CN112645817A - 高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法 - Google Patents
高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112645817A CN112645817A CN202011544995.XA CN202011544995A CN112645817A CN 112645817 A CN112645817 A CN 112645817A CN 202011544995 A CN202011544995 A CN 202011544995A CN 112645817 A CN112645817 A CN 112645817A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- separating
- purifying
- speed
- flower
- flos
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000180649 Panax notoginseng Species 0.000 title claims abstract description 76
- 235000003143 Panax notoginseng Nutrition 0.000 title claims abstract description 75
- 241000628997 Flos Species 0.000 title claims abstract description 40
- 238000010262 high-speed countercurrent chromatography Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- CWVRJTMFETXNAD-NXLLHMKUSA-N trans-5-O-caffeoyl-D-quinic acid Chemical class O[C@H]1[C@H](O)C[C@](O)(C(O)=O)C[C@H]1OC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 CWVRJTMFETXNAD-NXLLHMKUSA-N 0.000 title 1
- PZIRUHCJZBGLDY-UHFFFAOYSA-N Caffeoylquinic acid Natural products CC(CCC(=O)C(C)C1C(=O)CC2C3CC(O)C4CC(O)CCC4(C)C3CCC12C)C(=O)O PZIRUHCJZBGLDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 54
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 51
- CWVRJTMFETXNAD-JUHZACGLSA-N chlorogenic acid Chemical class O[C@@H]1[C@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)C[C@H]1OC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 CWVRJTMFETXNAD-JUHZACGLSA-N 0.000 claims abstract description 50
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 48
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 44
- UFCLZKMFXSILNL-RVXRWRFUSA-N 4,5-di-O-caffeoylquinic acid Chemical compound O([C@@H]1C[C@](O)(C[C@H]([C@@H]1OC(=O)\C=C\C=1C=C(O)C(O)=CC=1)O)C(O)=O)C(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 UFCLZKMFXSILNL-RVXRWRFUSA-N 0.000 claims abstract description 31
- CWVRJTMFETXNAD-FWCWNIRPSA-N 3-O-Caffeoylquinic acid Natural products O[C@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)C[C@H]1OC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 CWVRJTMFETXNAD-FWCWNIRPSA-N 0.000 claims abstract description 19
- CWVRJTMFETXNAD-KLZCAUPSSA-N Neochlorogenin-saeure Natural products O[C@H]1C[C@@](O)(C[C@@H](OC(=O)C=Cc2ccc(O)c(O)c2)[C@@H]1O)C(=O)O CWVRJTMFETXNAD-KLZCAUPSSA-N 0.000 claims abstract description 19
- FFQSDFBBSXGVKF-KHSQJDLVSA-N chlorogenic acid Natural products O[C@@H]1C[C@](O)(C[C@@H](CC(=O)C=Cc2ccc(O)c(O)c2)[C@@H]1O)C(=O)O FFQSDFBBSXGVKF-KHSQJDLVSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 229940074393 chlorogenic acid Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 235000001368 chlorogenic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- BMRSEYFENKXDIS-KLZCAUPSSA-N cis-3-O-p-coumaroylquinic acid Natural products O[C@H]1C[C@@](O)(C[C@@H](OC(=O)C=Cc2ccc(O)cc2)[C@@H]1O)C(=O)O BMRSEYFENKXDIS-KLZCAUPSSA-N 0.000 claims abstract description 19
