图2B为Fe3O4@SiO2磁性微球的SEM图。从图中可以看到，采用改进的法制备的核-壳式磁性二氧化硅微球。在氨水催化下，TEOS水解包覆在Fe3O4颗粒表面，形成表面平滑、尺寸均一、分散均匀的微球。Fe3O4@SiO2磁性微球的平均粒径在300～400nm之间。由于Fe3O4表面形成了一层二氧化硅层，使得Fe3O4颗粒之间的磁性偶极吸引作用减弱，使其在水中的分散性能增加，不再出现聚集的现象。同时因为二氧化硅层的引入，其表面充溢着大量的硅羟基，使其能与硅烷偶联剂MPS反应，在Fe3O4@SiO2磁性微球表面引入双键官能团。
图2C和2D分别为DMMIPs和MNIPs磁性微球的SEM图。从图中可以看到，包覆过程没有导致粒子的团聚和粒径大小的明显变化，但是使表面变得粗糙，这主要是由于反应是在粒子表面进行的，形成的分子印迹层为多孔结构。
3、Rutin-MMIPs微球的红外分析
通AVATAR 360型傅里叶红外光谱仪测定花色苷磁性分子印迹微球制备过程中Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@C＝C、DMMIPs、MNIPs5种微粒的红外光谱图，如图3所示。
从图3(a)Fe3O4的红外谱图中可见，在575cm-1附近为Fe-O的伸缩振动吸收峰，为Fe3O4的特征吸收峰，证明Fe3O4磁性粒子的合成成功。
与图3(a)相比，从图3(b)Fe3O4@SiO2的红外谱图中可见，575cm-1附近Fe3O4的特征吸收峰明显消弱，新增出1091cm-1附近Si-O-Si的反对称伸缩振动吸收峰、951cm-1附近Si-OH键中Si-O的振动特征峰以及799cm-1附近Si-O-Si的弯曲振动吸收峰，3400cm-1附近为-OH伸缩振动峰都是SiO2结构的主要特征吸收峰，证明Fe3O4表面成功合成SiO2层。
从图3(c)中可知，在1650cm-1处为C＝C基团的特征吸收峰，说明Fe3O4@SiO2表面接枝了双键基团。
从图3(d)和3(e)中可知，在1736cm-1附近出现C＝O伸缩峰，2985cm-1附近出现CH2振动峰，这些峰都为交联剂EGDMA的特征吸收峰，说明分子印迹层成功嫁接在Fe3O4@SiO2@C＝C表面。以上各个特征吸收峰都证明了DMMIPs和MNIPs制备过程中，每步反应的成功合成。
4、MMIPs微球的XRD分析
图4为Fe3O4微球、Fe3O4@SiO2微球和DMMIPs的XRD表征图谱。从XRD图谱中可以看出Fe3O4、Fe3O4@SiO2和DMMIPs磁性材料均出现了6个典型的2θ角位于30.15°、35.57°、43.36°、53.85°、57.40°、和62.58°的吸收峰，分别对应于(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、(440)，这些数据与JCPDS国际衍射中心数据库的文件19-692文件相符。由此可见，高分子包覆功能化复合磁性材料的晶型没有发生变化，保持了Fe3O4的尖晶石结构。
5、Rutin-MMIPs微球的热重分析
通过热重分析可以测定磁性微球表面接枝高分子聚合物的分子组成。Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@C＝C、DMMIPs 4种磁性微球的热重分析是在氮气保护下，从室温开始以20℃/min的速率，升温至800℃，TGA曲线如图5所示。
由图5(a)Fe3O4微球热重曲线中可知，Fe3O4质量一共损失5.1％，在温度到达120℃时开始失重，质量降低0.3％主要是失水造成的，在温度达到360℃时，质量损失4.8％，是因为有部分Fe3O4微球热解成Fe2O3。Fe3O4可以承受很高的温度，所以Fe3O4在整个加热过程中，质量的损失率很低。
