CN115926046B - 一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物及其制备方法和应用，所述的梓醇磁性表面分子印迹聚合物采用磁性载体，有着优异的磁性能，对于梓醇具有特异性吸附能力，吸附量达43.36μg/mg，可快速分离梓醇，具有成本低、特异性强、化学稳定性、物理稳健性和可循环使用等优势。本发明将所述的一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物应用于梓醇的提取或检测中，提高了样品中梓醇的提取率和检测准确率，消除其他成分对梓醇测定的干扰和影响，且灵敏度高、富集效果好、重复使用性好、回收率高，回收率为99.95％‑104％。
Description
技术领域
本发明涉及一种磁性表面分子印迹聚合物，特别涉及一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物及其制备方法和在复杂样品中梓醇富集、检测的应用。
背景技术
地黄为玄参科植物地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)的块根，为中医常用的补益中药之一。地黄的化学成分以环烯醚萜苷类为主，其中梓醇(Catalpol，CAT)是发挥地黄药理作用的主要成分。梓醇具有降血糖、利尿、抗肿瘤、抗衰老和抗炎等生物活性和药理作用，具有重要的利用价值和应用前景。但由于梓醇结构复杂、不稳定，极性大且和其他环烯醚萜苷类化合物相似，存在基质内成分的干扰，因此导致分离、检测较为困难。目前地黄中梓醇的检测方法有反相高效液相色谱(RP-HPLC)、高效液相色谱(HPLC)方法、液质联用(HPLC-UV-MS)法、HPLC-DAD-ELSD串联法等。上述方法一般采用固相萃取(Solid-phaseExtraction，SPE)作为样品预处理技术，以便在定量分析之前清理基质复杂度。但在复杂样品和痕量的梓醇检测时，由于传统SPE吸附剂耗时长且微粒表面积较小，导致吸附能力、富集效率和纯度较低，严重限制了梓醇的富集和检测。因此，开发一种具有选择性、快速、灵敏的样品前处理方法对梓醇的富集、检测具有重要意义。
分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)是通过目标化合物(模板)与功能单体在溶液中络合，通过共价键或非共价键与过量的交联剂聚合形成高度交联的聚合物网络。但目前并没有关于梓醇的分子印迹聚合物的研究和应用，因此，提供一种高提取率和检测准确率的梓醇分子印迹聚合物是一个需要解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物及其制备方法和应用。
本发明提供的一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物，由以下方法制得：
(1)将梓醇(CAT)和功能单体甲基丙烯酰胺(AM)溶解于二甲基亚砜(DMSO)，室温下搅拌后，得到混合液；梓醇和甲基丙烯酰胺的摩尔比为1：5；
(2)将1-10g Fe3O4@SiO2加入步骤(1)的混合液中，超声处理后，得到预聚合液；
(3)将交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和10-200mg引发剂偶氮二异丁氰(AIBN)加入到步骤(2)的预聚合液混合均匀后，在氮气保护下水浴加热65-70℃，搅拌12-24h，得到聚合液；
(4)反应完成后，通过外磁场分离聚合液，并用甲醇:乙酸洗脱液、纯水洗涤去除模板分子梓醇，直至梓醇不能被HPLC检测到为止；
(5)洗涤后溶液真空干燥，得到梓醇磁性表面分子印迹聚合物(Fe3O4@SiO2@MMIPs)。
进一步的，梓醇、甲基丙烯酰胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯和二甲基亚砜的摩尔比为1：5：5：90。
作为优选，步骤(2)中Fe3O4@SiO2的制备方法如下：
a)Fe3O4纳米颗粒的合成