- KRZBCHWVBQOTNZ-UHFFFAOYSA-N (-) 3,5-dicaffeoyl-muco-quinic acid Natural products OC1C(OC(=O)C=CC=2C=C(O)C(O)=CC=2)CC(O)(C(O)=O)CC1OC(=O)C=CC1=CC=C(O)C(O)=C1 KRZBCHWVBQOTNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- KRZBCHWVBQOTNZ-RDJMKVHDSA-M (-)-3,5-Dicaffeoyl quinic acid Natural products O([C@@H]1CC(O)(C[C@H](C1O)OC(=O)\C=C\C=1C=C(O)C(O)=CC=1)C([O-])=O)C(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 KRZBCHWVBQOTNZ-RDJMKVHDSA-M 0.000 claims abstract description 17
- UFCLZKMFXSILNL-AALYGJCLSA-N 3,4-Dicaffeoylquinic acid Natural products O=C(O[C@@H]1[C@H](OC(=O)/C=C/c2cc(O)c(O)cc2)C[C@](O)(C(=O)O)C[C@@H]1O)/C=C/c1cc(O)c(O)cc1 UFCLZKMFXSILNL-AALYGJCLSA-N 0.000 claims abstract description 17
- KRZBCHWVBQOTNZ-PSEXTPKNSA-N 3,5-di-O-caffeoyl quinic acid Chemical compound O([C@@H]1C[C@](O)(C[C@H]([C@@H]1O)OC(=O)\C=C\C=1C=C(O)C(O)=CC=1)C(O)=O)C(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 KRZBCHWVBQOTNZ-PSEXTPKNSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 12
- INCWELKXTZCRSA-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.CCOC(C)=O INCWELKXTZCRSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000000469 ethanolic extract Substances 0.000 claims description 28
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 23
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 claims description 19
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 15
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 13
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 12
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 11
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 claims description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 abstract description 24
- CWVRJTMFETXNAD-GMZLATJGSA-N 5-Caffeoyl quinic acid Natural products O[C@H]1C[C@](O)(C[C@H](OC(=O)C=Cc2ccc(O)c(O)c2)[C@@H]1O)C(=O)O CWVRJTMFETXNAD-GMZLATJGSA-N 0.000 abstract description 20
- -1 caffeoylquinic acid compound Chemical class 0.000 abstract description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 5
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract 1
- CWVRJTMFETXNAD-BMNNCGMMSA-N (1s,3r,4s,5r)-3-[(e)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enoyl]oxy-1,4,5-trihydroxycyclohexane-1-carboxylic acid Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)C[C@H]1OC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 CWVRJTMFETXNAD-BMNNCGMMSA-N 0.000 description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 15
- KRZBCHWVBQOTNZ-DLDRDHNVSA-N isochlorogenic acid Natural products O[C@@H]1[C@H](C[C@@](O)(C[C@H]1OC(=O)C=Cc2ccc(O)c(O)c2)C(=O)O)OC(=O)C=Cc3ccc(O)c(O)c3 KRZBCHWVBQOTNZ-DLDRDHNVSA-N 0.000 description 15
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 3
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 description 3
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 240000008672 Gynura procumbens Species 0.000 description 2
- 235000018457 Gynura procumbens Nutrition 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 150000002213 flavones Chemical class 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 2