由图5(b)Fe3O4@SiO2微球热重曲线可知，Fe3O4@SiO2质量一共损失6.4％，在温度达到100℃时，质量损失0.92％主要是由Fe3O4@SiO2失水造成的，在温度200～600℃区间，Fe3O4@SiO2表面硅羟基Si(OH)4失重5.38％，主要是因为正硅酸乙酯(TEOS)在碱性条件下，水解生成硅羟基包覆在Fe3O4微球表面，Si-O键键能非常大，所以可以承受很高的温度，在200～600℃温度区间质量损失非常小。
与图5(b)相对比，图5(c)中Fe3O4@SiO2@C＝C的热损失为7.8％，要比Fe3O4@SiO2要多1.4％，这是由于Fe3O4@SiO2@C＝C微球表面接上的MPS失重引起的，可以算出双键的接枝度
由图5(d)曲线可知DMMIPs微球当温度达到800℃时质量一共损失29.3％，其中在温度达到110℃时，质量损失0.4％，主要是失水造成的。在温度达到800℃时，质量损失28.9％，主要是因为分子印迹层失重造成的。因此可知，在烷基化磁铁表面成功合成了一层聚合物，证明表面分子印迹聚合物的制备成功。
三、磁性分子印迹聚合微球的吸附性能研究
1、吸附动力学及其模型研究
吸附动力学主要研究吸附时间和吸附量之间的关系，它可以用来衡量分子印迹聚合物达到吸附平衡的速率，通过绘制吸附动力学曲线来研究DMMIPs和MNIPs达到饱和时所需的时间，如图6A所示。由图6A可知磁性非分子印迹聚合物在40min时吸附基本达到饱和，这时吸附量为6.32mg/g，180min时最大饱和吸附量为6.39mg/g。MNIPs表面形成聚吡啶化合物，所以MNIPs对花色苷有吸附效果。分子印迹聚合物在60min时吸附基本达到饱和，这时对花色苷的吸附量为10.63mg/g，180min时最大饱和吸附量为10.99mg/g。在制备分子印迹时，DMMIPs加入了芦丁作为模板，而MNIPs是在没有模板的条件下4-VP发生聚合形成聚吡啶，而DMMIPs形成了具有专一性识别空洞，这就加大了DMMIPs对花色苷的吸附量，实验结果表明DMMIPs与MNIPs相比对花色苷的吸附量提高了1.73倍。
综合比较两种动力学模型，拟合效果并不是十分理想，我们将数据进行分段拟合(如图6D)发现吸附在40min前符合动力学一级模型，模拟曲线为Y＝-0.0158X+1.0968，R2＝0.9885；40min后的吸附过程经过拟合符合动力学二级模型，模拟曲线为Y＝0.0873X+0.4802，R2＝0.9997。我们可以得出结论：在我们制得的分子印迹聚合物(DMMIPs)对目标分子进行吸附过程中，前40min吸附动力学一级模型占主导地位，后40min吸附动力学二级模型占主导地位，整个过程是通过吸附剂与吸附质之间的电子共用或电子转移来和物理吸附共同实现的。
2、吸附等温曲线及其模型研究
DMMIPs的吸附量是衡量DMMIPs吸附能力大小的重要热力学参数，研究DMMIPs吸附含量的常用方法是绘制吸附等温曲线。本实验在25℃条件下，采用静态吸附方法测定的DMMIPs和MNIPs在不同花色苷浓度下的平衡吸附量，结果见图7。
由图7A DMMIPs和MNIPs的吸附等温曲线中可知，DMMIPs对花色苷的吸附量要明显高于MNIPs对花色苷的吸附量，这是由于在DMMIPs聚合物制备过程中，双键化四氧化三铁表面进行4-乙烯基(4-VP)高分子聚合反应，形成具有三维立体空穴结构的高分子聚合物，其中功能单体4-VP可以在聚合物结构中规则的分布，所形成的立体空穴与花色苷的结构和大小互相匹配，高分子聚合物表面所形成的吡啶基团对花色苷所形成的静电相互作用和π-π*共轭作用，可以对花色苷特异性识别。然而，MNIPs聚合物制备过程中，功能单体4-VP的分布不规则，但高分子聚合物表面存在的功能单体也能吸附一定量的花色苷，但这种吸附不属于特异性吸附。
