CN105017235B - 分离纯化葛根素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离纯化葛根素的方法，这是一种以高回收率、高生产效率制备高纯度葛根素的方法。该方法包括以下步骤：以乙酸乙酯、正丁醇和水组成的三元溶剂体系为分离溶剂体系，采用高速离心分配色谱法对葛根素提取物进行分离纯化，得到葛根素。

Description

分离纯化葛根素的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种分离纯化葛根素的方法，特别是涉及一种以高回收率、高生产效率制备高纯度葛根素的方法。

背景技术

葛为多年生豆科缠绕藤本植物，侧蔓和须根多，但块根深生，呈纺锤形或长棒形，表皮为淡黄色，有皱褶，是主要食用和药用部分。葛根为野葛Pueraria Lobata(Willd.)Ohwi或粉葛P.thomsomi Benth的干燥根。葛根作为常用中药，始载于《神农本草经》，列为中品，历代以来本草均有记载，味甘、辛、性平，具有解肌退热、生津、透疹、温阳止泻、提高机体免疫力等功能。目前，葛根广泛用于改善心脑血管、治疗感冒、糖尿病、腹泻等中药复方制剂中，用量极大，是制剂的重要成分。葛根含有异黄酮类、三萜类、芳香类等活性成分。其中异黄酮类化合物是葛根的主要化学成分，而葛根素(Puerarin)是葛属植物的特有成分，亦为主要有效成分。葛根素的药理作用十分广泛，具有降血脂，抗炎，抗心律失常、对心肌缺血的保护作用、扩张冠状动脉血管、肾保护、抗氧化、抗缺血再灌注损伤、抗肝缺血再灌注损伤、抗酒精中枢抑制、调控骨代谢、降血糖、利尿、降低血压、防治高血压头晕、头痛、颈项疼痛等作用。葛根素的化学结构式如下式所示：

随着葛根素的药理作用的研究深入，葛根素的分离纯化也越来越受到人们的重视。目前葛根素纯化方法主要有：大孔吸附树脂法、柱层析、酸水解有机溶剂萃取法及金属离子络合法等。

目前大部分企业提取葛根中葛根素时都采用传统生产方法，具体操作如下。

1.葛根预处理:葛根清洗-烘干-粉碎。

2.提取方法，通常有三种，具体如下。

2.1超声辅助提取法:葛根粉→超声提取→过滤→减压浓缩→过柱→水洗→醇洗→减压浓缩→真空 干燥→葛根素粗提物。

2.2水提取法:葛根干粉→水提取→过滤，得滤液和渣→用浓度5％的NaOH水溶液再提取渣→过滤，得滤液→合并两次的滤液→减压浓缩→调PH值→离心分离→滤液上硅胶柱→水洗→95％乙醇洗脱→洗脱液减压浓缩至干→葛根素。

2.3醇提法:葛根干粉→乙醇回流提取→过滤，得滤液和渣→渣再乙醇回流提取→过滤→合并两次的滤液→减压浓缩→离心分离→调滤液的PH值→再过滤→滤液浓缩至干→葛根素。

以上提取葛根素的方法，虽能得到葛根素粗提物，但操作周期长，工艺复杂，收率也不高，经检测所得的葛根素的含量也不高；最主要的是葛根中含有大量的淀粉不能得到充分利用，造成了资源的浪费。

此外，有诸多专利文献在分离纯化葛根素方面付出了巨大努力。例如，中国专利申请公开号CN1154849A采用正丁醇萃取后经三氧化二铝柱脱色得到纯度97％以上的葛根素产品；中国专利申请公开号CN1927876A经过离子交换大孔树脂层析再经过大孔树脂层析可以获得葛根素含量很高的葛根素提取物；中国专利申请公开号CN1398872A通过大孔吸附树脂及硅胶柱层析可得到高纯度葛根素。

中国专利申请公开号CN 103709152 A(201310729209.7)公开了一种葛根素的分离纯化方法，包括以下步骤：以乙酸乙酯、正丁醇和水组成的三元溶剂体系为分离溶剂体系，采用高速离心分配色谱法对葛根素提取物进行分离纯化得到葛根素即可；所述的高速离心分配色谱法在高速离心分配色谱仪中进行；据信该发明的葛根素的分离纯化方法步骤简单、分离时间短、分离能力强、分离到的葛根素纯度高(HPLC纯度大于99％)、回收率高(大于65％)。