- JSPNNZKWADNWHI-PNANGNLXSA-N (2r)-2-hydroxy-n-[(2s,3r,4e,8e)-3-hydroxy-9-methyl-1-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoctadeca-4,8-dien-2-yl]heptadecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)C(=O)N[C@H]([C@H](O)\C=C\CC\C=C(/C)CCCCCCCCC)CO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O JSPNNZKWADNWHI-PNANGNLXSA-N 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000208838 Asteraceae Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 241001530884 Gynura segetum Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000002789 Panax ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 240000004371 Panax ginseng Species 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 240000005373 Panax quinquefolius Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N Thermopsosid Natural products O(C)c1c(O)ccc(C=2Oc3c(c(O)cc(O[C@H]4[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O4)c3)C(=O)C=2)c1 GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930183167 cerebroside Natural products 0.000 description 1
- RIZIAUKTHDLMQX-UHFFFAOYSA-N cerebroside D Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC)COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O RIZIAUKTHDLMQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006837 decompression Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002888 effect on disease Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002212 flavone derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000002398 materia medica Substances 0.000 description 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000004262 preparative liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000002040 relaxant effect Effects 0.000 description 1
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000008736 traumatic injury Effects 0.000 description 1
- 239000009685 tusanqi Substances 0.000 description 1
- VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N vitamin p Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C=C1C1=CC=CC=C1 VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
- C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
- C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
- C07C67/56—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by solid-liquid treatment; by chemisorption
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
- C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
- C07C2601/14—The ring being saturated
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法，包括以下步骤：(1)蔓三七花醇提物的制备，(2)高速逆流色谱分离纯化，采用体积比为1:1:1～1:5:10的甲醇‑乙酸乙酯‑水溶液为溶剂体系，待两相溶剂体系在高速逆流柱中达到平衡时，将蔓三七花醇提物溶于所述两相溶剂体系，进行高速逆流色谱分离；在高速逆流色谱分离时，用波长200～350nm的紫外检测器检测，根据色谱峰分别收集相应的峰组分进行减压浓缩冷冻干燥，得到绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C。本发明分离纯化咖啡酰奎宁酸类化合物单体纯度高、损失小、操作简单、制备量大、经济环保。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物化学领域，尤其涉及高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法。
背景技术
蔓三七，又名平卧菊三七(Gunura procumbens)，为菊科菊三七属的一年生草本植物，头部的花序呈黄色圆锥状，在《中华本草》、《中国药典》上均有收录记载，并在2012年被我国国家卫生健康委员会批准为药食两用的新型食品资源。具有止咳消炎、活血化瘀、舒筋活络、消肿止痛、护肝解毒、治疗跌打损伤、痛风、风湿性关节炎、肺炎等药用功效。现代研究表明：蔓三七主要含有咖啡酰奎宁酸、黄酮、萜类和生物碱等活性成分，大量研究表明，咖啡酰奎宁酸类化合物除了具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等作用外，对高血压、糖尿病等疾病也有较好的治疗效果。咖啡酰奎宁酸类化合物安全、无毒，已在医药，食品加工等方面得到广泛应用。