FeCl3·6H2O溶液和FeSO4·4H2O溶液按照摩尔比2：1，放置于三颈烧瓶中，加入去离子水搅拌溶解，加入体积浓度25％的氨水，直至溶液由橙红色变为黑色，在氮气保护下水浴加热75℃搅拌2-3h；使用磁倾析法将合成的Fe3O4纳米粒子从反应体系中分离，用去离子水、无水乙醇洗涤至少3次，至上清液澄清，洗涤完毕后在60-70℃下干燥，得Fe3O4纳米颗粒；
b)Fe3O4@SiO2纳米颗粒的合成
取0.1-2gFe3O4纳米颗粒分散在无水乙醇和去离子水的混合溶液中，乙醇和去离子水的体积比为5:1，加入氨水，使溶液pH为碱性，缓慢滴入四乙氧基硅烷(TEOS)，在室温下连续搅拌反应12h；所得到的微球用无水乙醇和超纯水洗涤后，真空干燥，即得Fe3O4@SiO2纳米颗粒。
作为优选，步骤(4)中甲醇:乙酸洗脱液的甲醇与乙酸的体积比为9:1。
本发明将所述的一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物应用于梓醇的提取或检测中，所述的一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物对于梓醇具有特异性吸附能力，吸附量达43.36μg/mg。
本发明提供的一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物在提取地黄中梓醇的应用，包括以下步骤：
(1)地黄提取液的制备：
取地黄切成小块，经80℃减压干燥24小时后，磨成粗粉，取粗粉加入到体积浓度25％的甲醇中，粗粉与甲醇的质量体积比为1:25，单位为g：mL；超声提取1-2小时，冷却，再称定重量，用体积浓度25％的甲醇补足减失的重量，摇匀，离心取上清液，采用HPLC测得供试液中CAT的浓度；
(2)固相萃取过程：
取稀释后的地黄提取液加入所述的梓醇磁性表面分子印迹聚合物，混合物在30-35℃摇晃吸附120 -150min，用磁铁将材料从溶液分离，得到的梓醇磁性表面分子印迹聚合物先用超纯水清洗，清除非特异性杂质，再用洗脱液进行超声洗脱1-3次，洗脱10min，得到药材吸附后的材料洗脱液；所述的洗脱液为甲醇：乙酸体积比9：1混合液。可根据需要重复步骤(2)直至地黄提取液中检测不到CAT的浓度。
本发明提供的一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物在生物血样中梓醇检测的应用，包括以下步骤：
向待检测生物样品溶液中加入本发明提供的一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物，在pH＝9、温度30-35℃下，振摇吸附120 -150min；吸附结束后用甲醇：乙酸体积比9：1的洗脱液洗脱3次，洗脱时间不少于20min，得到的洗脱液于氮吹仪60℃下吹干；吹干后，流动相复溶进行HPLC分析。
本发明的有益效果：
本发明制备的梓醇磁性表面分子印迹聚合物采用磁性载体，有着优异的磁性能，对于梓醇具有特异性吸附能力，可快速分离梓醇，具有成本低、特异性强、化学稳定性、物理稳健性和可循环使用等优势。本发明制备的梓醇磁性表面分子印迹聚合物作为吸附剂应用于磁固相萃取技术结合HPLC对复杂成分中的梓醇吸附容量大，利用制备的磁性表面分子印迹聚合物应用于中药、生物样品中的梓醇含量测定的前处理方法中，提高了样品中梓醇的提取率和检测准确率，消除其他成分对梓醇测定的干扰和影响，且灵敏度高、富集效果好、重复使用性好、回收率高，回收率为99.95％-104％。
附图说明
图1为本发明实施例1中9种MMIPs对梓醇的吸附量示意图；
图2为本发明实施例1中MMIPs的电镜图，其中(a)(b)为SEM图，(c)(d)为TEM图；
图3为本发明实施例1中Fe3O4纳米颗粒(a)、Fe3O4@SiO2(b)、MNIPs(c)和MMIPs(d)的傅里叶变换红外光谱示意图；
图4为本发明实施例1中MMIPs和MNIPs的VSM示意图；
图5为本发明实施例2中MMIPs和MNIPs对梓醇的静态吸附等温线示意图；
图6为本发明实施例2中MMIPs和MNIPs动态吸附等温线示意图；
图7为本发明实施例2中MMIPs和MNIPs对不同化合物吸附示意图；