尽管据信现有技术能够得到较高纯度的葛根素，然而这些现有技术的生产效率是相当低的，通常难以满足工业生产的要求。为此，本领域仍然期待有新的分离纯化葛根素的方法，以其高效地获得高纯度的葛根素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中葛根素的分离方法步骤繁琐、分离时间长、分离能力差、分离到的葛根素纯度差、回收率低等缺陷，和/或为了提高生产效率，而提供了一种葛根素的分离纯化方法。本发明的葛根素的分离纯化方法步骤简单、分离时间短、分离能力强、分离到的葛根素纯度高(HPLC纯度大于99％)、回收率高(大于65％)，特别是，本发明方法具有显著更高的生产效率。本发明方法具有良好的市场开发前景。

在本发明的第一方面，本发明提供了一种分离纯化葛根素的方法，其包括以下步骤：以乙酸乙酯、正丁醇和水组成的三元溶剂体系为分离溶剂体系，采用高速离心分配色谱法对葛根素提取物进行分离 纯化，得到葛根素；所述的高速离心分配色谱法在高速离心分配色谱仪中进行。

根据本发明第一方面的方法，所述的高速离心分配色谱仪优选厂家为法国Rousselet Robatel型号为FCPC A或FCPC C的高速离心分配色谱仪。下文各种实施例中如未另外说明，使用的是法国Rousselet Robatel型号为FCPC A的高速离心分配色谱仪。

根据本发明第一方面的方法，所述的高速离心分配色谱仪的转速优选1800r/min～2300r/min。

根据本发明第一方面的方法，所述的三元溶剂体系中乙酸乙酯、正丁醇和水的体积比优选(3～8)：2：(6～10)，进一步优选2：1：3。在一个实施方案中，所述三元溶剂体系中添加了有机酸，该有机酸在该三元溶剂体系中的浓度为0.1～0.5％(体积/体积百分比，在本文中涉及该有机酸的浓度时均是指体积/体积百分比)。优先地，该有机酸在该三元溶剂体系中的浓度为0.2～0.4％，例如0.3％。在一个实施方案中，所述选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸。已经出人意料地发现，在所述三元溶剂体系中添加微量的特定有机酸后，可以以高载药量进行分离纯化并获得高收率、高纯度的葛根素，从而大大提高了生产效率。

根据本发明第一方面的方法，本发明中，所述的高速离心分配色谱法优选将高速离心分配色谱法所采用的三元溶剂体系充分混合后分层，取下层溶液为固定相，上层溶液为流动相。进一步优选将固定相和流动相用过滤后超声备用，所述的过滤优选采用微孔滤膜过滤，所述的滤膜的孔径可以为0.3μm～0.5μm，所述的超声的时间优选15min～30min。所述的超声的频率优选16KHz～28KHz。

根据本发明第一方面的方法，所述的高速离心分配色谱法，优选将葛根素提取物溶解于上述固定相和流动相形成的混合溶液中，过滤后上样；所述的固定相和流动相形成的混合溶液中所述的流动相与所述的固定相的体积比优选1：1～1：5，例如1：4。所述的过滤优选采用微孔滤膜过滤，所述的滤膜的孔径可以为0.3μm～0.5μm(下文具体的实例中，如未另外说明，使用的是0.45um膜)。

根据本发明第一方面的方法，所述的葛根素提取物可以为采用普通超声提取法、循环超声提取法或者回流提取法得到的葛根素提取物。

根据本发明第一方面的方法，所述的葛根素提取物的纯度可以为10％～20％，优选15％～18％，所述的纯度是指葛根素的质量占葛根素提取物总质量的百分比。

根据本发明第一方面的方法，所述的高速离心分配色谱仪的流速为2.0mL/min～7.0mL/min，优选2.0mL/min～3.0mL/min；所述的流速是指每分钟内通过的流动相的体积。

