CN105367615B - 一种大豆苷的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大豆苷的分离纯化方法，包括以下步骤：以乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水所组成的四元溶剂体系作为分离溶剂体系，采用高速离心分配色谱法对葛根黄酮提取物进行分离纯化，即可；所述的四元溶剂体系中，所述的乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水的体积比为20:(3‑5):(2‑3):(20‑25)；所述的高速离心分配色谱法在高速离心分配色谱仪中进行。本发明大豆苷的分离纯化方法，分离时间短、分离能力强、分离到的大豆苷纯度高，并且溶剂消耗量小。
Description
技术领域
本发明涉及一种大豆苷的分离纯化方法。
背景技术
葛根为豆科植物葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根，习称野葛，系常用中药，具有解肌退热，生津止渴，透疹，升阳止泻，通经活络，解酒毒之功效。葛根含有多种有效成分，其中黄酮类化合物是其主要有效成分。葛根黄酮药理活性十分广泛，如其中的主要化合物葛根素具有降血脂，抗炎，抗心律失常、对心肌缺血的保护作用、肾保护、抗氧化、抗缺血再灌注损伤、抗肝缺血再灌注损伤、抗酒精中枢抑制、调控骨代谢、降血糖、利尿等作用。
随着葛根黄酮的药理作用的研究深入，对葛根黄酮的分离纯化也越来越受到人们的重视，而目前人们主要关注的是葛根素及大豆苷元的分离纯化研究，而对葛根中另一黄酮类成分大豆苷研究的文献及专利均较少，其大豆苷的结构式如下：
目前，现有技术中的分离纯化技术仍比较落后，多采用传统分离纯化方法，如系统溶剂法、萃取法、柱色谱法等，而这些方法多存在步骤繁琐、周期长、效率低、溶剂消耗量大等缺点，因此开发一种高效、环保的分离纯化方法有望成为研究热点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中大豆苷的分离纯化方法分离纯化效果差、步骤繁琐、周期长、效率低、溶剂消耗量大等缺陷，提供一种完全新的从大豆苷的分离纯化单体的方法。本发明方法能够得到较高纯度(大于92.5％)的大豆苷单体纯品，能够实现一步分离纯化，适用于不同的葛根黄酮粗品，并能够快速、高效地实现分离。
本发明提供了一种大豆苷的分离纯化方法，包括以下步骤：以乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水所组成的四元溶剂体系作为分离溶剂体系，采用高速离心分配色谱法对葛根黄酮提取物进行分离纯化，即可；其中，所述的四元溶剂体系中，所述的乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水的体积比为20:(3-5):(2-3):(20-25)；所述的高速离心分配色谱法在高速离心分配色谱仪中进行。
本发明中，所述的葛根黄酮提取物是指按本发明常规提取法提取葛根得到的葛根黄酮提取物，一般采用普通超声提取法、循环超声提取法或者回流提取法提取葛根即可得葛根黄酮粗提物。本发明中，所述的葛根黄酮提取物(按葛根素含量计)其纯度可以为5％～75％，所述的纯度是指葛根素的质量占葛根黄酮粗提物总质量的百分比。
本发明中，所述的高速离心分配色谱法(Fast centrifugal partitionchromatography，FCPC)是属于现代逆流色谱的范畴，是一种液液分配技术，它利用不同物质在两相不混溶的溶液中的分配系数不同，经过类似连续萃取的过程，对物质进行分离。如今FCPC已广泛应用于化学、医药、农业、石油、生物工程、食品工程等十几个领域，尤其在天然活性产物分离纯化方面应用广泛，并成功分离多种化合物。
本发明中，所述的高速离心分配色谱仪为本领域常规的高速离心分配色谱仪，一般转速可调节600-2000r/min的高速离心分配色谱仪都可以，较佳地为转速可调节1000-1800r/min的高速离心分配色谱仪，更佳地为法国RousseletRobatel型号为FCPC A的高速离心分配色谱仪。
本发明中，所述的高速离心分配色谱法较佳地包括如下步骤：
(1)S1、将所述的四元溶剂体系混合均匀、分层，取下层溶液作为高速离心分配色谱法中的固定相，取上层溶液作为高速离心分配色谱法中的流动相；
S2、制备样品：将葛根黄酮提取物溶解于混合溶液中；其中，所述的混合溶液是所述四元溶剂体系混合分层后的下层溶液和上层溶液各取一部分后混合而得的；
步骤S1、S2顺序不分先后；
