CN110483599A - 一种番荔枝叶中黄酮类成分的分离方法 - Google Patents

一种番荔枝叶中黄酮类成分的分离方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及天然化合物提取领域，具体涉及一种番荔枝叶中黄酮类成分的分离方法。番荔枝叶的乙醇提取物经除醇、石油醚脱脂、正丁醇萃取得到粗黄酮提取物，将粗黄酮提取物通过两相溶剂分配得到黄酮总样品。通过高度逆流色谱分离纯化二次黄酮提取物得到槲皮素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、山奈酚‑3‑O‑洋槐糖苷、山柰酚‑3‑O‑芸香糖苷、槲皮素‑3‑O‑洋槐糖苷和芦丁，纯度达到95％以上。本公开还提供了一种通过线性洗脱分离黄酮类成分的方法，同样能够获得高纯度单体，具有良好的推广意义。

Description

一种番荔枝叶中黄酮类成分的分离方法
技术领域
本公开涉及天然化合物提取领域，具体涉及一种基于高速逆流色谱从番荔枝叶中提取五种高纯度黄酮类单体的方法。
背景技术
番荔枝(学名：Annonasquamosa Linn.)番荔枝科、番荔枝属落叶小乔木；树皮薄，灰白色，多分枝。中国浙江、台湾、福建、广东、广西、海南和云南等省区均有栽培。原产热带美洲；现全球热带地区有栽培。果食用，外形酷似荔枝，故名“番荔枝”，为热带地区著名水果。番荔枝叶，为一类药食同源类植物药，在我国常被制成保健茶，性味苦、涩，性微寒。归大肠、心经。具有收敛涩肠，清热解毒的功效。同时具有抗癌、抗动脉粥样硬化、抗炎等作用。在番荔枝的原产地，番荔枝叶通常和黑胡椒搭配作为治疗糖尿病的辅助药物治疗糖尿病。
本领域中公开了较多基于高速逆流色谱方法从天然植物中提取分离黄酮类成分的技术方案，例如李玉兰等从黄芩中对总黄酮进行提取并通过高速逆流色谱进行分离；孙印石等通过高速逆流色谱从陈皮中分离黄酮类化合物。发明人发现，传统的番荔枝叶中黄酮类成分的分离方法为反相色谱、硅胶柱色谱和Sephadex LH-20等，费时费力、污染环境、样品纯度低，具有局限性，而且反复柱层析对样品有不可逆性吸附作用，分离得到黄酮类化合物单体制备效率低、成本较高，难以发展成为制备量大的分离技术。
发明内容
番荔枝叶中含有丰富的黄酮类成分，有望作为良好的黄酮化合物提取来源。现有技术中关于从番荔枝叶中提取黄酮类化合物的研究还较为空白。针对该研究现状，本公开目的在于提供基于高速逆流色谱从番荔枝叶中提取高纯度黄酮类单体化合物的方法。经验证，本公开分离方法提供的单体化合物表现出良好的抗氧化及体外降血糖活性。本公开分离方法应用于降血糖、抗氧化药剂的制备，可以一次获得多种高纯度的单体，显著降低后续加工难度，具有良好的生产推广意义。
为了实现以上技术效果，本公开提供以下方案：
本公开第一方面，提供一种基于高速逆流色谱法从番荔枝叶中分离黄酮类单体的方法，其特征在于，所述黄酮类单体为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷和芦丁。
槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷，也称为异槲皮苷，王先荣等人在其专利公开了异槲皮苷在制备治疗心肌缺氧、缺血疾病药物、治疗脑缺氧、缺血疾病药物、以及在制备抗血栓药物中的应用。现有技术中有报道从植物中提取异槲皮苷的方法，但成本高，收率较低。
芦丁，又称芸香苷，可作为抗氧化剂和营养增强剂添加至食品和化妆品中，还具有抗炎及减少血管脆性的作用，可用于防治脑溢血、高血压、视网膜出血等疾病。
山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷等也具有类似的抗氧化及防治心血管疾病的功效。依据本公开的分离方法，可一次性获取上述五种单体物质，纯度达到95％以上，作为食品添加剂、药品及化妆品原料可省略提纯步骤，节省制备工艺。
优选的，该分离方法包括加工番荔枝叶获取黄酮总样品并通过高速逆流色谱对黄酮总样品进行分离，所述通过高速逆流色谱对黄酮总样品进行分离为循环逆流色谱模式分离或线性洗脱分离。
更进一步的，所述循环逆流色谱两相溶剂体系A为乙酸乙酯/正丁醇/水。
更进一步的，所述线性洗脱分离的两相溶剂体系B为水饱和的乙酸乙酯/正丁醇。
本公开第二方面，第一方面所述分离方法得到的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷和芦丁单体。