根据本发明第一方面的方法，所述的高速离心分配色谱仪的上样浓度优选10mg/mL～60mg/mL；所述的上样浓度是指葛根素提取物的质量与流动相的体积的比例。

根据本发明第一方面的方法，所述的葛根素分离纯化方法，优选包括以下步骤：

步骤1：将三元溶剂体系充分混合后分层，取下层溶液为固定相、上层溶液为流动相；将葛根素 粗品溶解于固定相与流动相的混合溶液中，形成葛根素提取物的溶液；

步骤2：高速离心分配色谱仪在递减(descending)模式下充满固定相；转换成递增(ascending)模式后，再将流动相泵入离心分配色谱仪内；待体系平衡完毕后，由进样阀注入步骤1中制得的葛根素提取物的溶液，然后根据检测器图谱接收目标组分即可。

根据本发明第一方面的方法，所述步骤1中，优选将所述的固定相和流动相过滤后经超声处理后再用；所述的过滤优选通过微滤膜过滤，所述的滤膜的孔径可以为0.45μm。所述的超声的频率优选16KHz～28KHz，所述的超声的时间优选15min～30min。

根据本发明第一方面的方法，所述步骤1中，用于溶解葛根素提取物粗品的固定相与流动相的混合溶液，其中优选流动相与固定相的体积比为1：1～1：5，例如是1：4。

根据本发明第一方面的方法，所述步骤2中，所述的在高速离心分配色谱仪在递减模式下充满固定相，优选在高流速和低转速下进行，所述的高流速优选流速在5mL/min～10mL/min；所述的低转速优选转速在600r/min～800r/min。

根据本发明第一方面的方法，所述步骤2中，所述的转换成递增模式后，再将流动相泵入色谱柱中，转换成递增模式后优选提高转速至1800r/min～2300r/min。

根据本发明第一方面的方法，所述步骤2中，优选在接收目标组分后还包括除去溶剂，干燥得到葛根素单体的步骤。所述的除去溶剂优选在减压条件下进行，所述的除去溶剂的压强优选-0.01MPa～0.08MPa，所述的除去溶剂的温度70℃～75℃。所述的干燥条件优选在减压条件下进行，所述的干燥压强优选0.07MPa～0.09MPa，所述的干燥温度60℃～65℃。

根据本发明第一方面的方法，所述步骤2中，所述的高速离心分配色谱仪是指本领域中常规的转速为0～3000r/min的高速离心分配色谱仪，优选转速1500～3000r/min的高速离心分配色谱仪。

根据本发明第一方面的方法，所述葛根素提取物及本发明的分离纯化方法得到的葛根素用高效液相色谱进行分析检测，所述高效液相色谱的色谱条件为：Capcell Pak C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；以甲醇：水＝25：75(v/v)的混合溶剂为流动相；流速1mL/min；柱温：30℃；检测波长：250nm。结果表明，本发明的分离纯化方法能够制得纯度99％以上的葛根素单体。

进一步地，本发明第二方面提供了一种高纯度葛根素。该葛根素是通过本发明第一方面任一实施方案所述方法制得的。

在本发明上述制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此 外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

在本发明中，如未另外说明，使用到的试剂和原料均是从市场上购得。

葛根素是由豆科植物野葛或甘葛藤根中提出的一种黄酮苷。葛根素对肝脏系统的影响：葛根素含有皂苷类化合物，对肝组织免疫损害具有保护作用，C-29位羟基和C-5”含氧基团可增强保肝活性。葛根素通过胃吸收可保护肝损伤，诱导活化肝星状细胞凋亡，有效逆转化学诱导的肝纤维化，对四氯化碳诱导的急性肝损伤也具有保护作用，同时具有多方面的生理活性。葛根素对心血管系统的影响：葛根中的总黄酮能增加脑及冠状动脉的血流量。葛根素对动物和人体的脑循环以及外周循环有明显的促进作用。葛根总黄酮在改善高血压及冠心病患者的脑血管张力、弹性和博动性供应等方面均有温和的促进作用。葛根素不仅改善人体的正常脑微循环，而且对微循环障碍也有明显的改善作用，主要表现为局部微血管血流和运动的幅度增加。葛根素对突发性耳聋患者的甲皱微循环也有改善作用，能加快微血管血流速度，清除血管袢淤血，提高患者的听力。葛根素对缺氧心肌具有保护作用，葛根素能明显降低缺血心肌的耗氧量，保护心脏免受缺血再港灌注所致的超微结构损伤。