(2)固定相加入至所述高速离心分配色谱仪后，加入流动相，达到体系平衡；其中，流动相的流速为2.0-7.0ml/min；
(3)将样品加入至高速离心分配色谱仪分离纯化，即可。
本发明中，较佳地，步骤S1中所述的下层溶液还经过过滤、超声处理后作为高速离心分配色谱法中的固定相；所述的上层溶液还经过过滤、超声处理后作为高速离心分配色谱法中的流动相。其中，所述的过滤较佳地为微孔滤膜过滤，滤膜的孔径较佳地为0.3-0.5μm，更佳地为0.45μm。所述的超声处理的频率较佳地为16-28KHz，超声处理的时间较佳地为15-30min。
步骤(1)中，所述的混合溶液中，所述的下层溶液和所述上层溶液的体积比较佳地为1:1-1:5，更佳地为1:4。
本发明中，所述的样品还经过滤后，再加入至高速离心分配色谱仪进行分离纯化。所述的过滤较佳地为微孔滤膜过滤，滤膜的孔径较佳地为0.3-0.5μm。
本发明中，所述的样品中，所述葛根黄酮提取物和所述混合溶液的质量体积比为7-15mg/ml。
步骤(2)中，加入固定相的时候，固定相的流速较佳地为20-50ml/min，所述的高速离心分配色谱仪的转速为600-800rpm/min；当加入流动相的时候，所述的高速离心分配色谱仪的转速提高至1200-1500r/min。
步骤(2)中，所述的流动相的流速较佳地为2.0-3.0ml/min。
本发明中，较佳地，步骤(3)分离纯化后还进行去除溶剂过程和干燥过程。所述去除溶剂过程为本领域常规过程，较佳地在压强-0.01-0.08Mpa、温度70-75℃条件下进行去除溶剂。所述的干燥过程中的温度较佳地为60-65℃。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的分离纯化方法采用高速离心分配色谱仪对葛根黄酮粗提物进行分离纯化，分离时间短、分离能力强、分离到的大豆苷纯度高(HPLC纯度92.5％～99％)，并且溶剂消耗量小、环境友好，具有良好的市场开发前景。本发明能够适合于不同的葛根黄酮粗品，具有技术先进、分离效率高、分离时间短、产品纯度高等优点。
附图说明
图1为经本发明分离纯化前，葛根黄酮粗提物(按葛根素计)纯度16％～18％的高效液相色谱图。
图2为经本发明分离纯化前，葛根黄酮粗提物(按葛根素计)纯度50％～70％的高效液相色谱图。
图3为经本发明分离纯化后，大豆苷单体的高效液相色谱图。
图4为本发明实施例1高速离心分配色谱的色谱图。
图5为本发明实施例2高速离心分配色谱的色谱图。
图6为本发明实施例3高速离心分配色谱的色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明下述实施例中使用的葛根黄酮粗提物的制备：
称取50g粉碎的野葛根(过20目筛)，加入40％乙醇下循环超声提取2次，每次30min，过滤，减压回收并干燥至恒重得葛根黄酮粗提物，按葛根素的纯度计，经检测葛根素质量百分含量在16％～18％，所述的质量百分含量是指葛根素的质量占葛根素提取物总质量的百分比。
得到葛根素纯度16％～18％的葛根黄酮粗提物，加入4％盐酸在80℃下，水解2h，氨水中和至5～6，过滤后，经D101大孔吸附树脂吸附洗脱后，洗脱液减压回收并干燥至恒重得到葛根黄酮粗提物，按葛根素的纯度计，经检测葛根素质量百分含量在50％～70％，所述的质量百分含量是指葛根素的质量占葛根素提取物总质量的百分比。
实施例1
(1)将乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水按体积比20：4：2：20混合，置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取下层溶液为固定相、上层溶液为流动相，将固定相和流动相用微滤膜过滤后超声15min备用。将纯度为16.3％(葛根素计)的葛根黄酮粗提物溶解于混合的溶液(流动相/固定相＝1/4)中，制成浓度为10mg/mL的样品溶液(进样环10ml)，0.45μm微滤膜过滤后备用；
(2)高速离心分配色谱仪中在ascending模式下以流速20.0mL/min，转速600r/min充满固定相；在ascending模式，提高转速至1400r/min后再将流动相以2.0mL/min的流速泵入色谱仪；待体系平衡完毕后，由进样阀注入样品溶液，然后根据检测器图谱(见图4)接收目标组分，在压强-0.01MPa，温度70℃下进行浓缩；设定压强0.08MPa，温度65℃进行干燥，制得大豆苷单体，HPLC纯度为92.5％，得到大豆苷8mg。