本公开第三方面，提供第一方面所述分离方法及第二方面所述单体在抗氧化、抗心血管疾病、降血糖及止咳药剂制备中的应用。
本公开方法制备的黄酮单体具有良好的纯度及收率，作为化工原料在后续加工过程中可以节省许多提纯步骤，节约成本。
本公开的有益效果：
1.现有技术中针对番荔枝叶中黄酮类成分分离的方法包括反相色谱、硅胶柱色谱分离等，获取的样品纯度低，制备效率差。番荔枝叶中黄酮类成分含量占首位，有望作为一种良好黄酮提取来源，本公开提供了一种基于高逆流色谱法对番荔枝叶中黄酮成分进行提取的方法，填补了现有技术中的这一空白。
2.本公开方法分离得到的槲皮素-3-O-洋槐糖苷、芦丁、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷五种单体物质，纯度超过95％。本公开制备方法能够分离得到五种高纯度的黄酮类单体物质，生产工艺简单，分离得到的单体化合物具有良好的抗氧化及体外降血糖活性，可为相关食品、化妆品及药品的制备提供了优质的生产原料。
3.本公开中提供了两种通过高速逆流色谱对黄酮粗提取进行分离的方法，均可获得纯度为95％以上的黄酮类单体，实际生产过程中，技术人员可依据生产需要对生产方法进行选择。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本公开的不当限定。
图1为本公开的工艺流程图；
图2为实施例1中番荔枝叶高速逆流色谱循环分离的示意图；
图3为实施例1中番荔枝叶黄酮总样品分离的高速逆流色谱图；
图4为实施例1中番荔枝叶峰1和2的循环高速逆流色谱分离图；
图5为实施例1中黄酮总样品和逆流色谱分离单体的高效液相色谱图；
图6为实施例2中黄酮总样品线性梯度1高速逆流色谱法分离的示意图(50mg上样量，2mL/min洗脱流速)；
图7为实施例2中黄酮总样品线性梯度2高速逆流色谱法分离的示意图(50mg上样量，2mL/min洗脱流速)；
图8为实施例2中黄酮总样品线性梯度3高速逆流色谱法分离的示意图(50mg上样量，2mL/min洗脱流速)；
图9为实施例2中黄酮总样品线性梯度3高速逆流色谱法分离的示意图(50mg上样量，4mL/min洗脱流速)；
图10为实施例2中黄酮总样品总分离的高速逆流色谱图(150mg上样量，2mL/min洗脱流速)；
图11为实施例2中峰1和2的循环高速逆流色谱分离图(100mg上样量，2mL/min洗脱流速)；
图12为实施例2中峰1和2的循环高速逆流色谱分离图；
图13为实施例2中黄酮总样品和逆流色谱分离单体的高效液相色谱图；
其中，其中图13(a)为黄酮总样品高效液相色谱图；
图13(b)为峰3高效液相色谱图；
图13(c)为峰1高效液相色谱图；
图13(d)为峰2高效液相色谱图；
图13(e)为峰5高效液相色谱图；
图13(f)为峰4高效液相色谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中并未公开以番荔枝叶为原料制备黄酮类化合物的方法，为了解决如上的技术问题，本申请提出了基于高速逆流色谱仪分离番荔枝叶中黄酮类单体的方法。
本公开第一方面，提供一种基于高速逆流色谱法从番荔枝叶中分离黄酮类单体的方法，其特征在于，所述黄酮类单体为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷和芦丁。
优选的，该分离方法包括加工番荔枝叶获取黄酮总样品并通过高速逆流色谱对黄酮总样品进行分离。
一些实施例中，所述番荔枝叶的加工方法为：将番荔枝叶粉碎、加入醇溶液提取后浓缩除去有机溶剂，脱脂后再加入等比例的正丁醇萃取水相，将正丁醇萃取部分干燥制得一次粗黄酮样品；配置二次脱脂溶剂，将所述一次粗黄酮样品加入二次脱脂溶剂中脱脂，获得黄酮总样品。
一些实施例中，所述醇溶液为乙醇溶液，进一步的，为80～98％的乙醇溶液。进一步的，所述番荔枝粉末与乙醇溶液的加入比例为(1.5-3.5)kg：(4-6)L。
一些实施例中，所述脱脂采用等比例的石油醚萃取进行脱脂，保留水相。
一些实施例中，所述二次脱脂溶剂为石油醚/乙酸乙酯/甲醇/水体系。进一步的，所述石油醚/乙酸乙酯/甲醇/水的体积比为(4-6)：(4-6)：(1-3)：(7-9)。
进一步优选的，所述通过高速逆流色谱对黄酮总样品进行分离为循环逆流色谱模式分离或线性洗脱分离。
更进一步的，所述黄酮总样品通过高速逆流色谱分离的两相溶剂体系A为乙酸乙酯/正丁醇/水体系。
一些实施例中，所述两相溶剂体系A中乙酸乙酯/正丁醇/水的体积比为(3-5)：(0.5-1.5)：(4-6)。
一些实施例中，所述分离具体操作如下：
1)切换至分离模式，将两相溶剂A平衡好后进样；