动物试验表明：(1)对平滑肌的影响：葛根中的多种总黄酮化合物有舒张平滑肌的作用，而收缩成分则可能为胆碱、乙酰胆碱和卡塞因R等物质；(2)对体温的影响：兔耳静脉注射过期伤寒菌苗人工发热，口服20％葛根煎剂或20％乙醇浸剂后，体温降低，浸剂作用尤为明显；(3)对心血管系统的影响：葛根对正常和高血压的动物有一定的降压作用。葛根总黄酮和葛根素有明显的扩张冠状动脉作用，可使正常和痉挛状态的冠状动脉扩张，于静脉注射30mg/kg后，冠脉血流量可增加40％，血管阻力降低29％。葛根素还可抑制凝血酶诱导的血小板中5-HT释放。

毒理方面：(1)葛根的酒浸膏、水溶性提取物、总黄酮和卡塞因R静脉注射的LD50(小鼠)分别为2.1±1.0，1.044、1.6～2.1和0.0375g/kg，静脉注射1g/kg葛根素不致小鼠死亡，小鼠腹腔注射0.8g/kg黄豆甙元无中毒症状；(2)小鼠每天口服酒浸膏10和20g/kg共3天，或一次口服黄豆甙元1和5g/kg，未见中毒症状。每天口服酒浸膏1g/kg或黄豆甙元25mg、50mg和100mg/kg连续2个月，狗每天口服酒浸膏2g/kg，连续14天，或黄豆甙元25和50mg/kg，连续2个月，不影响动物的行为，血常规、肝、肾功能及心、肝、脾、肺、肾等实质器官也无改变。

药代动力学方面，动物实验表明，随着给药剂量的增加(35→75→370mg/kg)，药物的消除半衰期 明显降低(11.8→10.4→4.7小时)。体内分布以肝、肾、心脏和血浆中较多，睾丸、肌肉、脾脏次之，并可通过血-脑脊液屏障进入中枢。本品消除较快，在体内不易蓄积。随着给药剂量的增加，药物的消除半衰期(Ti/2&szlig；)依次降低为(11.80,10.37,4.6hr)，分布半衰期依次增加为(0.53,0.64,0.67hr)，可通过血脑屏障，血浆蛋白结合率达24.60％。分别从尿。大便、胆汁中排泄。在体内分布广，消除快，不易积蓄。毒性低，无明显副作用。小鼠静脉注射葛根素，LD为634.3mg/kg，腹腔注射LD为1412.2mg/kg。大鼠腹腔注射葛根素150,100,50mg/kg连续5周，无积蓄性毒性，对心、肝、肺、脾、肾、肾上腺及肠等脏器无明显毒性。犬静脉注射葛根素，每日50,30,15mg/kg连续5周，再观察70天，对大小便常规、血常规、SGPT,BUN、血糖均无明显影响。健康成年SD大鼠实验，剂量为50,150mg/kg，对雌性大鼠胚胎及雄性大鼠生殖细胞均无致畸作用。致突变试验表明，葛根素没有潜在的致癌和致突变危险性。

本发明的积极进步效果在于：本发明的葛根素分离纯化方法步骤简单、分离时间短、分离能力强、分离到的葛根素纯度高(HPLC纯度大于99％)、回收率高(大于65％)、环境友好、分离效率明显比现有技术高，具有良好的市场开发前景。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。

下文制备步骤为了举例的目的，并基于各举例的可比较性而作了某些具体描述，本领域技术人员根据已有知识完全可以从中概括得到本发明方案。

实施例1：

(1)葛根素粗提物的制备

称取50g粉碎的野葛根(过20目筛)，加入40％乙醇下循环超声提取2次，每次30min，过滤，减压回收并干燥至恒重得葛根素粗提物，经检测葛根素质量百分含量在15％～19％，所述的质量百分含量是指葛根素的质量占葛根素提取物总质量的百分比。下面的实施例中使用到的葛根素粗提物即为本方法制备得到。