图8为本发明实施例2中MMIPs和MNIPs在不同温度下的吸附水平示意图；
图9为本发明实施例2中MMIPs和MNIPs在不同pH下的吸附水平示意图；
图10为本发明实施例3地黄提取物经SPE柱渗透前(a)、从MISPE柱中提取的洗脱溶液(b)、地黄提取液洗脱后(c)的色谱图；
图11为本发明实施例4梓醇标准品(a)、从MISPE柱中萃取后的洗脱溶液(b)、血清洗加标准品(c)、空白血清(d)的色谱图。
具体实施方式
实施例1、
本实施例提供的一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物，由以下方法制得：
(1)将梓醇(CAT)和功能单体甲基丙烯酰胺(AM)溶解于90ml二甲基亚砜(DMSO)，室温下搅拌0.5-1h后，得到混合液；所述梓醇、甲基丙烯酰胺和二甲基亚砜的摩尔比为1：5：90；
(2)将2gFe3O4@SiO2加入步骤(1)的混合液中，超声5min后，得到预聚合液；
(3)将5ml交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和80mg引发剂偶氮二异丁氰(AIBN)加入到步骤(2)的预聚合液混合均匀后，在氮气保护下水浴加热65℃，搅拌24h，得到聚合液；
(4)反应完成后，通过外磁场分离聚合液，并用体积比为9:1的甲醇:乙酸洗脱液、纯水洗涤去除模板分子梓醇，直至梓醇不能被HPLC检测到为止；甲醇:乙酸洗脱液每次50毫升，洗脱三次，纯水每次100毫升，洗脱两次；
(5)洗涤后溶液在75℃真空干燥24h，得到梓醇磁性表面分子印迹聚合物(Fe3O4@SiO2@MMIPs)。
步骤(2)中Fe3O4@SiO2的制备方法如下：
a)Fe3O4纳米颗粒的合成
FeCl3·6H2O溶液和FeSO4·4H2O溶液按照摩尔比2:1，放置于三颈烧瓶中，加入100mL去离子水搅拌溶解，加入体积浓度25％的氨水10ml，直至溶液由橙红色变为黑色，在氮气保护下水浴加热75℃搅拌2h；使用磁倾析法将合成的Fe3O4纳米粒子从反应体系中分离，用去离子水、无水乙醇洗涤3次，至上清液澄清，洗涤完毕后在60℃下干燥12h，即得Fe3O4纳米颗粒；
b)Fe3O4@SiO2纳米颗粒的合成
精密称取0.5g Fe3O4纳米颗粒分散在100mL无水乙醇和20mL去离子水的混合溶液中，加入氨水，使溶液pH为碱性，缓慢滴入2ml四乙氧基硅烷(TEOS)，在室温下连续搅拌反应12h；所得到的微球用无水乙醇和超纯水洗涤后，80℃真空干燥12h，即得Fe3O4@SiO2纳米颗粒。
梓醇与功能单体紫外光谱法线性关系效果对比：
分别配制0.01mmol/mL的梓醇与甲基丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸、4-乙烯基吡啶、1-乙烯基咪唑5种单体的混合液，将模板分子梓醇与5种单体按照1:0、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7的比例配制，混合液室温下超声搅拌0.5h，得到预组装液，在205nm处测定吸光度，计算不同比例的吸光度与1:0的比例下得到的吸光度的差值。按照公式(1)计算得到最佳功能单体及模板与功能单体的比例。
其中，a0是梓醇浓度，b0是功能单体浓度，△A是加入功能单体后与未加入功能单体时溶液的紫外吸收光度差；n是复合物的化学配位比；以△A/b0n对△A进行线性拟合，由直线的斜率可求得结合常数K值。
如表1所示，当甲基丙烯酰胺作为功能单体和n＝5时，R2为0.9936，形成良好的线性关系，线性方程为△A/b05＝-1.4299x+1.1351。因此梓醇与功能单体甲基丙烯酰胺的比例为1:5是最优。
表1差示紫外光谱法线性关系
交联剂和致孔剂的效果对比：
通过改变致孔剂(DMSO、DMF)和交联剂(EGDMA、DVB)的种类，合成四种NIP，即DMF-EGDMA-NIP(NIPA)，DMF-DVB-NIP(NIPB)，DMSO-DVB-NIP(NIPC)和DMSO-EGDMA-NIP(NIPD)。
