CN110272459A - 新疆芍药中两种新化合物及其抗氧化活性部位 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域。本发明涉及新疆芍药中两种新化合物及其抗氧化活性部位，两种新化合物的化学结构如式(I)、(II)所示。新疆芍药80％乙醇浸膏分别用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取得各部位，正丁醇部位经大孔树脂柱分离得各流分，其中水部位经硅胶柱色谱、MCI柱色谱、反相ODS柱色谱、Sephadex LH‑20等多种分离方法，分离出两种新化合物(I)和(II)；本发明还涉及一种同时测定新疆芍药中白芍苷R1、芍药苷、没食子酰芍药苷、氧化芍药苷、异香草酸、苯甲酸、没食子酸、没食子酸甲酯、1，2，3，4，6‑五没食子酰葡萄糖9种化合物含量的方法；并经DPPH试验表明新疆芍药在抗氧化方面具有应用前景。

Description

新疆芍药中两种新化合物及其抗氧化活性部位
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地，涉及新疆芍药中两种新的化学成分及其分离制备方法；本发明还涉及中药材及其制剂质量控制技术领域，涉及同时测定新疆芍药中白芍苷R1、芍药苷、没食子酰芍药苷、氧化芍药苷、异香草酸、苯甲酸、没食子酸、没食子酸甲酯、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖9种化合物的含量；以及新疆芍药在抗氧化及其相关方面的应用前景。
背景技术
新疆芍药(Paeonia anomala subsp.anomala)，为芍药科Paeoniaceae芍药属Paeonia药用植物，该植物为多年生草本，药用部位为根，分布于阿尔泰山区。该植物资源丰富，且为野生，在疆内维吾尔医、中医作赤芍用。具有活血化瘀、解毒消肿的功效，治疗月经不调，痛经，淤血腹痛等。研究表明芍药属植物除具有抗癌抗肿瘤、抗炎、神经保护等作用，还具有抗氧化活性，有较大的开发前景，符合国家倡导的大健康主题。
新疆芍药的化学成分复杂多样，主要包括单萜及单萜苷类、三萜及甾体类、酚类及单宁类等，对新疆芍药单帖及单帖苷类部分研究较多，为了彻底了解新疆芍药的活性成分，对新疆芍药中新化合物的分离研究十分必要；新疆芍药化学成分中芍药苷含量最大，药典中也以芍药苷作为其同属的赤芍、白芍两种药材含量测定的检测成分，而这种仅以一种成分作为检测指标的方法不够全面，因此建立同时、多种、快捷的成分检测方法，对新疆芍药及其制剂的质量控制具有重要意义。
发明内容
(1)本发明提供了从新疆芍药中提取分离得到的两种新化合物及其提取分离方法，其化学结构式如式(D、式(II)所示：
化学名称为：2-O-β-D-glucopyranosyl-3-hydroxymethyl-5-(prop-1-en-2-y1)cyclohexanone
化学名称为：9-O-[β-xylopyranosyl(1″→6′)-β-glucopyranosyl]-benzylbenzoate
本发明提供的一种新疆芍药中新化合物提取分离的方法，包括以下步骤：
1)取新疆芍药的干燥药材10kg，粉碎，用浓度为80％的乙醇加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收得乙醇浸膏；
2)将步骤1)中所得浸膏经水悬浮后依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇各萃取3次，回收溶剂得各部位浸膏；
3)将步骤2)中正丁醇部位浸膏通过D101型大孔吸附树脂柱色谱分离，用乙醇-水以体积比0∶1～1∶0进行梯度洗脱，分别得到水部位、30％乙乙醇部位、50％乙醇部位、70％乙醇部位和纯乙醇部位共5个组分，分别减压浓缩至干，得浸膏备用；
4)将步骤3)中水部位经过硅胶柱色谱分离、MCI柱色谱分离、反相ODS柱色谱分离、凝胶Sephadex LH-20柱色谱分离等方法，从中得到源于新疆芍药的两种新化合物(I)和(II)。
(2)本发明提供了一种同时测定新疆芍药中9种化合物含量的方法，该方法提高了检测效率，操作简单，具有很大的应用价值。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
1)标准品溶液制备：分别称取白芍苷R1、芍药苷、没食子酰芍药苷、氧化芍药苷、异香草酸、苯甲酸、没食子酸、没食子酸甲酯、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖对照品适量，制成对照品储备液；
