CN113105421A - 一种高速逆流色谱分离纯化秦皮中秦皮素和秦皮乙素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高速逆流色谱分离纯化秦皮中秦皮素和秦皮乙素的方法，包括：(1)取秦皮药材粉碎，采用乙醇溶液加热提取，合并滤液，减压旋蒸，得到秦皮粗提物；(2)将步骤(1)获得的秦皮粗提物溶解，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液过滤，减压浓缩分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取段；(3)采用高速逆流色谱分离纯化乙酸乙酯萃取段，得到秦皮素和秦皮乙素。本发明克服了传统制备方法操作复杂，样品吸附损失，回收率低等缺点；本发明效率高，操作简单，制备量大，综合成本低，具有很好的推广使用价值。
Description
技术领域
本发明属于中药有效成分分离纯化领域，特别涉及一种高速逆流色谱分离纯化秦皮中秦皮素和秦皮乙素的方法。
背景技术
秦皮为木犀科植物苦枥白蜡树Fraxinus rhynchophylla Hance、白蜡树Fraxinuschinensis Roxb.、尖叶白蜡树Fraxinus szaboana Lingelsh.或宿柱白蜡树Fraxinusstylosa Lingelsh.的干燥枝皮或干皮，性味苦、寒，具有清热燥湿、清肝明目、平喘止咳功效。用于热毒泻痢、目赤肿痛、目生翳障。秦皮中的主要有效成分为香豆素类成分，主要有秦皮素、秦皮苷、秦皮甲素和秦皮乙素。
现已有文献报道从秦皮中提取分离制备香豆素类成分的方法。《一种秦皮中香豆素类成分的制备方法》(申请号201811413460.1)将秦皮乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用有机溶剂萃取，收集乙酸乙酯萃取物；后用大孔树脂富集，再经硅胶柱分离，得到秦皮中香豆素类成分。《一种秦皮甲素纯化方法》(申请号201811275060.9)，将秦皮的根用乙醇提取，浓缩液放置结晶，过滤结晶，母液上大孔树脂洗脱，收集洗脱液，浓缩放置结晶，将所得结晶收集，过氧化铝柱，洗脱液重结晶得到秦皮甲素。《从中药秦皮中分离纯化单体化合物的方法》(申请号201210434068.1)将秦皮乙醇或甲醇提取物上Superose 12柱，用甲醇-水或乙醇-水洗脱，得到秦皮素，秦皮苷，秦皮甲素和秦皮乙素化合物。《秦皮香豆素提取方法》(申请号200610137703.4)将秦皮水提醇沉后,滤过浓缩,到大孔树脂上洗脱、收集洗脱液、浓缩干燥,获得秦皮总香豆素混合物。《一种秦皮提取物的制备方法和用途》(申请号200510098808.9)采用水煎煮提取，大孔树脂分离纯化制备秦皮香豆素混合物。王晶[秦皮中秦皮乙素分离纯化的工艺研究，中成药，2009年02期]利用硅胶柱层析，可得到秦皮乙素单体。刘丽梅[秦皮化学成分的研究，中草药，2001年12期]利用硅胶柱层析，氯仿-甲醇-甲酸比例洗脱，结晶得到秦皮素和秦皮乙素。
上述方法或进行秦皮总香豆素的提取，或利用柱层析进行单一成分的纯化。提取秦皮总香豆素，就不能得到高纯度的香豆素单体。利用柱层析比如Superose 12柱，为进口凝胶过滤柱，填料价格昂贵，对样品前处理要求高，进样量少，不利于放大生产；并不可避免因为填料吸附造成单体化合物的损失，使得回收率低，并在使用柱层析分离时也可能因与填料接触而造成该类化合物发生结构变化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高速逆流色谱分离纯化秦皮中秦皮素和秦皮乙素的方法，该方法克服了传统制备方法操作复杂，样品吸附损失，回收率低等缺点。
本发明提供了一种高速逆流色谱分离纯化秦皮中秦皮素和秦皮乙素的方法，包括：
(1)取秦皮药材粉碎，采用乙醇溶液超声加热提取，合并滤液，减压旋蒸，得到秦皮粗提物；
(2)将步骤(1)获得的秦皮粗提物溶解，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，过滤乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得到乙酸乙酯粗提物；
(3)采用高速逆流色谱对步骤(2)中的乙酸乙酯粗提物进行分离纯化，得到秦皮素和秦皮乙素；其中，高速逆流色谱溶剂系统组成为：体积比为8.0-10.0:0.5-1.0:8.0-10.0的乙酸乙酯、乙醇和水。