分别称取4种NIP(NIPA、NIPB、NIPC、NIPD)，每份1-5.0mg分散在不同浓度(0-300mg/ml)的梓醇溶液，30℃下振摇吸附2h。吸附结束后，HPLC测定上清液中游离梓醇的浓度。通过比较四种MNIPs对梓醇及吸附性能参数的差异，逆向预测得到最佳交联剂为EGDMA，最佳致孔剂为DMSO。
其中B为NIP的吸附量，Bmax为NIP的最大吸附量，F为未吸附的药物的量。B/F为吸附的药物的量/未吸附的药物的量。
如图1所示，为9种梓醇磁性表面分子印迹聚合物(以下简称MMIPs)的不同合成条件和吸附能力的结果。其中MMIP-3的合成条件为CAT:AM:EGDMA:DMSO＝1:5:5:90，吸附能力最高，为49.60μg/mg，回收率为99.20％。因此，MMIPs的最佳合成条件为CAT:AM:EGDMA:DMSO＝1:5:5:90。
(1)扫描电镜、透射电镜分析
如图2所示，本发明MMIPs呈球形，印迹壳层厚度约为20nm。通过透射电镜观察了MMIPs的形态结构。MMIPs显示出具有夹心结构的球形微球，由深色四氧化三铁核、灰色二氧化硅中间层和厚度约为20nm的浅灰色MMIPs壳组成。与传统的MMIPs相比，本发明MMIPs表面相对粗糙，这是因为在Fe3O4@SiO2表面发生印迹聚合，表明其分子印迹层是多孔的，有利于快速转移模板进行去除和重结合，具有较高的吸附能力和印迹效率。
(2)红外分析
图3显示了Fe3O4纳米颗粒、Fe3O4@SiO2、MMIPs和MNIPs的傅里叶变换红外光谱，所述的Fe3O4纳米颗粒、Fe3O4@SiO2、MMIPs分别由上述方法制得，MNIPs采用本发明梓醇磁性表面分子印迹聚合物制备方法制得，但在步骤(1)中不添加模板分子梓醇。584cm-1左右的强吸收峰为Fe-O的伸缩振动特征，3440cm-1左右的伸缩振动峰为-OH，是四氧化三铁纳米颗粒合成的证明；801cm-1的强峰代表Si-O基团，1147cm-1代表Si基团，3456cm-1的吸收是Si-O-H的拉伸振动峰与Fe-0颗粒表面吸附的水的羟基吸收峰结合的结果，说明二氧化硅被四氧化三铁涂层成功；与Fe3O4@SiO2相比，MMIPs在1741cm-1处有明显的特征峰，交联剂EGDMA中为C＝O，MIP层被成功接枝到Fe3O4@SiO2的表面，这证明了MMIPs表面有大量的模板识别位点；2986cm-1左右的特征带是-甲基和-甲烯的拉伸振动，证明分子印迹层被成功包裹。MMIPs和MNIPs的红外光谱看起来非常相似，这是它们合成过程相似的结果。
(3)VSM分析
VSM是一种用于研究磁性纳米粒子的超顺磁性特性的方法。如图4所示，两个样品的残余量和矫顽力趋近于零，并表现出超顺磁特性。同时，在这些样品中没有发现磁滞现象。这些结果表明，上述聚合物可以实现快速磁分离和均匀悬浮。MMIPs和MNIPs的饱和磁化值分别为83.35、32.60emu/g。优良的磁响应可以保证MMIPs在分离和重复使用过程中的快速切换，提高富集效率。
实施例2、
本实施例将所述的一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物应用于梓醇的提取或检测中，所述的一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物对于梓醇具有特异性吸附能力。
梓醇磁性表面分子印迹聚合物的吸附性能效果对比：
(1)等温吸附：
分别称取5mg的Fe3O4@SiO2@MMIPs及Fe3O4@SiO2@MNIPs，分散在4ml的不同浓度的CAT溶液(10.0-300.0μg/mL)，调节pH，平行3份，将混合物放入摇床，转速120rpm，30℃振摇2h。吸附结束后，外部磁场分离材料，HPLC测定上清液中CAT浓度。MMIPs对梓醇的吸附量Qe(mg/g)可通过下列公式(3)计算得出：
式中，Ce(ug/ml)为上清液中梓醇的游离浓度；C0(mg/ml)为溶剂中梓醇的初始浓度；V(ml)为梓醇溶液的体积；m(mg)为MMIPs(或MNIPs)的重量。
在pH＝9.0和温度为30℃下进行静态实验来评估MMIPs的结合能力。图5为MMIPs和MNIPs对梓醇的静态吸附等温线。