2)待峰1与峰2的混合物即将从出口流出时，切换至收集模式，收集混合物；
3)切换至分离模式，依次接收峰4和峰5，峰3采用顶出模式，通过氮气吹出，收集峰3；其中，峰3、峰4、峰5分别为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷；
4)重新泵入两相溶剂体系A平衡好后，切换至循环模式，将峰1和峰2的混合物引入逆流色谱仪循环分离，切换至分离模式，依次接入峰1和2，峰1和峰2即为槲皮素-3-O-洋槐糖苷及芦丁。
一些实施例中，上述步骤4)中，峰1和峰2经过6-8次循环实现完全分离。
一些实施例中，上述高速逆流色谱仪柱体积为200-400mL，转速700-900转/min，上样量180-210mg，流速为1.8-2.2mL/min，检测波长254nm。
一些实施例中，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，转速800转/min。
更进一步的，所述线性洗脱分离的两相溶剂体系B为水饱和的乙酸乙酯/正丁醇，所述水饱和的乙酸乙酯作为固定相，正丁醇溶液作为流动相。
一些实施例中，所述线性梯度洗脱对黄酮总样品进行分离的操作步骤如下：泵入固定相，使色谱分离柱正转；从色谱仪螺旋管尾部泵入流动相，达到流体动力学平衡后进样，设定线性梯度洗脱方式进行分离，依次收集峰3、峰5、峰4及峰1和2的混合物，其中，峰3、峰4、峰5分别为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷；将峰1和2的混合物经循环逆流色谱分离，依次收集峰1和峰2；其中峰1和峰2即为槲皮素-3-O-洋槐糖苷及芦丁。
一些实施例中，所述峰1和2的混合物经循环逆流色谱分离的两相溶剂体系C为正丁醇/水，进一步的，所述正丁醇和水等体积混合；正丁醇为固定相，水为流动相。
一些实施例中，所述峰1和2的分离方法：泵入固定相，设定色谱分离柱正转，从色谱仪螺旋管头部泵入流动相，达到流体动力学平衡后将峰1和2的混合物注入色谱仪中，切换至循环模式，经10～15次实现峰1和2的分离。
本公开第二方面，提供第一方面所述分离方法在抗氧化药物、抗心血管疾病药物及止咳药物制备中的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本申请的技术方案。
实施例1
1.1样品提取
将干燥番荔枝叶(2kg)完全粉碎成粉末，用5L 95％乙醇回流提取2次，每次2h，然后将提取物使用真空过滤装置过滤。合并所有提取液并浓缩至无醇味，然后使用等比例的石油醚萃取，脱脂，再用等比例的正丁醇萃取水相2次，正丁醇萃取物减压浓缩，干燥，得浓缩物62g，即一次粗黄酮样品。一次粗黄酮样品进行二次脱脂，二次脱脂溶剂为石油醚/乙酸乙酯/甲醇/水(5:5:2:8,v/v)，下相减压浓缩，干燥，得黄酮总样品17.6g。
1.2应用在线收集和循环逆流色谱模式分离纯化黄酮类单体
使用在线收集和循环逆流色谱的分离方法，从黄酮总样品中成功分离出5种黄酮类单体化合物，逆流色谱分离图和示意图如图2-图4所示，通过增加两个六通阀和一个收集管，实现在线收集和循环逆流色谱模式的切换，具体分为4个操作步骤：
1)先将分离切换到如图2中的分离模式，逆流色谱两相溶剂体系乙酸乙酯/正丁醇/水(4:1:5，v/v)平衡好后进样；
2)待图3中峰1和2的混合物即将从出口流出时，切换六通阀2，切换至图2中收集模式，将混合物引入收集管；
3)切换六通阀2，进入分离模式，依次将峰4和峰5接收至收集管，将峰3采用顶出模式，采用氮气吹出，收集峰3；
4)重新泵入新的两相溶剂体系平衡好后，切换至图2中循环模式，将混合物引入逆流色谱仪循环分离，分离图见图4，又经过多次循环，切换至图2中分离模式，将峰1和2依次接入收集管。高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量200mg，转速800转/min，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0mL/min，检测波长254nm。