2)供试品溶液制备：取新疆芍药粉末500mg，20mL甲醇超声提取，滤过，即得；
3)新疆芍药中9种化合物含量测定标准曲线的建立：C18色谱柱；流动相乙腈(A)和0.1％甲酸水(B)，洗脱条件：0～15min，8％～23％A；15～35min，23％～39％A；流速0.8mL/min；柱温30℃；检测波长230nm；进样量10μL；标准品溶液稀释成不同浓度，建立标准曲线，计算每个化合物线性回归方程；
4)样品溶液中化合物的含量测定：按色谱条件对制备的样品溶液进行测定，利用线性回归方程，计算样品中9种化合物的含量。
(3)本发明通过测定新疆芍药提取液清除DPPH自由基的活性，表明其在抗氧化及其相关方面具有应用前景。
附图说明
图1为新疆芍药中9种成分混合标准品色谱图，图中，1-没食子酸，2-氧化芍药苷，3-芍药苷，4-没食子酸甲酯，5-没食子酰芍药苷，6-白芍苷R1，7-1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖，8-苯甲酸，9-异香草酸；
图2为新疆芍药提取液供试品色谱图；
图3为新疆芍药乙醇提取液、甲醇提取液清除DPPH自由基活性效果图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步介绍本发明，但本发明不仅限于下述实施例，可以预见本领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。
实施例1
从新疆芍药中提取分离得到的两种新化合物，其化学结构式如式(I)、式(II)所示：
化学名称为：2-O-β-D-glucopyranosyl-3-hydroxymethyl-5-(prop-1-en-2-yl)cyclohexanone
化学名称为：9-O-[β-xylopyranosyl(1″→6′)-β-glucopyranosyl]-benzylbenzoate
所述的两种新化合物的分离制备方法，包括以下步骤：
取新疆芍药的干燥药材10kg，粉碎，80％乙醇加热回流提取3次，合并提取液，减压回收得乙醇浸膏；该浸膏经水悬浮后依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇各萃取3次，回收溶剂得各部位浸膏；其中正丁醇部位浸膏420g，通过D101型大孔吸附树脂柱色谱分离，用乙醇-水以体积比0∶1、3∶7、1∶1、7∶3、1∶0进行梯度洗脱，结合TLC检识，分别得到各部位浸膏；其中水部位浸膏178g，经过硅胶柱色谱分离、MCI柱色谱分离、反相ODS柱色谱分离、凝胶Sephadex LH-20柱色谱分离等方法，从中得到源于新疆芍药的两种新化合物。
结构鉴定：利用的光谱技术，主要包括核磁共振谱(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC)和质谱分析(HR-ESI-MS)鉴定化合物的结构。
(1)本发明化合物(I)为白色针状结晶(甲醇)，易溶于甲醇，紫外灯254nm下有暗斑，365nm下无荧光，碘显黄色，TLC 5％香草醛-浓硫酸试剂显橘黄色后转灰色，最后变绿色，FeCl3试剂反应不显色。HR-ESI-MS给出实验值m/z：345.1552[M-H]-(calcd forC16H25O8，345.1552)，得出其分子式为：C16H26O8，分子量为346。
化合物的1H-NMR(500MHz，CD3OD)，结合HSQC谱图，推测苷元含有：三组次甲基质子信号，δ3.92(1H，td，J＝10.9，4.4Hz，H-2)、δ2.37(1H，m，H-3)、δ2.07(1H，m，H-5)；三组亚甲基质子信号，δ1.24(1H，m，H-4β)与δ1.80(1H，br.s，H-4α)，δ1.53(1H，dd，J＝12.7，3.1Hz，H-6β)与δ2.09(1H，m，H-6α)和δ1.35(1H，d，J＝12.0Hz，H-1″)与δ2.31(1H，br.d，J＝12.0Hz，H-1″)以及一组甲烯基质子信号δ4.73(2H，m，H-2′″)。一组糖质子信号，且糖端基质子为δ4.46(1H，d，J＝7.8Hz，H-1′)。13C-NMR(125MHz，CD3OD)中有羰基碳信号δ177.9(C-1)，两个烯碳信号δ108.1(C-2″′)和δ148.8(C-1″′)和糖端基碳信号δ103.5(C-1′)。结合HMBC谱图，并结合文献数据，推得该化合物为2-O-β-D-葡萄吡喃糖基-3-羟甲基-5-异丙烯基环己酮。