(2)溶剂系统的准备

将乙酸乙酯、正丁醇和水按体积比2：1：3混合成为三元溶剂系统；将该三元溶剂系统置于分液 漏斗中，充分振摇后静置分层，取下层溶液作为固定相、上层溶液作为流动相，将固定相和流动相用微孔滤膜(0.45um)过滤后，超声(20KHz)15min备用。实施例2、3和对比实施例1、2、3使用由此配制的三元溶剂系统和固定相、流动相进行试验。

(3)回收率计算公式

回收率＝分离的得到的葛根素单体的质量/进样样品中含有的葛根素的总质量×100％

实施例2

将实施例1制得的纯度为17.5％的葛根素提取物溶解于混合的溶液(流动相/固定相＝1/4)中，制成浓度为10mg/mL的样品溶液，0.45μm微滤膜过滤后备用；高速离心分配色谱仪中在递减模式下以流速8.0mL/min，转速600r/min充满固定相；转换成递增模式，提高转速至2200r/min后再将流动相以2mL/min的流速泵入色谱仪；待体系平衡完毕后，由进样阀注入样品溶液，然后根据检测器图谱接收目标物葛根素组分，在压强-0.01MPa，温度70℃下进行浓缩；设定压强0.08MPa，温度65℃进行干燥，制得葛根素单体。

使用以下高效液相色谱法，对本实施例2分离纯化前所用的作为原料的葛根素提取物、以及最终制得的葛根素单体进行葛根素纯度检测：所述的高效液相色谱的色谱条件为：Capcell Pak C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；以甲醇：水＝25：75(v/v)的混合溶剂为流动相；流速1mL/min；柱温：30℃；检测波长：250nm。结果显示：原料的葛根素提取物中葛根素HPLC纯度为17.5％，制得葛根素单体HPLC纯度为99.3％，回收率67％。

这表明本发明方法具有良好的回收率且产物纯度高。

实施例3

将实施例1制得的纯度为16.4％的葛根素提取物溶解于混合的溶液(流动相/固定相＝1/4)中，制成浓度为20mg/mL的样品溶液，孔径为0.45μm的微滤膜过滤后备用；高速离心分配色谱仪中在递减模式下以流速8.0mL/min，转速800rpm充满固定相；转换成递增模式，提高转速至1800rpm后再将流动相以2mL/min的流速泵入色谱仪；待体系平衡完毕后，由进样阀注入样品溶液，然后根据检测器图谱接收目标物葛根素组分，在压强-0.01MPa，温度70℃下进行浓缩，设定压强0.08MPa，温度65℃进行干燥后，制得葛根素单体。

使用实施例2所述HPLC法，对分离纯化前所用的作为原料的葛根素提取物、以及最终制得的葛根素单体进行葛根素纯度检测。结果显示：原料的葛根素提取物中葛根素HPLC纯度为16.4％，制得葛根素单体HPLC纯度为996％，回收率64％。与实施例2类似，可在约20分钟的时间内完成一批样 品的色谱分离纯化。

对比实施例1

采用实施例2中的相同的葛根素提取物和溶剂体系，将纯度为17.5％葛根素提取物溶解于混合的溶液(流动相/固定相＝1/4)中，制成浓度为10mg/mL的样品溶液，0.45μm微滤膜过滤后备用；采用乙酸乙酯/正丁醇/乙醇/水(4:0.6:0.6:5)为溶剂体系，转速2200r/min，流速2.0mL/min，按照实施例2中的步骤进行高速离心分配色谱分离纯化并进一步浓缩干燥，制备得到葛根素精制品。

使用实施例2所述HPLC法，对制得的葛根素精制品进行葛根素纯度检测。结果显示：原料的葛根素提取物中葛根素HPLC纯度为17.5％，制得葛根素精制品HPLC纯度为94.7％，回收率51％。这表明，与实施例2使用的三溶剂体系相比，四溶剂体系所得产物纯度明显偏低，且收率也明显地偏低。