国内外学者对蔓三七化学成分的研究多集中在其叶与茎上，并得出蔓三七叶中含有大量的酚类、黄酮、生物碱和萜类等化学活性成分[菊三七属植物化学成分及药理活性研究进展，今日药学，2020年第7期]，但在蔓三七除去茎叶之后，对其剩余部分的研究甚少(仅有蒋娟娟等[菊三七地下部分的化学成分，药物与临床研究，2008年第3期]对蔓三七根进行化学成分研究，并分离得到黄酮和生物碱等化合物；胡居吾等从蔓三七根中分离得到一种新的脑苷脂。并且现有研究中尚未见有学者对蔓三七花的化学成分进行报道。现有技术中一般采用传统柱层析分离，重结晶等方法从蔓三七样品中提取分离单体化合物，这些方法需反复经过柱层析分离，操作复杂，耗时长，不仅溶剂消耗量大，而且样品损失也大，分离效果差。高速逆流色谱是近年来新兴的一种快速分离色谱分离技术，无需固定相为载体是其最大优势，同时具有溶剂用量少、分离速度快、进样量大、样品回收率高等独特优点，现已广泛应用于植物化学、中药化学以及天然产物化学物质的制备分离和纯化。
发明内容
本发明的目的是提供一种高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法，可以从蔓三七花中分离纯化多个咖啡酰奎宁酸类化合物单体，包括绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C。
为了解决上述技术问题，本发明提供的分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法是这样实现的：
(1)蔓三七花醇提物的制备
将蔓三七花干燥后，以乙醇为溶剂进行超声提取，浓缩除去溶剂，得到蔓三七花乙醇提取物；
(2)高速逆流色谱分离纯化
采用体积比为1:1:1～1:5:10的甲醇-乙酸乙酯-水溶液为溶剂体系，将固定相以15～30mL/min流速泵入高速逆流色谱仪，待所述固定相充满整个柱子后，3～5mL/min的流速泵入流动相，同时调节高速逆流色谱仪转速至700～900rpm；待两相溶剂体系在高速逆流柱中达到平衡时，将所述蔓三七花醇提物溶于所述两相溶剂体系，进样浓度为15mg/mL～40mg/mL，进样体积为20～40mL，进行高速逆流色谱分离；在所述高速逆流色谱分离时，用波长200～350nm的紫外检测器检测，以单个波峰为单位，从出峰开始进行收集直至峰消失为止停止收集，分别收集不同馏分进行减压浓缩冷冻干燥，得到绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C。
特别地，所述步骤(2)中，所述的甲醇-乙酸乙酯-水的体积比为1:3～4:3～5。
特别地，所述步骤(2)中，高速逆流色谱仪转速为800～900rpm。
特别地，所述步骤(2)中，紫外检测器检测波长为300～350nm。
特别地，所述步骤(2)中，蔓三七花醇提物的进样浓度为25mg/mL～40mg/mL，进样体积为25～35mL。
特别地，所述步骤(2)中，所述的甲醇-乙酸乙酯-水的体积比为1:3:3。
特别地，其特征在于所述步骤(2)中，所述进行高速逆流色谱分离时，分离柱转速为850rpm，流动相流速为5mL/min，紫外检测器波长为327nm，进样浓度为25mg/mL，进样体积为30mL。
特别地，蔓三七花醇提物的制备过程为：将蔓三七花干燥后，以70～95％浓度的乙醇为溶剂进行超声提取1～3次，提取时间为1～4h，超声提取的固液比为1：10～1：20，之后抽滤并合并滤液，进行真空减压浓缩除去溶剂，得到蔓三七花乙醇提取物。
特别地，所述步骤(1)中，所述超声提取的乙醇溶液浓度为90％。
特别地，所述步骤(1)中，所述超声提取的固液比为1：15，提取次数为2次。
本发明提供的分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法，能够分离纯化绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C四种咖啡酰奎宁酸类单体，相对于现有技术，本发明可以一次性从蔓三七花中分离纯化四种咖啡酰奎宁酸类化合物单体，分离纯化咖啡酰奎宁酸类化合物单体效率高、操作简单、综合成本低、分离量大、产品纯度高、样品损失小；本发明分离纯化得到咖啡酰奎宁酸类单体经高效液相色谱法(HPLC)纯度达到90％以上，各馏分经制备液相色谱提纯可得到95％以上的纯品绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C。
附图说明
图1是采用体积比1:3:3的甲醇-乙酸乙酯-水为溶剂体系的高速逆流色谱分离纯化蔓三七花的色谱图；
图2是分离纯化得到的绿原酸的高效液相色谱图；
图3是分离纯化得到的异绿原酸A的高效液相色谱图；
图4是分离纯化得到的异绿原酸B的高效液相色谱图；
图5是分离纯化得到的异绿原酸C的高效液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如下详细介绍本发明提供的分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法：
步骤一：蔓三七花乙醇提取物的制备
将蔓三七花干燥后，以70～95％浓度的乙醇为溶剂进行超声提取1～3次，提取时间为1～4h，超声提取的固液比为1：10～1：20，之后抽滤并合并滤液，进行真空减压浓缩除去溶剂，得到蔓三七花乙醇提取物。
步骤二：咖啡酰奎宁酸类单体分离
采用体积比1:1:1～1:5:10的甲醇-乙酸乙酯-水为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以20～30mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以3～5mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节高速逆流色谱仪转速至700～900rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将蔓三七花乙醇提取物溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为15mg/mL～40mg/mL，进样体积为20mL～40mL，对蔓三七花醇提物进行高速逆流色谱(High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC)分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为200～350nm，以单个波峰为单位，从出峰开始收集至峰消失停止收集，分别收集不同馏分减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。
实施例1
步骤一：蔓三七花乙醇提取物的制备
将干燥后的蔓三七花1.0kg，以90％浓度的乙醇为溶剂进行超声提取，提取时间为2h，超声提取的固液比为1：15，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并进行真空减压浓缩至无乙醇味，得到蔓三七花乙醇提取物。
步骤二：咖啡酰奎宁酸类单体分离