具体的操作步骤是：先按上述步骤1)，将两相溶剂体系乙酸乙酯/正丁醇/水(4:1:5，v/v)按上述溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，取200mg粗品，溶解于5mL上相和5mL下相中待用。采用半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800转/min时，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相，当达到流体动力学平衡后将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱，然后根据检测器紫外光谱图接收图3中组分。当分离进行到峰1和2的前沿，切换到图2中的收集模式，将混合物峰1和2引入收集管，待完全进入后切换至图2中分离模式，依次将峰4和峰5接收至收集管，将峰3采用顶出模式，采用氮气吹出，收集峰3。
重新泵入新的两相溶剂体系乙酸乙酯/正丁醇/水(4:1:5，v/v)平衡好后，切换至图2中循环模式，将收集管中的峰1和2的混合物引入逆流色谱仪，同时进行循环分离，分离图见图4，又经过6次循环，峰1和2实现完全分离，切换至图2中分离模式，将峰1和2依次接入收集管。最终分离得到峰1(9mg)，峰2(23mg)，峰3(5mg)，峰4(24mg)和峰5(49mg)五个高纯度单体，液相色谱检测纯度超过95％，见图5。
1.3分离得到的单体化合物结构鉴定
利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：Waters Symmetry C18column(5μm,4.6mm×250mm,i.d.,)，紫外检测波长254nm，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，流动相采用乙腈/0.5％乙酸溶液(16:84，v/v)。
结构鉴定：对分离得到的黄酮类成分单体应用Agilent 5973N质谱仪和Varian600MHz核磁共振波谱仪分别进行MS，NMR谱的测定，所得数据如下：
峰1，黄色粉末，ESI-MS m/z 609.1475[M-H]-.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:12.56(1H,brs,5-OH),7.65(1H,dd,J＝8.4,2.0Hz,6′-H),7.51(1H,d,J＝2.0Hz,2′-H),6.82(1H,d,J＝8.4Hz,5′-H),6.39(1H,d,J＝1.2Hz,8-H),6.19(1H,d,J＝1.2Hz,6-H),5.32(1H,d,J＝7.6Hz,1″-H),4.40(1H,brs,1″′-H),1.06(3H,d,J＝6.4Hz,6″′-H).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:177.6(C-4),164.4(C-7),161.5(C-5),156.7(C-9),156.6(C-2),148.7(C-4′),145.0(C-3′),133.7(C-3),122.2(C-6′),121.3(C-1′),116.2(C-5′),115.4(C-2′),104.1(C-10),98.9(C-6),93.8(C-8),102.2(C-1″),100.2(C-1″′),73.8(C-5″),73.3(C-3″),72.1(C-4″′),71.3(C-2″),70.9(C-3″′),70.7(C-2″′),68.5(C-4″),68.3(C-5″′),65.3(C-6″),18.2(C-6″′).通过文献比对，鉴定为槲皮素-3-O-洋槐糖苷。
峰2，黄色粉末，ESI-MS m/z 609.1475[M-H]-.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:12.57(1H,brs),7.54(1H,dd,J＝8.0,2.0Hz,H-6′),7.53(1H,d,J＝2.0Hz,H-2′),6.84(1H,d,J＝8.0Hz,H-5′),6.39(1H,d,J＝1.5Hz,H-8),6.20(1H,d,J＝1.5Hz,H-6),5.33(1H,d,J＝8.0Hz,H-1″),4.38(1H,brs,H-1″′),1.07(3H,d,J＝6Hz,H-6″′).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:177.4(C-4),164.1(C-7),161.3(C-5),156.7(C-9),156.5(C-2),148.5(C-4′),144.8(C-3′),133.3(C-3),121.7(C-6′),121.2(C-1′),116.3(C-5′),115.3(C-2′),104.0(C-10),101.2(C-1″),100.8(C-1″′),98.7(C-6),93.7(C-8),76.5(C-3″),75.9(C-5″),74.1(C-2″),71.9(C-4″′),70.6(C-3″′),70.4(C-4″),70.0(C-2″′),68.3(C-5″′),67.1(C-6″),17.8(C-6″′).通过文献比对，鉴定为芦丁。