对比实施例2

采用实施例2中的相同的葛根素提取物和溶剂体系，将纯度为17.5％的葛根素提取物溶解于混合的溶液(流动相/固定相＝1/4)中，分别制成浓度为35mg/mL和50mg/mL的样品溶液，0.45μm微滤膜过滤后备用；采用乙酸乙酯/正丁醇/水(2:1:3)溶剂体系，转速2200r/min，流速2.0mL/min，按照实施例2中的步骤进行高速离心分配色谱分离纯化并进一步浓缩干燥，制备得到葛根素精制品。

使用实施例2所述HPLC法，对制得的葛根素精制品进行葛根素纯度检测。结果显示：

原料的葛根素提取物中葛根素HPLC纯度为17.5％；

提取物以35mg/mL浓度上样所得葛根素精制品HPLC纯度为93.8％，回收率40％；

提取物以50mg/mL浓度上样所得葛根素精制品HPLC纯度为92.2％，回收率33％。

当提高上样浓度时有利于提高生产效率。然而上述结果表明，当提高上样浓度时，产品的纯度和回收率均会明显地降低。并且呈现上样浓度越高所得产品纯度越低、回收率亦更低的趋势。

对比实施例3

本例采用高速逆流色谱分离仪纯化葛根素与本发明的高速离心分配色谱分离仪纯化葛根素作对比。

采用实施例2中的相同的葛根素提取物和溶剂体系，将纯度为17.5％的葛根素提取物溶解于混合的溶液(流动相/固定相＝1/4)中，制成浓度为10mg/mL的样品溶液，孔径为0.45μm的微滤膜过滤后备用；以8mL/min的流速将固定相充满高速逆流色谱仪中，将转速调节为800r/min，在tail-to-head模式下，以2mL/min的流速泵入流动相，待平衡后，由进样阀注入浓度为10mg/mL的样品溶液，然后根 据检测器图谱接收目标物葛根素成分，接着进一步浓缩干燥，制备得到葛根素精制品。

使用实施例2所述HPLC法，对制得的葛根素精制品进行葛根素纯度检测。结果显示：

采用上述高速逆流色谱法所得葛根素精制品纯度仅83.2％、回收率仅为49％，并且色谱分离纯化一批试样所用时间达40分钟以上；然而如上文实施例2所述的，在约20分钟的分离纯化时间内，可实现产品纯度达99％以上，回收率达60％以上的优异效果。

溶剂系统的准备：将乙酸乙酯、正丁醇和水按体积比2：1：3混合，再向该混合液中加入0.3％(体积/体积百分比)甲酸，混合，成为三元溶剂系统；将该三元溶剂系统置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取下层溶液作为固定相、上层溶液作为流动相，将固定相和流动相用微孔滤膜(0.45um)过滤后，超声(20KHz)15min备用。以下实施例4、5、6、7使用由此配制的三元溶剂系统和固定相、流动相进行试验。

实施例4

将实施例1制得的纯度为17.5％的葛根素提取物溶解于混合的溶液(流动相/固定相＝1/4)中，制成浓度为10mg/mL的样品溶液，0.45μm微滤膜过滤后备用；高速离心分配色谱仪中在递减模式下以流速8.0mL/min，转速600r/min充满固定相；转换成递增模式，提高转速至2200r/min后再将流动相以2mL/min的流速泵入色谱仪；待体系平衡完毕后，由进样阀注入样品溶液，然后根据检测器图谱接收目标物葛根素组分，在压强-0.01MPa，温度70℃下进行浓缩；设定压强0.08MPa，温度65℃进行干燥，制得葛根素单体。

使用实施例2所述HPLC法，对分离纯化前所用的作为原料的葛根素提取物、以及最终制得的葛根素单体进行葛根素纯度检测。结果显示：原料的葛根素提取物中葛根素HPLC纯度为17.5％，制得葛根素单体HPLC纯度为99.5％，回收率73％。与实施例2类似，可在约20分钟的时间内完成一批样品的色谱分离纯化。