所述步骤(1)中的乙醇溶液质量浓度为90-95％。本发明采用高纯度乙醇提取，相比于其他溶剂的提取，能够使得秦皮中香豆素类单体最大程度的提取出来，而又不过多引入水溶性杂质干扰后续处理。
所述步骤(1)中的超声加热提取参数为：固液比1:4-6，提取次数2-3次，加热温度60-80℃，提取时间为1-2h。
步骤(2)中，本发明选择乙酸乙酯萃取段，可进一步将步骤(1)中的醇提物进行极性粗分，将秦皮素和秦皮乙素2种香豆素类成分进行富集(秦皮苷和秦皮甲素富集于正丁醇萃取段)，相比于其他溶剂的萃取，可使此2种成分最大限度集中。该萃取溶剂是保证HSCCC能够有效分离2种香豆素类化合物的前提条件。
所述步骤(3)中的高速逆流色谱中转速为700-900rpm，流动相流速为5-10mL/min，紫外检测波长为254nm，固相保留率为50-60％。
优选的，所述步骤(3)中的高速逆流色谱溶剂系统组成为：体积比为10.0:1.0:10.0的乙酸乙酯、乙醇和水。溶剂系统的筛选对于HSCCC分离十分关键。根据物质的相似相溶性原理，经过大量的实验分析和验证，对不同的溶剂系统进行试验，得到了以酸乙酯、乙醇和水作为溶剂系统组成以及精确了各个溶剂的比例，当乙酸乙酯:乙醇:水的体积比为上述比例时，秦皮素和秦皮乙素的分离效果最好。
所述高速逆流色谱溶剂系统的配制方法为：将乙酸乙酯、乙醇和水置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相。
有益效果
(1)本发明采用乙酸乙酯萃取可以最大程度的富集秦皮素和秦皮乙素，乙酸乙酯粗取物通过筛选优化HSCCC分离工艺参数后，得到的各馏分经HPLC进行纯度检测，可得到98％以上的单体，该方法适用于从秦皮中一步纯化制备出高纯度的香豆素类成分秦皮素和秦皮乙素。
(2)本发明克服了传统制备方法操作复杂，样品吸附损失，回收率低等缺点。本发明效率高，操作简单，稳定性好，制备量大，综合成本低，具有很好的推广使用价值。
附图说明
图1为秦皮乙酸乙酯粗提物的高效液相色谱图；
图2为分离纯化得到的秦皮乙素的高效液相色谱图；
图3为分离纯化得到的秦皮素的高效液相色谱图；
图4为高速逆流色谱分离纯化秦皮乙酸乙酯粗提物的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)取秦皮药材，粉碎至40-60目，90wt％乙醇溶液超声加热提取，加热温度60℃，固液比为1:6，提取2次，时间为60min，减压旋蒸，得秦皮粗提物；将秦皮粗提物用水打散，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，过滤乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得到乙酸乙酯粗提物，乙酸乙酯萃取部位的HPLC分析图，如图1所示。
(2)应用高速逆流色谱对所得秦皮乙酸乙酯部位进行香豆素类化合物的分离纯化：
采用乙酸乙酯:乙醇:水＝10:1:10为溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.3g，分离柱转速为800rpm，流速5mL/min，固定相保留率54％，检测波长254nm。对秦皮乙酸乙酯萃取段进行HSCCC分离，紫外检测器在线监测，收集不同馏分并减压干燥，得到秦皮素和秦皮乙素，如图4所示，A为秦皮乙素；B为秦皮素。
具体的操作步骤如下：按上述溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，取0.3g秦皮乙酸乙酯萃取段，溶解于10mL上相和10mL下相中待用。首先，将固定相用泵以一定流速灌满色谱柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800rpm时，设置流动相流速为5mL/min，开始泵流动相，直至两相平衡，然后使进样阀处于进样状态，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。然后根据检测器紫外光谱图接收目标成分，得秦皮素50mg和秦皮乙素90mg，HPLC分析纯度均为98％以上。
利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：Waters C18柱(250mm×4.6mm i.d.,5μm)，紫外检测波长334nm，柱温：25℃，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，流动相采用乙腈-0.1％磷酸水溶液15:85。