峰3，黄色粉末，ESI-MS m/z 463.0804[M-H]-.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:12.63(1H,s),7.66(1H,d,J＝8.5Hz,H-6′),7.56(1H,brs,H-2′),6.3(1H,d,J＝1.5Hz,H-8),6.83(1H,d,J＝8.5Hz,H-5′),6.19(1H,d,J＝1.5Hz,H-6),5.45(1H,d,J＝7.0Hz,H-1″).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:177.8(C-4),164.2(C-7),161.6(C-5),156.8(C-2),156.5(C-9),149.0(C-4′),145.3(C-3′),133.7(C-3),122.0(C-6′),121.5(C-1′),116.6(C-5′),115.7(C-2′),104.2(C-10),101.4(C-1″),99.3(C-6),94.0(C-8),78.0(C-5″),77.0(C-3″),74.5(C-2″),70.4(C-4″),61.4(C-6″).通过文献比对，鉴定为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷
峰4，黄色粉末，ESI-MS m/z 593.1519[M-H]-.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:12.58(1H,s),10.22(1H,brs),8.06(2H,d,J＝8.9Hz,H-2′,H-6′),6.87(2H,d,J＝8.9Hz,H-5′,H-3′),6.44(1H,d,J＝2.0Hz,H-8),6.22(1H,d,J＝2.0Hz,H-6),5.33(1H,d,J＝7.6Hz,H-1″),4.40(1H,s,H-1″′),1.07(3H,d,J＝6.2Hz,H-6″′).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:177.9(C-4),164.7(C-7),161.7(C-5),160.5(C-4′),157.1(C-9),156.9(C-2),133.8(C-3),131.4(C-2′,6′),121.3(C-1′),115.5(C-3′,5′),104.4(C-10),102.5(C-1″),100.5(C-1″′),99.2(C-6),94.2(C-8),74.0(C-3″),73.5(C-5″),72.4(C-4″′),71.6(C-2″),71.1(C-3″′),70.9(C-2″′),68.7(C-4″),68.5(C-5″′),65.8(C-6″),18.4(C-6″′).通过文献比对，鉴定为山奈酚-3-O-洋槐糖苷
峰5，黄色粉末，ESI-MS m/z 593.1517[M-H]-.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:12.57(1H,s,5-OH),10.11(1H,s,4′-OH),7.99(2H,dd,J＝8.8Hz,H-2′,H-6′),6.88(2H,dd,J＝8.8Hz,H-3′,H-5′),6.42(1H,d,J＝2Hz,H-8),6.37(1H,d,J＝2Hz,H-6),5.31(1H,d,J＝7.2Hz,H-1″),4.38(1H,brs,H-1″′),0.98(3H,d,J＝6Hz,H-6″′).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:177.9(C-4),164.7(C-7),161.7(C-5),160.4(C-4′),157.3(C-9),157.0(C-2),133.7(C-3),131.3(C-2′,6′),121.3(C-1′),115.6(C-3′,5′),104.4(C-10),101.8(C-1″),101.2(C-1″′),99.2(C-6),94.2(C-8),76.9(C-3″),76.2(C-5″),74.7(C-2″),72.3(C-4″′),71.1(C-3″′),70.8(C-2″′),70.4(C-4″),68.7(C-5″′),67.4(C-6″),18.2(C-6″′).通过文献比对，鉴定为山柰酚-3-O-芸香糖苷。