这表明本发明方法具有良好的回收率且产物纯度高。

实施例5

将实施例1制得的纯度为16.4％的葛根素提取物溶解于混合的溶液(流动相/固定相＝1/4)中，制成浓度为20mg/mL的样品溶液，孔径为0.45μm的微滤膜过滤后备用；高速离心分配色谱仪中在递减模式下以流速8.0mL/min，转速800rpm充满固定相；转换成递增模式，提高转速至1800rpm后再将流动相以2mL/min的流速泵入色谱仪；待体系平衡完毕后，由进样阀注入样品溶液，然后根据检测器图谱接收目标物葛根素组分，在压强-0.01MPa，温度70℃下进行浓缩，设定压强0.08MPa，温度65℃进行 干燥后，制得葛根素单体。

使用实施例2所述HPLC法，对分离纯化前所用的作为原料的葛根素提取物、以及最终制得的葛根素单体进行葛根素纯度检测。结果显示：原料的葛根素提取物中葛根素HPLC纯度为16.4％，制得葛根素单体HPLC纯度为99.4％，回收率71％。与实施例2类似，可在约20分钟的时间内完成一批样品的色谱分离纯化。

实施例6

将实施例1制得的纯度为17.5％的葛根素提取物溶解于混合的溶液(流动相/固定相＝1/4)中，制成浓度为20mg/mL、35mg/mL、50mg/mL的三种样品溶液，分别用0.45μm微滤膜过滤后备用；高速离心分配色谱仪中在递减模式下以流速8.0mL/min，转速600r/min充满固定相；转换成递增模式，提高转速至2200r/min后再将流动相以2mL/min的流速泵入色谱仪；待体系平衡完毕后，由进样阀注入样品溶液，然后根据检测器图谱接收目标物葛根素组分，在压强-0.01MPa，温度70℃下进行浓缩；设定压强0.08MPa，温度65℃进行干燥，制得葛根素单体。

使用实施例2所述HPLC法，对分离纯化前所用的作为原料的葛根素提取物、以及最终制得的葛根素单体进行葛根素纯度检测。结果显示：原料的葛根素提取物中葛根素HPLC纯度为17.5％；分别使用三种浓度溶液上样所制得的葛根素单体HPLC纯度均在99.4～99.7％范围内，回收率均在67～74％范围内。与实施例2类似，可在约20分钟的时间内完成一批样品的色谱分离纯化。这表明本发明方法具有良好的回收率且产物纯度高。并且与对比实施例2相比，使用添加了甲酸的三元溶剂可以适用于高浓度上样，这样将大大提高生产效率。

参照本实施例6的方法和条件，不同的是改用添加了0.2％或0.4％甲酸的三元溶剂系统，制得6批葛根素单体HPLC纯度均在99.4～99.6％范围内，回收率均在68～73％范围内。但是，参照本实施例6的方法和条件，不同的是改用乙酸作为有机酸，在三元溶剂系统中添加0.2％、0.3％和0.4％浓度乙酸所得的三元溶剂系统，并配制35mg/mL和50mg/mL两种浓度上样，制得6批葛根素单体HPLC纯度均在89.3～91.1％范围内，回收率均在30～42％范围内。这表明即使是使用具有类似性质的有机酸，却不能实现如甲酸那样高浓度上样以高生产效率获得高纯度、高收率的葛根素。

实施例7

将实施例1制得的纯度为16.4％的葛根素提取物溶解于混合的溶液(流动相/固定相＝1/4)中，制成浓度为40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL的三种样品溶液，分别孔径为0.45μm的微滤膜过滤后备用；高速离心分配色谱仪中在递减模式下以流速8.0mL/min，转速800rpm充满固定相；转换成递增模式， 提高转速至1800rpm后再将流动相以2mL/min的流速泵入色谱仪；待体系平衡完毕后，由进样阀注入样品溶液，然后根据检测器图谱接收目标物葛根素组分，在压强-0.01MPa，温度70℃下进行浓缩，设定压强0.08MPa，温度65℃进行干燥后，制得葛根素单体。

使用实施例2所述HPLC法，对分离纯化前所用的作为原料的葛根素提取物、以及最终制得的葛根素单体进行葛根素纯度检测。结果显示：原料的葛根素提取物中葛根素HPLC纯度为16.4％；分别使用三种浓度溶液上样所制得的葛根素单体HPLC纯度均在99.3～99.6％范围内，回收率均在67～72％范围内。与实施例3类似，可在约20分钟的时间内完成一批样品的色谱分离纯化。这表明本发明方法具有良好的回收率且产物纯度高。并且与对比实施例2相比，使用添加了甲酸的三元溶剂可以适用于高浓度上样，这样将大大提高生产效率。