HMBC谱中δ3.92(1H，td，J＝10.9，4.4Hz，H-2)与δ177.9(C-1)、δ50.2(C-3)和δ103.5(C-1′)有明显相关信号。δ1.53(1H，dd，J＝12.7，3.1Hz，H-6)与碳信号δ177.9(C-1)、δ80.1(C-2)、δ50.2(C-3)、δ30.0(C-4)和δ43.3(C-5)有明显相关信号，说明苷元中含有环己酮结构片段。甲基质子信号δ1.75(3H，s，3″′-CH3)与碳信号δ43.3(C-5)、δ108.1(C-2″′)和δ148.8(C-1″′)有相关信号，证明苷元中含有异丙烯基。质子信号δ2.31(1H，br.d，J＝12.0Hz)和δ1.35(1H，d，J＝12.0Hz)与碳信号δ80.1(C-2)、δ50.2(C-3)、δ30.0(C-4)和δ43.3(C-5)有相关信号，说明苷元中含有羟甲基结构片段。
NOESY谱中，δ3.92(1H，td，J＝10.9，4.4Hz，H-2)与δ4.46(d，1H，J＝-7.8Hz，H-1′)有NOE相关，说明H-2与H-1′共面，则H-2处于α构型；且H-2和H-1′还与δ1.35(1H，d，J＝12.0Hz，H-1″)和δ2.31(1H，br.d，J＝12.0Hz，H-1″)有NOE相关，说明H-3处于β构型；δ2.07(1H，m，H-5)与δ2.37(1H，m，H-3)有NOE相关，证明质子H-5为β构型。
综上所述，确定化合物(I)的相对构型为2-O-β-D-葡萄吡喃糖基-3-羟甲基-5-异丙烯基环己酮，即2-O-β-D-glucopyranosyl-3-hydroxymethyl-5-(prop-1-en-2-yl)cyclohexanone。
(2)本发明化合物(II)为白色针晶(二甲基亚砜)，易溶于二甲基亚砜。紫外灯254nm下有明显暗斑，365nm下无荧光，碘显黄色，TLC 5％浓硫酸-香草醛试剂不显色，FeCl3试剂显橙黄色。HR-ESI-MS实验值m/z：540.2078[M+NH4]+(calcd for C25H30NO12，540.2078)，得出其分子式为：C25H30O12，分子量为522。
化合物的1H-NMR(500MHz，CD3OD)谱中，有苯甲酰基质子信号：δ8.08(2H，dd，J＝7.8，1.1Hz，H-2，6)，δ7.63(1H，m，H-4)，δ7.50(2H，d，J＝7.8Hz，H-3，5)；一组芳香质子信号：δ7.45(1H，dd，J＝7.5，1.0Hz，H-13)，δ7.40(1H，m，H-11)，δ7.33(1H，d，J＝7.8Hz，H-10)，δ7.09(1H，dd，J＝7.5，1.0Hz，H-12)；两组糖质子信号，端基质子信号分别为δ4.99(1H，d，J＝7.3Hz，H-1′)，δ4.31(1H，d，J＝6.8Hz，H-1″)；还有一组亚甲基质子信号：δ5.59(1H，d，J＝12.7Hz，H-14a)，δ5.46(1H，d，J＝12.7Hz，H-14b)。13C-NMR(125MHz，CD3OD)谱中低场区有一酯羰基碳信号峰δ166.7(C-7)，两组糖端基碳信号峰δ101.0(C-1′)和103.0(C-1″)。综合以上信息，与文献中数据对照[3]，提示该化合物含有苯甲酸苄酯基，并结合酸水解的结果，糖基质子信号偶合常数均大于6，糖基上质子均为优势构象中的直立键，提示糖基为β-D-葡萄吡喃糖基和β-D-吡喃木糖基。
HMBC谱中，δ8.08(2H，dd，J＝7.8，1.1Hz，H-2，6)与δ166.7(C-7)有相关信号，δ7.50(2H，d，J＝7.8Hz，H-3，5)与δ130.1有相关信号，以及亚甲基质子信号δ5.59和δ5.46与δ166.7，δ125.6，δ155.5和δ129.1有相关信号，证明化合物含有苯甲酸苄酯基。
糖端基质子信号δ4.99(1H，d，J＝7.3Hz，H-1′)与δ155.5(C-9)和δ76.0(C-5′)有相关信号，证明糖基为邻位取代，连接位置为苯甲酸苄酯基的9位。另外，发现质子信号δ4.31(1H，d，J＝6.8Hz，H-1″)与碳信号δ65.3(C-6′)，δ72.7(C-2″)和δ68.0(C-5″)有相关信号；糖质子信号δ3.83和δ3.43与δ103.0(C-1″)和δ68.1(C-4′)有相关信号。这些相关信号证明β-D-吡喃木糖基与β-D-葡萄吡喃糖基为1→6连接。
综上所述，确定化合物(II)结构为9-O-[β-xylopyranosyl(1″→6′)-β-glucopyranosyl]-benzyl benzoate。