实施例2
1.样品提取
将干燥番荔枝叶(2kg)完全粉碎成粉末，用5L 95％乙醇回流提取2次，每次2h，然后将提取物使用真空过滤装置过滤。合并所有提取液并浓缩至无醇味，然后使用等比例的石油醚萃取，脱脂，再用等比例的正丁醇萃取水相2次，正丁醇萃取物减压浓缩，干燥，得浓缩物并进行二次脱脂，所述二次脱脂溶剂系统为石油醚/乙酸乙酯/甲醇/水(5:5:2:8,v/v)，下相减压浓缩，干燥，得黄酮总样品。
2.1应用线性梯度高速逆流色谱法分离番荔枝叶总黄酮
具体的操作步骤是：采用半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成。先按固定相以30mL/min泵入高速逆流色谱仪分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800转/min时，设置流动相A(乙酸乙酯)流速为设定流速，采用从尾到头的方式开始泵流动相，当达到流体动力学平衡后将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱，开启紫外检测器，设置线性梯度高速逆流色谱法的梯度条件，进行高速逆流色谱分离。依次将峰3、峰5和峰4进行收集，以及峰1和2的混合物。将混合物减压浓缩，干燥，流动相溶解后进行循环逆流色谱分离。
图6为番荔枝叶线性梯度条件1的高速逆流色谱法分离示意图(50mg上样量，2mL/min洗脱流速)，梯度条件为0-20min，0-10％流动相B；20-60min，10-20％流动相B；60-300min，20-40％流动相B；在此条件下峰4和峰5分离不充分。
图7为番荔枝叶线性梯度条件2的高速逆流色谱法分离示意图(50mg上样量，2mL/min洗脱流速)，梯度条件为0-30min，0-10％流动相B；30-90min，10-12％流动相B；90-210min，12％流动相B；210-250min，12-30％流动相B；250-300min，30-35％流动相B；300-400min，35％流动相B。在此条件下，峰5和峰4实现了分离，但是峰1+2分离时间过久。
图8为番荔枝叶线性梯度条件3的高速逆流色谱法分离示意图(50mg上样量，2mL/min洗脱流速)，梯度条件为0-30min，0-10％流动相B；30-90min，10-12％流动相B；90-210min，12％流动相B；210-250min，12-30％流动相B；250-260min，30-50％流动相B；260-350min，50％流动相B。增大了后半程的洗脱能力，峰5和峰4实现了分离，但是峰1+2分离时间合适。
图9为番荔枝叶线性梯度条件3的高速逆流色谱法分离示意图(50mg上样量，4mL/min洗脱流速)，在此梯度下，增大了分离流速，流失严重，4mL/min不适合作为该体系的分离流速；
图10为番荔枝叶线性梯度条件3的高速逆流色谱法分离示意图(150mg上样量，2mL/min洗脱流速)；增大了上样量至150mg，固定相流失严重，分离载样量过大，不适合分离。
图11为番荔枝叶化合物1和2的循环高速逆流色谱分离图(100mg上样量，2mL/min洗脱流速)；增大了上样量至100mg，固定相流失不严重，分离载样量合适，适合分离，为最优的条件。
2.2循环逆流色谱模式分离纯化黄酮类单体
图12为番荔枝叶化合物1和2的循环高速逆流色谱分离图，上相为固定相，下相为流动相，经过13次循环，实现了峰1和峰2的分离。
具体的操作步骤是：采用半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成。两相溶剂体系为正丁醇/水(1:1，v/v)，上相为固定相，下相为流动相。先按固定相以30mL/min泵入高速逆流色谱仪分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800转/min时，设置流动相流速为2mL/min，采用从头到尾的方式开始泵流动相，当达到流体动力学平衡后将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱，开启紫外检测器，切换至循环模式，根据紫外检测器的分离结果，经过13次循环，实现了峰1和2实现完全分离，切换至分离模式，将峰1和2依次接入收集管。最终分离得到峰1(4.8mg)，峰2(12.1mg)，峰3(4.2mg)，峰4(9.6mg)和峰5(24.6mg)五个高纯度单体，经液相色谱检测纯度超过95％，见图13。