高效液相色谱法(HPLC)对目标组分进行纯度检测：对分离纯化前的葛根黄酮粗提物和制得的大豆苷单体用高效液相色谱分析，所述的高效液相色谱的色谱条件为：CapcellPak C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；以甲醇：水＝25：75(v/v)的混合溶剂为流动相；流速1ml/min；柱温：30℃；检测波长：250nm。结果见图1、图2及图3。
此外，将上述分离得到的大豆苷纯品用Q-TOF micro YAO19型飞行时间质谱仪、INOVA-400核磁共振仪进行MS及1H-NMR进行分析，其氘代溶剂为二甲基亚砜。结果如表1所示。
表1 大豆苷纯品的MS及1H-NMR检测数据
| MS | [M+Na]<sup>+</sup> | [M-H]<sup>-</sup> |
| 439.24 | 415.16 | |
| <sup>1</sup>H-NMR | H的位置 | 位移值(δ/ppm) |
| 2 | 8.36 | |
| 5 | 8.04 | |
| 6 | 7.13 | |
| 8 | 7.22 | |
| 2’ | 7.42 | |
| 3’ | 6.83 | |
| 4’-OH | 9.46 | |
| Glc-1” | 5.09 |
实施例2
(1)将乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水按体积比20：3：3：25混合，置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取下层溶液为固定相、上层溶液为流动相，将固定相和流动相用微滤膜过滤后超声15min备用。将纯度为16.3％(按葛根素计)的葛根黄酮粗提物溶解于混合的溶液(流动相/固定相＝1/4)中，制成浓度为12.5mg/mL的样品溶液(进样环10mL)，孔径为0.45μm的微滤膜过滤后备用；
(2)高速离心分配色谱仪中在ascending模式下以流速30.0mL/min，转速800rpm充满固定相；在ascending模式，提高转速至1450rpm后再将流动相以3.0mL/min的流速泵入色谱仪；待体系平衡完毕后，由进样阀注入样品溶液，然后根据检测器图谱(见图5)接收目标组分，在压强-0.01MPa，温度70℃下进行浓缩，设定压强0.08MPa，温度65℃进行干燥后，制得大豆苷单体，纯度为95％，大豆苷质量10mg。
实施例3
(1)将乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水按体积比20：4：2：20混合，置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取下层溶液为固定相、上层溶液为流动相，将固定相和流动相用微滤膜过滤后超声15min备用。将纯度为56％(葛根素计)的葛根黄酮粗提物溶解于混合的溶液(流动相/固定相＝1/4)中，制成浓度为10mg/mL的样品溶液(进样环10ml)，0.45μm微滤膜过滤后备用；
(2)高速离心分配色谱仪中在ascending模式下以流速20.0mL/min，转速600 r/min充满固定相；在ascending模式，提高转速至1400r/min后再将流动相以3.0mL/min的流速泵入色谱仪；待体系平衡完毕后，由进样阀注入样品溶液，然后根据检测器图谱(见图6)接收目标组分，在压强-0.01MPa，温度70℃下进行浓缩；设定压强0.08MPa，温度65℃进行干燥，制得大豆苷单体，HPLC纯度为92.5％，得到大豆苷7mg。
对比例1
不同溶剂体系与限定的溶剂体系对大豆苷分离效果比较。
将葛根黄酮粗提物纯度16.3％(按葛根素计)溶解于乙酸乙酯/正丁醇/水(4：1：5)为溶剂体系分层后将上层和下层溶液混合的溶液(流动相/固定相＝1/4)中，制成浓度为10mg/ml的样品溶液，0.45μm微滤膜过滤后备用；采用乙酸乙酯/正丁醇/水(4：1：5)为溶剂体系，将此溶剂体系的固定相加入高速离心分配色谱仪后，将此溶剂体系的流动相以转速1400r/min，流速3.0ml/min的条件，按照实施例1中的步骤顺序进行高速离心分配色谱分离纯化制备得到大豆苷，其结果为：纯度为85％，得到大豆苷6mg。具体结果见表2。
表2 不同溶剂体系对大豆苷分离效果的影响
对比例2
不同浓度葛根黄酮粗提物溶液与限定范围内葛根黄酮粗提物浓度对大豆苷分离效果的比较。
采用实施例1中的相同的葛根黄酮粗提物和溶剂体系，将葛根黄酮粗提物纯度16.3％(按葛根素计)溶解于混合的溶液(流动相/固定相＝1/4)中，分别制成浓度为5、20、25mg/ml的样品溶液，0.45μm微滤膜过滤后备用；采用乙酸乙酯/正丁醇/乙醇/水(20:4:2:20)溶剂体系，以转速1400r/min，流动相流速3.0ml/min的条件，按照实施例1中的步骤顺序进行高速离心分配色谱分离纯化制备得到大豆苷，其结果见表3。