MMIPs与梓醇的结合程度随着模板分子起始浓度的增长而逐渐增加。当模板分子浓度为150μg/mL时，MMIPs达到吸附饱和，吸附量为51.92μg/mg，而MNIPs对梓醇的吸附量为26.32μg/mg，远低于MMIPs。这一现象是由于梓醇经过洗脱后，保留聚合物的空间和结构，即“印迹空穴”，当与模板分子相似的结构进入“空穴”后会产生特异性结合。而MNIPs在合成过程中不含有与模板分子结构相似的“空穴。
(2)动态吸附：
分别称取5mg的MMIPs及MNIPs，分散在4ml的CAT溶液(150μg/mL)中，调节pH，转速120rpm，在30℃下振摇2h。在一定时间间隔内(0～200min)，用磁铁分离MMIPs及MNIPs，收集上清液，HPLC测定上清液中CAT浓度。
图6为动力学吸附曲线，在0-120min时MMIPs吸附量随着时间变化而快速上升，证明MMIPs表面存在着多孔、均一的分子印迹聚合物层。120min后，吸附速率逐渐变慢，最终达到吸附平衡。相比之下，MNIPs的吸附能力明显低于MMIPs，MNIPs对CAT的吸附属于非特异性吸附。而MMIPs中存在大量的印迹位点，引发特异性吸附，从而产生更高的吸附能力。因此，MMIPs中存在CAT互补空腔结构是特异性吸附的关键。
(3)吸附选择性：
选择益母草苷、桃叶珊瑚苷、槲皮素作为结构类似物，以评价聚合物的选择性。将5mg的MMIPs和MNIPs分别分散在浓度为150μg/ml的梓醇和益母草苷、桃叶珊瑚苷、槲皮素溶液中，调节pH，转速120rpm，在30℃下振摇2h，吸附结束后外部磁场分离材料，HPLC测定上清液中CAT和类似化合物的浓度，并采用公式(4)评估特异性吸附能力。
Qe(ug/mg)为药物的平衡吸附量，Ce(ug/mL)为平衡时的药物浓度，KMMIP(L/g)为MMIPs的分配系数，KMNIP(L/g)为NIP的分配系数，IFMMIP为CAT的印迹因子，IF为其余三种药物的印迹因子。
如图7所示，MMIPs对梓醇、益母草苷、桃叶珊瑚苷、槲皮素的吸附量为43.36μg/mg，14.59μg/mg，15.13μg/mg和12.96μg/mg，与之相对应的印迹因子分别为2.41(CAT)、1.21(ajugol)、1.1(aucubin)和1.35(quercetin)，其中MMIPs对梓醇的吸附能力和印迹因子显著高于其他化合物，证明了梓醇和MMIPs之间产生了强烈的相互作用，在MMIPs表面形成了与梓醇具有形状、大小和官能团相匹配的分子印迹腔，通过与其互补的特异性识别位点和高亲和力，从而使MMIPs对梓醇的吸附能力较强。
(4)吸附温度：
分别称取5.0mg的MMIPs和MNIPs，分散在浓度150μg/ml(4ml)的梓醇溶液中，然后分别在10、15、20、25、30、35、40、45℃条件下振摇吸附2h，每种温度平行3份。吸附结束后，加外部磁场分离材料后，用HPLC测定上清液中游离梓醇的浓度。
如图8所示，随着温度上升，MMIPs对CAT的吸附量逐渐增加，在温度为30℃时，吸附量最大。当温度超过30℃时，吸附量开始下降。因此选择30℃作为最佳吸附温度。
(5)吸附pH：
分别称取5.0mg的MMIPs及MNIPs，分散在4ml不同pH值(3.0-12.0)的梓醇溶液(150.0μg/mL)中，每个pH平行3份，将混合物放入摇床，转速120rpm，30℃振摇2h。吸附结束后外部磁场分离材料，用HPLC测定上清液中梓醇浓度。通过比对不同pH下的单位吸附量，得到最佳吸附pH。
图9梓醇的吸附量随着pH值范围从2.0增加到9.0而增加，在pH＝9.0时达到最大值，然后又随着pH值的持续增加而降低。根据上述结果，选择pH为9.0，温度为30℃的优化吸附条件，重新结合梓醇。
实施例3、
本实施例提供的一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物在提取地黄中梓醇的应用，包括以下步骤：
(1)地黄提取液的制备：
取地黄切成边长约10mm的小块，经80℃减压干燥24小时后，磨成粗粉，精密称取1.0g粗粉加入到25ml体积浓度25％的甲醇中，超声提取1小时，冷却，再称定重量，用体积浓度25％的甲醇补足减失的重量，摇匀，离心取上清液，采用HPLC测得供试液中CAT的浓度；