利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：Waters Symmetry C18column(5μm,4.6mm×250mm,i.d.,)，紫外检测波长254nm，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，流动相采用乙腈/0.5％乙酸溶液(16:84，v/v)。
结构鉴定：对分离得到的黄酮类成分单体应用Agilent 5973N质谱仪和Varian600MHz核磁共振波谱仪分别进行MS，NMR谱的测定，与实施例1中峰1-5结构一致。
实施例3
一、方法
1.抗氧化活性的评估方法
将DPPH(2.5mg)溶解在100mL乙醇中，制成浓度为25μg/mL的标准溶液。连续稀释用于提供浓度为0,5,10,15,20和25μg/mL的乙醇标准溶液。通过紫外分光光度法在517nm处测量六种溶液的吸光度值以制备标准曲线。将DPPH(2.0mg)溶解在100mL乙醇中，制成浓度为20μg/mL的标准溶液。制备含有不同浓度的L-抗坏血酸(阳性对照)，粗提物和单体化合物的溶液作为测试样品。将3mL标准溶液与2mL来自样品组的溶液一起加入10mL比色管中。对于对照组，将3mL乙醇与2mL样品溶液一起加入10mL比色管中，同时使用3mL含有2mL乙醇的标准溶液作为空白组。对于在37℃下孵育30分钟的每种混合物，通过紫外分光光度法测定517nm处的吸光度。测试每种浓度三次，并将结果计算为平均值。抗氧化活性计算为DPPH自由基消除的百分比如下：
清除率(％)＝[A空白-(A样品-A对照)]/A空白×100％
其中A空白，A对照和A样品分别是不同浓度的空白、对照和样品溶液的吸光度。
2.对HepG2细胞的细胞毒性测定
将HepG2细胞在补充有青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)和10％FBS的DMEM中培养。将细胞在37℃和5％CO2下孵育。胰蛋白酶溶液用于在对数生长期消化HepG2细胞。然后用培养基将细胞密度调节至5×104/mL。将细胞以100μL/孔的体积在37℃和5％CO2下接种在96孔细胞培养板中。接种的细胞分别用适当浓度的提取物和纯化合物处理24小时。吸光度的波长为570nm，以确定细胞活力。组分对细胞活力的影响计算如下：细胞活力(％)＝A570nm处理样品/A570nm未处理样品×100％。
3.HepG2细胞的葡萄糖消耗测定
将100微升细胞悬浮液(5×104/mL)接种到96孔细胞培养板中，并在37℃和5％CO2下培养。将细胞培养24小时后，吸出旧培养基，用PBS洗涤孔2次，然后将含有胰岛素溶液的无血清DMEM培养基同步加入细胞中。在36小时培养后吸出上清液，并加入含有无血清药物或无药物的DMEM吸出。实验分为三组：成分处理组(15-240μg/mL)，空白对照组和二甲双胍(Met)组(1×10-3mmol/L)，胰岛素组(10-5mmol/L)。根据葡萄糖测试试剂盒在培养24小时后在50 5nm处检测葡萄糖含量。葡萄糖消耗率按下式计算：ΔGC＝(空白孔的葡萄糖浓度-接种细胞的葡萄糖浓度)。
2.11统计分析
所有结果均表示为平均值±SD。使用SPSS软件通过单因素方差分析测试统计学显着性。p值小于0.05被认为具有统计学意义。
二、结果
1.抗氧化结果
如表1所示，发现粗提物和分离的化合物对DPPH的抗氧化活性为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷>粗黄酮提取物>粗提物>槲皮素-3-O-洋槐糖苷>芦丁>山奈酚-3-O-芸香糖苷>山奈酚-3-O-洋槐糖苷。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的IC50值为69.13±2.03μg/mL，具有最高的抗氧化能力。山奈酚-3-O-洋槐糖苷和山奈酚-3-O-芸香糖苷的抗氧化能力相对较弱，IC50值为191.67±5.09和188.59±4.14μg/mL。
表1组分的抗氧化活性和不同浓度组分线性范围
2.体外低血糖活性
表2显示了不同浓度的组分对细胞活力的影响。结果显示，测试浓度15-240μg/mL对细胞活力几乎没有影响。结果表明，高浓度的番荔枝叶各成分对HepG2细胞具有良好的安全性。