采用体积比1:3:3的甲醇-乙酸乙酯-水为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以30mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以5mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节高速逆流色谱仪转速至850rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将蔓三七花乙醇提取物溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为25mg/mL，进样体积为30mL，对蔓三七花醇提物进行高速逆流色谱(High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC)分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为327nm，根据色谱峰分别收集相应的峰组分，从出峰开始进行收集直至峰消失为止停止收集，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物，如图1所示。
绿原酸(Ⅰ)、异绿原酸A(Ⅱ)、异绿原酸B(Ⅲ)和异绿原酸C(Ⅳ)的结构如下：
步骤三：咖啡酰奎宁酸类单体纯度测定及结构测定
收集到的各馏分别经1H-NMR(核磁共振)和13C-NMR鉴定，表1和表2所示，所得单体化合物分别为绿原酸3.83mg、异绿原酸A6.51mg、异绿原酸B 4.38mg和异绿原酸C 4.47mg；收集到各分馏物分别经HPLC检测，以色谱峰面积归一化法计算，测量各杂质峰的面积和总色谱峰面积，计算各杂质峰面积及其之和占总峰面积的百分率，样品纯度即为去掉杂质峰之和所占的百分率。如图2所示，色谱峰面积归一化法计算可知杂质峰的峰面积为3.8％，总色谱峰面积为1，计算可得绿原酸纯度为96.2％，同理可知异绿原酸A纯度为97.6％，异绿原酸B纯度为96.7％，异绿原酸C纯度为95.3％；绿原酸，异绿原酸A，异绿原酸B和异绿原酸C的高效液相色谱图分别如图2～图5所示。
表1化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的氢谱(400MHz,MeOH-d4)
表2化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的碳谱(100MHz,MeOH-d4)
实施例2
步骤一：蔓三七花乙醇提取物的制备
将干燥后的蔓三七花1.0kg，以85％浓度的乙醇为溶剂进行超声提取，提取时间为1h，超声提取的固液比为1：20，过滤，滤渣重复处理1次；合并滤液并进行真空减压浓缩至无乙醇味，得到蔓三七花乙醇提取物。
步骤二：咖啡酰奎宁酸类单体分离
采用体积比1:3:4的甲醇-乙酸乙酯-水为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以25mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以4mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节逆流色谱仪转速至800rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将蔓三七花乙醇粗提物溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为30mg/mL，进样体积为25mL，对蔓三七花乙醇粗提物进行HSCCC分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为310nm，根据色谱峰分别收集相应的峰组分，从出峰开始进行收集直至峰消失为止停止收集，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。
步骤三：咖啡酰奎宁酸类单体纯度测定及结构测定
所得单体化合物分别为绿原酸2.35mg、异绿原酸A1.28mg、异绿原酸B 5.38mg和异绿原酸C 5.27mg；收集到各分馏物分别经HPLC检测，可得绿原酸纯度为94.5％，同理可知异绿原酸A纯度为93.8％，异绿原酸B纯度为92.9％，异绿原酸C纯度为97.0％。
实施例3
步骤一：蔓三七花乙醇提取物的制备
将干燥后的蔓三七花1.0kg，以95％浓度的乙醇为溶剂进行超声提取，提取时间为3h，超声提取的固液比为1：10，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并进行真空减压浓缩至无乙醇味，得到蔓三七花乙醇提取物。
步骤二：咖啡酰奎宁酸类单体分离
采用体积比1:4:4的甲醇-乙酸乙酯-水为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以20mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以3mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节逆流色谱仪转速至900rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将蔓三七花乙醇粗提物溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为20mg/mL，进样体积为35mL，对蔓三七花乙醇粗提物进行HSCCC分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为340nm，根据色谱峰分别收集相应的峰组分，从出峰开始进行收集直至峰消失为止停止收集，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。
步骤三：咖啡酰奎宁酸类单体纯度测定及结构测定
所得单体化合物分别为绿原酸5.27mg、异绿原酸A 6.89mg、异绿原酸B 4.21mg和异绿原酸C 6.10mg；收集到各分馏物分别经HPLC检测，可得绿原酸纯度为98.1％，同理可知异绿原酸A纯度为95.2％，异绿原酸B纯度为91.7％，异绿原酸C纯度为94.8％。
实施例4
步骤一：蔓三七花乙醇提取物的制备
将干燥后的蔓三七花1.0kg，以80％浓度的乙醇为溶剂进行超声提取，提取时间为3h，超声提取的固液比为1：20，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并进行真空减压浓缩至无乙醇味，得到蔓三七花乙醇提取物。
步骤二：咖啡酰奎宁酸类单体分离
采用体积比1:4:3的甲醇-乙酸乙酯-水为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以15mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以3mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节逆流色谱仪转速至800rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将蔓三七花乙醇粗提物溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为35mg/mL，进样体积为25mL，对蔓三七花乙醇粗提物进行HSCCC分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为300nm，根据色谱峰分别收集相应的峰组分，从出峰开始进行收集直至峰消失为止停止收集，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。