实施例2
下面结合附图对同时测定新疆芍药中9种化合物含量的HPLC技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明提供了一种同时测定新疆芍药中白芍苷R1、芍药苷、没食子酰芍药苷、氧化芍药苷、异香草酸、苯甲酸、没食子酸、没食子酸甲酯、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖9种化合物的HPLC方法，具体实施步骤如下：
仪器与试药：Agilent 1260高效液相色谱仪；C18色谱柱；标准品白芍苷R1、芍药苷、没食子酰芍药苷、氧化芍药苷、异香草酸、苯甲酸、没食子酸、没食子酸甲酯、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖均为本实验室自行分离纯化而得，并经1H-NMR及13C-NMR进行鉴定结构，HPLC检测，纯度均大于98.0％；水，乙腈(色谱纯)，甲酸(分析纯)，甲醇(分析纯)；新疆芍药药材购于新疆裕民县贝母实验站，产自于新疆塔城塔尔巴哈台山。
标准品溶液制备：分别精密称取对照品适量，甲醇溶解，制成含白芍苷R1 30.54μg/mL、芍药苷634.0μg/mL、没食子酰芍药苷79.60μg/mL、氧化芍药苷23.48μg/mL、异香草酸17.55μg/mL、苯甲酸137.6μg/mL、没食子酸140.2μg/mL、没食子酸甲酯17.05μg/mL、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖1169.0μg/mL的混合对照品溶液。
供试品溶液制备：取新疆芍药药材(过3号筛)500mg，精密加入20mL甲醇，超声提取30min，冷却后甲醇补足减失重量，滤过，即得。
色谱条件：Megres C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈(A)，0.1％甲酸水(B)，梯度洗脱条件：0～15min，8％～23％A；15～35min，23％～39％A；流速0.8mL/min；柱温30℃；检测波长230nm；进样量10μL；标准品溶液稀释成不同浓度，建立标准曲线，计算每个化合物线性回归方程。
样品中化合物的含量测定：按上述色谱条件对制备的样品溶液进行测定，利用线性回归方程，计算样品中9种化合物含量，结果分析如下：
线性关系考察：分别精密吸取混合对照品溶液1.5，2.0，4.0，6.0，8.0，10mL，甲醇定容至10mL容量瓶中，配制成系列浓度的对照品溶液；取各浓度的混合对照品溶液，按照色谱条件进行测定；以峰面积为纵坐标(Y)，进样量(μg/mL)为横坐标(X)进行线性回归，得各对照品回归方程、相关系数及线性范围。以信噪比S/N＝3为基准，测得最低检测限，以信噪比S/N＝10为基准，测得最小定量限，结果见下表1。
表1 9种成分线性关系
精密度试验：精密吸取对照品混合溶液10μL，按照色谱条件，连续进样6次，记录峰面积，结果见下表2，结果显示RSD(n＝6)均小于3％，表明仪器精密度良好。
重复性试验：取新疆芍药药材粉末6份，制备供试品溶液，按照色谱条件进行测定，记录峰面积，结果见下表2，结果显示RSD(n＝6)均小于3％，表明重复性良好。
稳定性试验：取同一份供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24h进样，按照色谱条件进行测定，记录峰面积，结果见下表2，结果显示RSD(n＝6)均小于3％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
加样回收率试验：精密称取已知含量的新疆芍药药材粉末6份，分别精密加入对照品适量(按药材中含量约1∶1加入)，按照供试品制备方法操作，测定并计算平均回收率和RSD，结果见下表2，9种化合物的平均加样回收率范围在96.82％～103.11％，RSD均小于3％，表明该方法回收率良好。
样品含量测定：取新疆芍药供试品溶液按上述高效液相色谱条件进行测定，根据线性回归方程计算9种化合物的含量，结果见下表3。
表2 9种化合物的精密度、重复性、稳定性、加样回收率(n＝6)
表3 新疆芍药中9种化合物的含量(％)
实施例3
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明中新疆芍药清除DPPH自由基的活性，所述实施例仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