在0～40mg/g的花色苷浓度范围内，DMMIPs随花色苷浓度的升高其吸附量也不断的增加，当花色苷浓度超过40mg/g后，DMMIPs吸附量增加速度逐渐趋于平衡，印迹聚合物的吸附量不会再随着花色苷浓度的升高而增加，吸附达到饱和。
通过比较两种吸附等温曲线模型可知Langmuir模型(图7B)比Freundlich模型(图7C)的拟合效果更好，对我们合成的分子印迹聚合物识别能力具有更高的表征。因此，我们可以得出结论：磁纳米分子印迹聚合物对花色苷的吸附过程是单分子层吸附，并且它的表面识别位点均一，一个识别位点只对应一个模板分子。
3、DMMIPs微球的吸附选择性
本项研究是在室温条件下，将5mg的DMMIPs和MNIPs分别放入到浓度为40mg/L的花色苷、槲皮素和柚皮苷溶液中，在回旋式振荡器上振荡2h，外磁场作用分离样品，用双光束紫外-可见分光光度计，分别在280nm、375nm和282nm测定溶液中花色苷、槲皮素和柚皮苷的平衡浓度，如图8所示。
为了证明DMMIPs微球具有较高的亲和力和选择识别性，本发明选择槲皮素和柚皮苷作为竞争性分子，通过吸附选择性实验来评价DMMIPs微球的选择识别能力。槲皮素上羟基个数和位置与矢车菊3-O-芸香糖苷一致，但不含糖。柚皮苷和矢车菊3-O-芸香糖苷有相同的二糖，而羟基在苯环上位置不同，所以本发明选择槲皮素和柚皮苷作为对照。从图8中可知，DMMIPS微球对花色苷的吸附量10.98mg/g明显高于柚皮苷2.72mg/g和槲皮素1.60mg/g。分子印迹印迹因子分别为IFanthocyanin为1.70、IFnaringin为1.35、IFquercetin为1.23，更说明DMMIPs对花色苷具有专一性识别的能力。
4、磁纳米分子印迹聚合物的重复利用率
本项研究对DMMIPs微球进行了重复性实验，取5mg DMMIPs加入于5mL 40mg/L的花色苷水溶液中，放置于恒温振荡器上吸附2h后，在外加磁场的作用下分离沉降样品，取上清液，采用紫外分光光度法测定花色苷含量。将收集的DMMIPs洗脱至无花色苷检出为止，将样品在40℃下真空干燥，按以上步骤重复试验10次，每次都计算DMMIPs的吸附量，并绘制出DMMIPs的重复利用率图，如图9所示。
从图9中可知，经过10次的反复吸附DMMIPs的吸附量降低了15.3％，吸附能力的降低主要是因为分子印迹识别过程主要是通过三维空间空隙，而分子印迹经过反复的使用后，会使这些空隙阻塞，造成吸附能力的降低，所以在分子印迹应用过程中反复有效的洗脱尤为重要。实验结果也证明DMMIPs经过反复的使用对花色苷仍然具有很好的吸附能力。
四、分子印迹用于花色苷粗提物的纯化
从图10中可以看出制备的DMMIPs对花色苷矢车菊素-3-O-芸香糖具有很好的纯化效果，花色苷矢车菊素-3-O-芸香糖的纯度从40％提高到89％。在复杂的基质干扰下，DMMIPs仍然对矢车菊素-3-O-芸香糖具有很高的特异性，可以在混合物中快速捕获花色苷，从而达到快速富集的目的。

Claims (8)

1.一种用于分离花色苷的虚拟模板分子印迹磁性微球的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：
一、双键修饰磁纳米Fe3O4@SiO2-C＝C的合成；
(1)超顺磁性Fe3O4磁性纳米粒子的制备
采用水热法制备超顺磁性Fe3O4纳米粒子；
(2)磁性纳米粒子的烷基化的制备
采用改进的法在Fe3O4磁性纳米粒子表面包覆二氧化硅层，得到核-壳式Fe3O4@SiO2磁性硅球；