表3 不同浓度上样对分离得到的大豆苷纯度的影响
| 葛根黄酮上样浓度 | 大豆苷纯度 |
| 5mg/ml | 无色谱图显示 |
| 20mg/ml | 85％ |
| 25mg/ml | 80％ |
Claims (14)
1.一种大豆苷的分离纯化方法，包括以下步骤：以乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水所组成的四元溶剂体系作为分离溶剂体系，采用高速离心分配色谱法对葛根黄酮提取物进行分离纯化，即可；其中，所述的四元溶剂体系中，所述的乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水的体积比为20:(3-5):(2-3):(20-25)；所述的高速离心分配色谱法在高速离心分配色谱仪中进行；
所述的高速离心分配色谱法包括如下步骤：
(1)S1、将所述的四元溶剂体系混合均匀、分层，取下层溶液作为高速离心分配色谱法中的固定相，取上层溶液作为高速离心分配色谱法中的流动相；
S2、制备样品：将葛根黄酮提取物溶解于混合溶液中；其中，所述的混合溶液是所述四元溶剂体系混合分层后的下层溶液和上层溶液各取一部分后混合而得的；
步骤S1、S2顺序不分先后；
(2)固定相加入至所述高速离心分配色谱仪后，加入流动相，达到体系平衡；
(3)将样品加入至高速离心分配色谱仪分离纯化，即可；
所述的混合溶液中，所述的下层溶液和所述上层溶液的体积比为1:1-1:5；
所述的样品中所述葛根黄酮提取物和混合溶液的质量体积比为7-15mg/ml。
2.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述的高速离心分配色谱仪为转速可调节1000-1800r/min的高速离心分配色谱仪。
3.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述的高速离心分配色谱仪为法国RousseletRobatel型号为FCPC A的高速离心分配色谱仪。
4.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述流动相的流速为2.0-7.0mL/min。
5.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤S1所述的下层溶液还经过过滤、超声处理后作为高速离心分配色谱法中的固定相；所述的上层溶液还经过过滤、超声处理后作为高速离心分配色谱法中的流动相。
6.如权利要求5所述的分离纯化方法，其特征在于，所述的过滤为微孔滤膜过滤；所述的超声处理的频率为16-28KHz，超声处理的时间为15-30min。
7.如权利要求6所述的分离纯化方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为0.3-0.5μm。
8.如权利要求6所述的分离纯化方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为0.45μm。
9.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述的混合溶液中，所述的下层溶液和所述上层溶液的体积比为为1:4。
10.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述的样品还经过滤后，再加入至高速离心分配色谱仪进行分离纯化；其中，所述的过滤为微孔滤膜过滤，滤膜的孔径为0.3-0.5μm。
11.如权利要求4所述的分离纯化方法，其特征在于，所述的流动相的流速为2.0-3.0mL/min。
12.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，加入固定相的时候，固定相的流速为20-50ml/min，所述的高速离心分配色谱仪的转速为600-800rpm/min；当加入流动相的时候，所述的高速离心分配色谱仪的转速提高至1200-1500r/min。
13.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)分离纯化后还进行去除溶剂过程和干燥过程。
14.如权利要求13所述的分离纯化方法，其特征在于，所述去除溶剂过程为在压强-0.01-0.08MPa、温度70-75℃条件下进行去除溶剂；所述的干燥过程中的温度为60-65℃。
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