主要实验材料：酶标仪(VarioskanFlash，4.00.53，ThermoFisher Scientific)；无水乙醇(分析纯)，2，2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)，奎诺二甲基丙烯酸(Trolox)，抗坏血酸(Vc)。
供试品溶液制备：新疆芍药乙醇提取液即实施例1项下80％乙醇提取液，其母液浓度为20mg/mL；新疆芍药甲醇提取液即实施例2项下甲醇提取液，其母液浓度为25mg/mL；用时均依次稀释成浓度为1200，1000，800，600，400，200，100，50μg/mL的样品溶液，备用。
DPPH溶液制备：精密称取DPPH粉末，以无水乙醇溶解，配制成62μg/mL的DPPH溶液(现配现用)，冷藏、避光保存。
对照品溶液制备：精密称取Trolox和Vc各1.00mg，Trolox以无水乙醇溶解，Vc以纯净水溶解，得浓度为1mg/mL的母液，备用。
样品测定：样品组、对照组和空白组按下式加入各浓度的提取液与DPPH溶液，室温、避光反应10min，517nm处测定吸光度值，平行操作3次(3复孔)，取均值，化合物对DPPH的清除作用以清除率(SR％)表示，活性强弱以IC50表示。
样品组(Ai)：50μL样品溶液+150μL DPPH溶液；
对照组(Aj)：50μL样品溶液+150μL无水乙醇溶液；
空白组(A0)：50μL溶解样品的溶剂+150μL DPPH溶液；
清除率计算公式：SR％＝(A0-(Ai-Aj))/A0×100％。
阳性药标准曲线的制备：取已稀释成浓度梯度的阳性药溶液，按照与样品测定相同方法进行测定；以样品浓度(μg/mL)为横坐标，清除率(SR％)为纵坐标做标准曲线。
样品测定结果：新疆芍药乙醇提取液与甲醇提取液清除DPPH自由基IC50值见下表4。
表4 新疆芍药提取液清除DPPH自由基活性
阳性药标准曲线：Trolox的标准曲线为y＝1.6362x+8.0575，R2＝0.998，线性范围为5μg/mL～50μg/mL，Trolox对DPPH清除的IC50值为25.63μg/mL；Vc的标准曲线为y＝2.6527x+7.544，R2＝0.997，线性范围为5μg/mL～25μg/mL，Vc对DPPH清除的IC50值为16.00μg/mL。

Claims (4)

1.从新疆芍药中提取分离得到的两个新化合物，其化学结构式如式(I)、式(II)所示：
化学名称为：2-O-β-D-glucopyranosyl-3-hydroxymethyl-5-(prop-1-en-2-yl)cyclohexanone
化学名称为：9-O-[β-xylopyranosyl(1″→6′)-β-glucopyranosyl]-benzylbenzoate。
2.如权利要求1所述从新疆芍药中分离得到两个新化合物的制备方法包括以下步骤：将新疆芍药干燥块根用80％乙醇回流提取，提取液减压浓缩后的总浸膏混悬于水，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取得各部位浸膏，取正丁醇部位经D101大孔树脂柱色谱分离，用乙醇-水以体积比0∶1～1∶0进行梯度洗脱，其中收集得到的水部位经硅胶柱色谱、MCI柱色谱、反相ODS柱色谱等多种分离方法，经薄层层析检测，收集含有化合物(I)和(II)的流份，浓缩后，经凝胶Sephadex LH-20柱色谱，甲醇洗脱，从中得到新疆芍药的两个新化合物(I)和(II)。
3.一种同时测定新疆芍药中9种化合物含量的HPLC方法，其特征在于所述方法步骤如下：分别精密称取白芍苷R1、芍药苷、没食子酰芍药苷、氧化芍药苷、异香草酸、苯甲酸、没食子酸、没食子酸甲酯、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖适量，甲醇溶解，制备对照品溶液；称取新疆芍药粉末500mg，加入甲醇20mL，超声提取30min，过滤，得供试品溶液；色谱条件：流动相为乙腈(A)和0.1％甲酸水(B)，梯度洗脱，流速0.8mL/min，柱温30℃，检测波长230nm，进样量10μL；建立标准曲线，计算每个化合物线性回归方程；按上述色谱条件对样品溶液进行测定，利用线性回归方程，计算样品中9种化合物含量。
4.如权利要求2所述的新疆芍药80％乙醇提取液及权利要求3所述的新疆芍药甲醇提取液，均具有清除DPPH自由基的活性，新疆芍药具有抗氧化及其相关的应用前景。
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