(3)Fe3O4@SiO2-C＝C磁性载体的制备
a、准确称取0.1～0.3g Fe3O4@SiO2磁性硅球于250mL三颈瓶中，加入80～120mL无水甲苯；
b、超声5～15min后进行机械搅拌，边搅拌边加入1.5～2.5mL甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，室温反应10～15h；
c、待反应结束后，将反应产物移至500mL烧杯中，用无水乙醇洗涤，强磁铁收集Fe3O4@SiO2-C＝C磁性硅球；
d、40～60℃真空干燥10～15h，得到Fe3O4@SiO2-C＝C磁性载体；
二、虚拟模板分子印迹DMMIPs的合成
(1)将0.05～0.1mmol芦丁与0.5～1mmol 4-乙烯基吡啶溶于10～25mL的致孔溶剂中；
(2)室温下预聚合4～8h后加入30～60mg Fe3O4@SiO2-C＝C磁性载体，超声10～20min，室温振荡0.5～1.5h；
(3)加入2～4mmol交联剂和10～30mg引发剂，超声10～20min脱气，再充氮10～20min，密封后置于40～80℃恒温振荡器反应20～30h；
(4)将得到的聚合物先用甲醇和乙酸的混合液洗脱去除模板分子，再用甲醇洗去残留的乙酸，40～60℃真空干燥箱中烘干10～15h，得到磁性分子印迹聚合微球。
2.根据权利要求1所述的用于分离花色苷的虚拟模板分子印迹磁性微球的制备方法，其特征在于所述采用水热法制备超顺磁性Fe3O4纳米粒子的具体步骤如下：
a、称取13～15g FeCl3·6H2O溶于400～600mL乙二醇中，超声20～40min得到黄色透明溶液；
b、加入35～37g无水乙酸钠，机械搅拌20～40min后，将所得溶液转移到不锈钢反应釜中，在180～220℃下反应6～12h；
c、反应完后所得产物分别用双蒸水和水乙醇清洗，真空冻干，得到超顺磁性Fe3O4磁性纳米粒子。
3.根据权利要求1所述的用于分离花色苷的虚拟模板分子印迹磁性微球的制备方法，其特征在于所述核-壳式Fe3O4@SiO2磁性硅球的具体制备步骤如下：
a、取150～250mg Fe3O4于离心管中，加入20～40mL的1～3mol/L盐酸，超声5～15min后，用磁铁分离除去上清液；
b、加入20～40mL的0.4～0.6mol/L的柠檬酸三钠溶液超声5～15min进行分散，去除上清液，用双蒸水清洗，然后加入40～60mL异丙醇与水的混合液，将混合物倒入三颈瓶中；
c、在机械搅拌作用下，逐滴加入2～4mL氨水和1～2mL TEOS，室温下持续搅拌10～15h；
d、停止反应，用双蒸水和无水乙醇分别清洗，用钕-铁-硼强磁收集制得的超顺磁性Fe3O4@SiO2微球；
e、将超顺磁性Fe3O4@SiO2微球于真空干燥箱中40～60℃真空干燥10～15h，得到Fe3O4@SiO2磁性硅球。
4.根据权利要求3所述的用于分离花色苷的虚拟模板分子印迹磁性微球的制备方法，其特征在于所述异丙醇和水的体积比为3～5:1。
5.根据权利要求1所述的用于分离花色苷的虚拟模板分子印迹磁性微球的制备方法，其特征在于所述致孔溶剂为乙腈。
6.根据权利要求1所述的用于分离花色苷的虚拟模板分子印迹磁性微球的制备方法，其特征在于所述交联剂为EDMA。
7.根据权利要求1所述的用于分离花色苷的虚拟模板分子印迹磁性微球的制备方法，其特征在于所述引发剂为AIBN。
8.根据权利要求1所述的用于分离花色苷的虚拟模板分子印迹磁性微球的制备方法，其特征在于所述甲醇和乙酸的体积比为8～9：1～2。
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