(2)固相萃取过程：
取1ml稀释后的地黄提取液加入本发明提供的梓醇磁性表面分子印迹聚合物，混合物在30℃、120rpm摇晃吸附120min，用磁铁将材料从溶液分离，得到的梓醇磁性表面分子印迹聚合物先用l ml超纯水清洗，清除非特异性杂志，再用300μl洗脱液进行超声洗脱1次，洗脱10min，得到药材吸附后的材料洗脱液；所述的洗脱液为甲醇：乙酸体积比9：1混合液。可根据需要重复步骤(2)直至地黄提取液中检测不到CAT的浓度。
洗脱条件的优化：
选用不同的洗脱时间(5、10、15min)、洗脱液比例(甲醇：乙酸＝9：1、8：2、7：3)、洗脱液体积(150、300、450ml)和洗脱次数(1、2、3次)分别对MMIPs进行洗脱程序，采用四因素、三水平正交实验设计L9(34)来探索各因素的最佳组合，如表2所示。因此选择用甲醇与乙酸溶剂比为9：1，洗脱溶剂体积为300μL，洗脱时间为10min，洗脱次数为1，为理论优化的洗脱条件。通过三次验证实验，三种回收率分别为99.95％、102％和104％。结果表明，优化后的洗脱条件具有稳定的、较高的回收率。
表2正交设计及实验结果
采用优化后的条件对地黄提取液进行萃取及洗脱，如图10所示，为地黄原溶液(a)、洗脱液(b)、洗脱后的提取液(c)的色谱图，可知，经磁固相萃取技术后，洗脱液(b)几乎没有杂质峰干扰，初步实现了分离效果，达到了富集目标化合物CAT的预期目标，可用于地黄提取物中梓醇的分离纯化。本实验进一步证明了本发明磁性表面分子印迹聚合物的成功，同时也说明此方法适用于中药地黄中梓醇的分离、富集。
实施例4、
本实施例提供的一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物在生物血样中梓醇检测的应用，包括以下步骤：
向待检测生物样品溶液中加入本发明提供的一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物，在pH＝9、温度30℃下，振摇吸附120min；吸附结束后用甲醇：乙酸体积比9：1的洗脱液洗脱3次，洗脱时间不少于20min，得到的洗脱液于氮吹仪60℃下吹干；吹干后，流动相复溶进行HPLC分析。
具体实验操作及效果如下：
(1)标准含药血清的制备：
取空白血清100ul于离心管中，加入10μl对照品溶液浓度分别为30、60、90、120、150、180μg/ml的标准含药血清，进行HPLC分析，得到各浓度下梓醇的峰面积，以此峰面积对各个浓度进行线性回归得标准含药血清的线性方程。
空白含药血清经过处理进HPLC分析得到的标准方程为y＝4.4319x+11.834，R2值为0.9953，表现出良好的线性关系。血样检测限及定量限分别为1.7和5.8ng/ml，回收率在90％以上。
(2)响应面试验设计：
采用Design-Expert 12软件进行响应面分析，优化洗脱条件，以洗脱时间、洗脱次数、洗脱体积3个因素为自变量，梓醇回收率为响应值，采用Box-BehnkenDesign(BBD响应面法)对血清进行3因素3水平试验，在三个水平(-1、0、1)条件下优化洗脱时间(A)、洗脱次数(B)、洗脱液体积(C)三个因素优化，共包括17组试验方案，每组试验平行3次。
血样中梓醇的洗脱条件优化结果如表3所示。A、B、A2、B2、C2、BC、AC都是显著项，其中C2的P值小于0.0001，呈极显著水平。根据模型计算出的洗脱条件是采用8.45ml洗脱液，洗脱3次，洗脱时间为20.87min时，洗脱效果最佳。
表3血清响应面结果表
(3)血清样品的处理：
取空白血清100μl加入10μl对照品溶液，混匀后加入甲醇390μl，涡旋30s，静置30min，离心(12000r·min-1，15min)，取上清液，加入材料5.0mg，在pH＝9，温度30℃下，振摇吸附2h。吸附结束后，用8.45μL洗脱液进行洗脱3次，洗脱时间20.87min，得到的洗脱液于氮吹仪60℃下吹干，吹干后，流动相复溶进行HPLC分析。
图11(a)为梓醇标准品色谱图、(b)为从MISPE柱中萃取后的洗脱溶液色谱图、(c)为血清洗加标准品的色谱图、(d)为空白血清色谱图，由图11可知，以本发明中制备的MMIPs为吸附剂的磁性固相萃取技术联用HPLC且对目标分析物分离情况良好。