表3结果表明，与胰岛素组(模型组)相比，粗提取物和纯化合物显着增加HepG2细胞的葡萄糖摄取。同时，随着组分浓度的增加，HepG2细胞葡萄糖摄取率的趋势增加。它表明测试的组分具有潜在的低血糖活性。粗黄酮提取物的葡萄糖摄取具有比粗提取物更好的降血糖活性。它表明去除非类黄酮成分可能起到丰富的作用，并有助于改善低血糖活性。与抗氧化活性相比，化合物1-3具有比化合物4和5更好的降血糖活性。
表2不同浓度组分对HepG2细胞的毒性
表3组分对HepG2细胞葡萄糖摄取的不同浓度影响
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于高速逆流色谱法从番荔枝叶中分离黄酮类单体的方法，其特征在于，所述黄酮类单体为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷和芦丁。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离方法包括加工番荔枝叶获取黄酮总样品并通过高速逆流色谱对黄酮总样品进行分离，所述通过高速逆流色谱对黄酮总样品进行分离为循环逆流色谱模式分离或线性洗脱分离。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述番荔枝叶的加工方法为：将番荔枝叶粉碎、加入醇溶液提取后浓缩除去有机溶剂，脱脂后再加入等比例的正丁醇萃取水相，将正丁醇萃取部分干燥制得一次粗黄酮样品；配置二次脱脂溶剂，将所述一次粗黄酮样品加入二次脱脂溶剂中脱脂，获得黄酮总样品。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述循环逆流色谱两相溶剂体系A为乙酸乙酯/正丁醇/水，优选的，所述两相溶剂体系A中乙酸乙酯/正丁醇/水的体积比为(3-5)：(0.5-1.5)：(4-6)；或所述线性洗脱分离的两相溶剂体系B为水饱和的乙酸乙酯/正丁醇，所述水饱和的乙酸乙酯作为固定相，正丁醇溶液作为流动相。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述分离具体操作如下：
1)切换至分离模式，将两相溶剂A平衡好后进样；
2)待峰1与峰2的混合物即将从出口流出时，切换至收集模式，收集混合物；
3)切换至分离模式，依次接收峰4和峰5，峰3采用顶出模式，通过氮气吹出，收集峰3；其中，峰3、峰4、峰5分别为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷；
4)重新泵入两相溶剂体系A平衡好后，切换至循环模式，将峰1和峰2的混合物引入逆流色谱仪循环分离，切换至分离模式，依次接入峰1和2，峰1和峰2即为槲皮素-3-O-洋槐糖苷及芦丁。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，峰1和峰2经过6-8次循环实现完全分离。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述高速逆流色谱仪柱体积为200-400mL，转速700-900转/min，上样量180-210mg，流速为1.8-2.2mL/min，检测波长254nm。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述线性梯度洗脱对黄酮总样品进行分离的操作步骤如下：泵入固定相，使色谱分离柱正转；从色谱仪螺旋管尾部泵入流动相，达到流体动力学平衡后进样，设定线性梯度洗脱方式进行分离，依次收集峰3、峰5、峰4及峰1和2的混合物，其中，峰3、峰4、峰5分别为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷；将峰1和2的混合物经循环逆流色谱分离，依次收集峰1和峰2；其中峰1和峰2即为槲皮素-3-O-洋槐糖苷及芦丁；优选的，所述峰1和2的分离方法：泵入固定相，设定色谱分离柱正转，从色谱仪螺旋管头部泵入流动相，达到流体动力学平衡后将峰1和2的混合物注入色谱仪中，切换至循环模式，经10～15次实现峰1和2的分离。
9.权利要求1-8任一项所述的分离方法得到的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷和芦丁。
10.权利要求1-8任一项所述的分离方法及权利要求9所述单体在抗氧化、抗心血管疾病、降血糖及止咳药剂制备中的应用。
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