步骤三：咖啡酰奎宁酸类单体纯度测定及结构测定
所得单体化合物分别为绿原酸6.58mg、异绿原酸A 8.79mg、异绿原酸B 6.59mg和异绿原酸C4.21mg；收集到各分馏物分别经HPLC检测，可得绿原酸纯度为91.2％，同理可知异绿原酸A纯度为92.9％，异绿原酸B纯度为93.7％，异绿原酸C纯度为92.9％。
实施例5
步骤一：蔓三七花乙醇提取物的制备
将干燥后的蔓三七花1.0kg，以75％浓度的乙醇为溶剂进行超声提取，提取时间为2.5h，超声提取的固液比为1：10，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并进行真空减压浓缩至无乙醇味，得到蔓三七花乙醇提取物。
步骤二：咖啡酰奎宁酸类单体分离
采用体积比1:3:5的甲醇-乙酸乙酯-水为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以30mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以4mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节逆流色谱仪转速至820rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将蔓三七花乙醇粗提物溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为40mg/mL，进样体积为35mL，对蔓三七花乙醇粗提物进行HSCCC分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为350nm，根据色谱峰分别收集相应的峰组分，从出峰开始进行收集直至峰消失为止停止收集，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。
步骤三：咖啡酰奎宁酸类单体纯度测定及结构测定
所得单体化合物分别为绿原酸8.52mg、异绿原酸A 2.11mg、异绿原酸B 4.25mg和异绿原酸C3.87mg；收集到各分馏物分别经HPLC检测，可得绿原酸纯度为95.9％，同理可知异绿原酸A纯度为94.3％，异绿原酸B纯度为92.8％，异绿原酸C纯度为97.3％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)蔓三七花醇提物的制备
将蔓三七花干燥后，以乙醇为溶剂进行超声提取，浓缩除去溶剂，得到蔓三七花乙醇提取物；
(2)高速逆流色谱分离纯化
采用体积比为1:1:1～1:5:10的甲醇-乙酸乙酯-水溶液为溶剂体系，将固定相以15～30mL/min流速泵入高速逆流色谱仪，待所述固定相充满整个柱子后，3～5mL/min的流速泵入流动相，同时调节高速逆流色谱仪转速至700～900rpm；待两相溶剂体系在高速逆流柱中达到平衡时，将所述蔓三七花醇提物溶于所述两相溶剂体系，进样浓度为15mg/mL～40mg/mL，进样体积为20～40mL，进行高速逆流色谱分离；在所述高速逆流色谱分离时，用波长200～350nm的紫外检测器检测，以单个波峰为单位，从出峰开始进行收集直至峰消失为止停止收集，分别收集不同馏分进行减压浓缩冷冻干燥，得到绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C。
2.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述的甲醇-乙酸乙酯-水的体积比为1:3～4:3～5。
3.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，高速逆流色谱仪转速为800～900rpm。
4.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，紫外检测器检测波长为300～350nm。
5.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，蔓三七花醇提物的进样浓度为25mg/mL～40mg/mL，进样体积为25～35mL。
6.根据权利要求2所述的一种高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述的甲醇-乙酸乙酯-水的体积比为1:3:3。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述进行高速逆流色谱分离时，分离柱转速为850rpm，流动相流速为5mL/min，紫外检测器波长为327nm，进样浓度为25mg/mL，进样体积为30mL。
8.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法，其特征在于，蔓三七花醇提物的制备过程为：将蔓三七花干燥后，以70～95％浓度的乙醇为溶剂进行超声提取1～3次，提取时间为1～4h，超声提取的固液比为1：10～1：20，之后抽滤并合并滤液，进行真空减压浓缩除去溶剂，得到蔓三七花乙醇提取物。
9.根据权利要求8所述的一种高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述超声提取的乙醇溶液浓度为90％。
10.根据权利要求8所述的一种高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述超声提取的固液比为1：15，提取次数为2次。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011544995.XA CN112645817A (zh) | 2020-12-24 | 2020-12-24 | 高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011544995.XA CN112645817A (zh) | 2020-12-24 | 2020-12-24 | 高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112645817A true CN112645817A (zh) | 2021-04-13 |
Family
ID=75359760
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011544995.XA Pending CN112645817A (zh) | 2020-12-24 | 2020-12-24 | 高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112645817A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115260032A (zh) * | 2022-10-08 | 2022-11-01 | 中国科学院昆明植物研究所 | 一种利用高速逆流色谱分离纯化对甲氧基肉桂酸乙酯和/或肉桂酸乙酯的方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101691330A (zh) * | 2009-09-28 | 2010-04-07 | 中南大学 | 洋蓟中高纯度抗病毒活性组分的分离纯化方法 |