Claims (5)
1.一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将梓醇和功能单体甲基丙烯酰胺溶解于二甲基亚砜，室温下搅拌后，得到混合液；
（2）将1-10g Fe3O4@SiO2加入步骤（1）的混合液中，超声处理后，得到预聚合液；
（3）将交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯和10-200mg引发剂偶氮二异丁腈加入到步骤（2）的预聚合液混合均匀后，在氮气保护下水浴加热65-70 ℃，搅拌12-24 h，得到聚合液；梓醇、甲基丙烯酰胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯和二甲基亚砜的摩尔比为1：5 ：5：90；
（4）反应完成后，通过外磁场分离聚合液，并用甲醇:乙酸洗脱液、纯水洗涤去除模板分子梓醇，直至梓醇不能被HPLC检测到为止；
（5）洗涤后溶液真空干燥，得到梓醇磁性表面分子印迹聚合物，所述的梓醇磁性表面分子印迹聚合物具有夹心结构的球形微球形态，由四氧化三铁核、二氧化硅中间层和厚度为20 nm的壳组成，表面形成了与梓醇具有形状、大小和官能团相匹配的分子印迹腔，通过与其互补的特异性识别位点和高亲和力，对于梓醇具有特异性吸附能力，吸附能力达到49.60mg/mg，回收率达到99.20%。
2.根据权利要求1所述的一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中Fe3O4@SiO2的制备方法如下：
a) Fe3O4纳米颗粒的合成
FeCl3·6H2O溶液和FeSO4·4H2O溶液按照摩尔比2：1，放置于三颈烧瓶中，加入去离子水搅拌溶解，加入体积浓度25 %的氨水，直至溶液由橙红色变为黑色，在氮气保护下水浴加热75 ℃搅拌2-3 h；使用磁倾析法将合成的Fe3O4纳米粒子从反应体系中分离，用去离子水、无水乙醇洗涤至少3次，至上清液澄清，洗涤完毕后在60-70 ℃下干燥，即得Fe3O4纳米颗粒；
b) Fe3O4@SiO2纳米颗粒的合成
取0.1-2g Fe3O4纳米颗粒分散在无水乙醇和去离子水的混合溶液中，乙醇和去离子水的体积比为5:1，加入氨水，使溶液pH为碱性，缓慢滴入四乙氧基硅烷，在室温下连续搅拌反应12h；所得到的微球用无水乙醇和超纯水洗涤后，真空干燥，即得Fe3O4@SiO2纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：步骤（4）中甲醇:乙酸洗脱液的甲醇与乙酸的体积比为9:1。
4.一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物，其特征在于，由权利要求1-3任意一种制备方法制得。
5.一种从地黄中提取梓醇的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）地黄提取液的制备：
取地黄切成小块，经80 ℃减压干燥24小时后，磨成粗粉，取粗粉加入到体积浓度25%的甲醇中，粗粉与甲醇的质量体积比为1:25，单位为g：mL；超声提取1-2小时，冷却，再称定重量，用体积浓度25%的甲醇补足减失的重量，摇匀，离心取上清液，采用HPLC测得供试液中CAT的浓度；
（2）固相萃取过程：
取稀释后的地黄提取液加入梓醇磁性表面分子印迹聚合物，混合物在30 °C摇晃吸附120 -150min，用磁铁将材料从溶液分离，得到的梓醇磁性表面分子印迹聚合物先用超纯水清洗，清除非特异性杂质，再用洗脱液进行超声洗脱1-3次，洗脱10 min，得到药材吸附后的材料洗脱液；所述的洗脱液为甲醇：乙酸体积比9：1混合液，重复步骤（2）直至地黄提取液中检测不到CAT的浓度；所述的梓醇磁性表面分子印迹聚合物为权利要求1-3任意一种制备方法制得的梓醇磁性表面分子印迹聚合物或权利要求4所述的一种梓醇磁性表面分子印迹聚合物。
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