实施例2
(1)取秦皮药材，粉碎至50-80目，95wt％乙醇溶液超声加热提取，加热温度70℃，固液比为1:5，提取2次，时间为60min，减压旋蒸，得秦皮粗提物；将秦皮粗提物用水打散，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，过滤乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得到乙酸乙酯粗提物，乙酸乙酯萃取部位的HPLC分析图，如图1所示。
(2)应用高速逆流色谱对所得秦皮乙酸乙酯部位进行香豆素类化合物的分离纯化：
采用乙酸乙酯:乙醇:水＝10:1:8为溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.3g，分离柱转速为800rpm，流速5mL/min，固定相保留率52％，检测波长254nm。对秦皮乙酸乙酯萃取段进行HSCCC分离，紫外检测器在线监测，收集不同馏分并减压干燥，得到秦皮素和秦皮乙素，如图4所示，A为秦皮乙素；B为秦皮素。
具体的操作步骤如下：按上述溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，取0.3g秦皮乙酸乙酯萃取段，溶解于10mL上相和10mL下相中待用。首先，将固定相用泵以一定流速灌满色谱柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800rpm时，设置流动相流速为5mL/min，开始泵流动相，直至两相平衡，然后使进样阀处于进样状态，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。然后根据检测器紫外光谱图接收目标成分，得秦皮素55mg和秦皮乙素93mg，HPLC分析纯度均为95％以上。
利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：Waters C18柱(250mm×4.6mm i.d.,5μm)，紫外检测波长334nm，柱温：25℃，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，流动相采用乙腈-0.1％磷酸水溶液15:85。
Claims (6)
1.一种高速逆流色谱分离纯化秦皮中秦皮素和秦皮乙素的方法，包括：
(1)取秦皮药材粉碎，采用乙醇溶液超声加热提取，合并滤液，减压旋蒸，得到秦皮粗提物；
(2)将步骤(1)获得的秦皮粗提物溶解，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，过滤乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得到乙酸乙酯粗提物；
(3)采用高速逆流色谱对步骤(2)中的乙酸乙酯粗提物进行分离纯化，得到秦皮素和秦皮乙素；其中，高速逆流色谱溶剂系统组成为：体积比为8.0-10.0:0.5-1.0:8.0-10.0的乙酸乙酯、乙醇和水。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的乙醇溶液质量浓度为90-95％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的超声加热提取参数为：固液比1:4-6，提取次数2-3次，加热温度60-80℃，提取时间为1-2h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的高速逆流色谱中转速为700-900rpm，流动相流速为5-10mL/min，紫外检测波长为254nm，固相保留率为50-60％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的高速逆流色谱溶剂系统组成为：体积比为10.0:1.0:10.0的乙酸乙酯、乙醇和水。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述高速逆流色谱溶剂系统的配制方法为：将乙酸乙酯、乙醇和水置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相。
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