| JP2012158584A (ja) * | 2011-01-12 | 2012-08-23 | Brooks Holdings:Kk | 高速向流クロマトグラフィーによる低分子有用成分の分離方法 |
| CN107056615A (zh) * | 2017-03-10 | 2017-08-18 | 江西省科学院应用化学研究所 | 一种从植物中制备高纯度绿原酸的方法 |
| CN108689852A (zh) * | 2018-06-26 | 2018-10-23 | 江西省科学院应用化学研究所 | 一种从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法 |
| CN110818668A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-02-21 | 江西省科学院应用化学研究所 | 从平卧菊三七茎中分离纯化高纯度黄酮苷类化合物的方法 |
| CN111892503A (zh) * | 2020-08-11 | 2020-11-06 | 江西省科学院应用化学研究所 | 一种从平卧菊三七花中快速制备高纯度绿原酸的方法 |
-
2020
- 2020-12-24 CN CN202011544995.XA patent/CN112645817A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101691330A (zh) * | 2009-09-28 | 2010-04-07 | 中南大学 | 洋蓟中高纯度抗病毒活性组分的分离纯化方法 |
| JP2012158584A (ja) * | 2011-01-12 | 2012-08-23 | Brooks Holdings:Kk | 高速向流クロマトグラフィーによる低分子有用成分の分離方法 |
| CN107056615A (zh) * | 2017-03-10 | 2017-08-18 | 江西省科学院应用化学研究所 | 一种从植物中制备高纯度绿原酸的方法 |
| CN108689852A (zh) * | 2018-06-26 | 2018-10-23 | 江西省科学院应用化学研究所 | 一种从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法 |
| CN110818668A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-02-21 | 江西省科学院应用化学研究所 | 从平卧菊三七茎中分离纯化高纯度黄酮苷类化合物的方法 |
| CN111892503A (zh) * | 2020-08-11 | 2020-11-06 | 江西省科学院应用化学研究所 | 一种从平卧菊三七花中快速制备高纯度绿原酸的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 李小军等: ""一测多评"法测定平卧菊三七中绿原酸类成分", 《中国医院药学杂志》 * |
| 胡居吾等: "蔓三七叶中分离绿原酸和异绿原酸及其抗氧化活性研究", 《天然产物研究与开发》 * |
| 赵余庆主编, 中国医药科技出版社 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115260032A (zh) * | 2022-10-08 | 2022-11-01 | 中国科学院昆明植物研究所 | 一种利用高速逆流色谱分离纯化对甲氧基肉桂酸乙酯和/或肉桂酸乙酯的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11267775B2 (en) | Method for preparing cannabidiol by separation and purification using high-speed countercurrent chromatography | |
| CN106543248B (zh) | 高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法 | |
| CN110483599B (zh) | 一种番荔枝叶中黄酮类成分的分离方法 | |
| CN101525357A (zh) | 一种从中药中分离制备五没食子酰基葡萄糖的方法 | |
| CN110551137B (zh) | 一种光甘草定的提取纯化方法以及在化妆品中的用途 | |
| CN101812098B (zh) | 一种从巴戟天药材中提取分离水晶兰苷单体的方法 | |
| CN113402574B (zh) | 高速逆流色谱分离纯化何首乌叶乙酸乙酯相中黄酮类化合物的方法 | |
| WO2012061984A1 (zh) | 制备芍药内酯苷和芍药苷的方法 | |
| CN110724172A (zh) | 一种乙醇回流法制备诃黎勒酸的方法 | |
| CN112645817A (zh) | 高速逆流色谱分离纯化蔓三七花中咖啡酰奎宁酸类化合物的方法 | |
| CN101884655A (zh) | 一种三七花提取物的制备方法 | |
| CN115453035B (zh) | 一种从三七中提取高含量三七皂苷r1的方法 | |
| CN103800418B (zh) | 一种活血止痛组合物及胶囊制备工艺和应用 | |
| CN103951717B (zh) | 一种提取制备苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的方法 | |
| CN103524578B (zh) | 一种从牡丹雄蕊中提取分离芍药苷类化合物的方法 | |
| CN115260032A (zh) | 一种利用高速逆流色谱分离纯化对甲氧基肉桂酸乙酯和/或肉桂酸乙酯的方法 | |
| CN104447720B (zh) | 一种从溪黄草中分离新西兰牡荆苷‑2的方法 | |
| CN106916065A (zh) | 从牛蒡根中制备高纯度绿原酸的方法 | |
| CN106831892A (zh) | 一种山楂叶中黄酮单体的制备方法 | |
| CN109369382B (zh) | 一种银杏酸类成分的制备方法 | |
| CN113105421A (zh) | 一种高速逆流色谱分离纯化秦皮中秦皮素和秦皮乙素的方法 | |
| CN102389456A (zh) | 一种提取蓝萼香茶菜总二萜或蓝萼甲素的方法 | |
| CN105017235B (zh) | 分离纯化葛根素的方法 | |
| CN103768124A (zh) | 一种活血止痛组合物及胶囊制备工艺和应用 | |
| CN109021139A (zh) | 刺五加多糖的提取与纯化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210413 |