Claims (15)

1.分离纯化葛根素的方法，其包括以下步骤：以乙酸乙酯、正丁醇和水组成的三元溶剂体系为分离溶剂体系，采用高速离心分配色谱法对葛根素提取物进行分离纯化，得到葛根素；所述的高速离心分配色谱法在高速离心分配色谱仪中进行；所述乙酸乙酯、正丁醇和水的体积比为2：1：3，且该三元溶剂体系中添加有0.2~0.4%甲酸。

2.根据权利要求1的方法，所述的高速离心分配色谱仪的转速为1800r/min～2300r/min。

3.根据权利要求1的方法，所述的高速离心分配色谱法中，将高速离心分配色谱法所采用的三元溶剂体系充分混合后分层，取下层溶液为固定相，上层溶液为流动相；进一步将固定相和流动相过滤后超声备用，所述的过滤采用微孔滤膜过滤，所述的滤膜的孔径为0.3μm～0.5μm，所述的超声的时间为15min～30min，所述的超声的频率为16KHz～28KHz。

4.根据权利要求3的方法，将葛根素提取物溶解于所述固定相和流动相形成的混合溶液中，过滤后上样；所述的固定相和流动相形成的混合溶液中所述的流动相与所述的固定相的体积比为1：4。

5.根据权利要求1的方法，所述的葛根素提取物为采用普通超声提取法、循环超声提取法或者回流提取法得到的葛根素提取物。

6.根据权利要求1的方法，所述的高速离心分配色谱仪的流速为2.0mL/min～7.0mL/min。

7.根据权利要求1的方法，所述的高速离心分配色谱仪的流速为2.0mL/min～3.0mL/min。

8.根据权利要求1的方法，所述的高速离心分配色谱仪的上样浓度为10mg/mL～60mg/mL。

9.根据权利要求1的方法，其包括以下步骤：

步骤1：将三元溶剂体系充分混合后分层，取下层溶液为固定相、上层溶液为流动相；将葛根素粗品溶解于固定相与流动相的混合溶液中，形成葛根素提取物的溶液；

步骤2：高速离心分配色谱仪在递减模式下充满固定相；转换成递增模式后，再将流动相泵入离心分配色谱仪内；待体系平衡完毕后，由进样阀注入步骤1中制得的葛根素提取物的溶液，然后根据检测器图谱接收目标组分即可。

10.根据权利要求9的方法，步骤1中，将所述的固定相和流动相过滤后经超声处理后再用；所述的过滤是通过微滤膜过滤，所述的滤膜的孔径为0.45μm，所述的超声的频率为16KHz～28KHz，所述的超声的时间为15min～30min。

11.根据权利要求9的方法，步骤1中，用于溶解葛根素提取物粗品的固定相与流动相的混合溶液，其中流动相与固定相的体积比为1：4。

12.根据权利要求9的方法，步骤2中，所述的在高速离心分配色谱仪在递减模式下充满固定相，在高流速和低转速下进行，所述的高流速是流速在5mL/min～10mL/min范围内；所述的低转速是转速在600r/min～800r/min范围内。

13.根据权利要求9的方法，步骤2中，所述的转换成递增模式后，再将流动相泵入离心分配色谱仪内，转换成递增模式后提高转速至1800r/min～2300r/min。

14.根据权利要求9的方法，步骤2中，在接收目标组分后还包括除去溶剂，干燥得到葛根素单体的步骤；所述的除去溶剂在减压条件下进行，所述的除去溶剂的压强为-0.01MPa～0.08MPa，所述的除去溶剂的温度70℃～75℃；所述的干燥条件是在减压条件下进行，所述的干燥压强为0.07MPa～0.09MPa，所述的干燥温度为60℃～65℃。

15.根据权利要求9的方法，步骤2中，所述的高速离心分配色谱仪是转速1500～3000r/min的高速离心分配色谱仪。