CN106146278B - 一种从菌渣中提取分离辅酶q10的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从菌渣中提取制备高纯度辅酶Q10的工艺，以菌渣为原料进行渗漉提取得辅酶Q10渗漉提取液，将辅酶Q10提取液经多级萃取进行除杂得萃余液，再将萃余液进行结晶处理，最终得到了纯度达98％以上的高纯度辅酶Q10，收率为95％以上，整个工艺简单可靠、易操作，易于实现，参数便于控制。
Description
技术领域
本发明属化学工程技术领域，特别涉及一种从菌渣中提取高纯度辅酶Q10的工艺流程。具体而言，是利用渗漉提取、萃取除杂及结晶等组合分离工序，从菌渣中提取分离得到高纯度辅酶Q10精品。
背景技术
辅酶Q类化合物是一种广泛存在自然界的脂溶性醌类化合物，人体内存在的是辅酶Q10，其标准命名为2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基-苯醌。其结构式如下：
辅酶Q10广泛存在于生物体细胞内，具有重要的生理功能活性。辅酶Q10是能量代谢的必需组分，其主要作用是在呼吸过程中发挥传递质子和电子载体的作用，以此产生便于穿过生物膜的电势差，进一步推动电子与质子的转移。
辅酶Q10具有清除自由基和抗氧化、增强人体免疫力和抗肿瘤、加强心脏动力和增强脑力以及调节血脂等生理功能。因此辅酶Q10在医学上有较好的应用，主要被用于治疗心血管疾病、慢性肝炎、乳腺癌、乙型脑炎、神经系统疾病以及皮肤性疾病等。另一方面，辅酶Q10也被广泛地应用于食品、保健品中，如被作为食品添加剂应用到饮料、糖果、糕点等食品生产中，用作一种非处方药和功能性食品，添加到多种复合维生素、矿物质的运动型饮料中，直接添加到乳酪、酸奶和牛奶等。此外，辅酶Q10作为一种天然的抗氧化剂，可以清除自由基，延缓皮肤衰老，近年来还被较多的应用于化妆品中，如将辅酶Q10添加到眼霜以及用于紧致、美白皮肤的化妆品中。随着对辅酶Q10功能的深入研究，其在医药品、化妆品、食品以及保健品领域都将有更加广阔的应用前景。
辅酶Q10广泛存在于动植物体中，如大豆、鱼类、猪肉、羊肉、牛肉以及奶类等。目前，生产辅酶Q10的来源除天然来源外，还包括化学合成、植物细胞培养以及微生物发酵法等。天然来源中辅酶Q10的含量相对较低，而微生物发酵法通过培育高效菌种，能大大提高辅酶Q10的产量，更适合作为生产辅酶Q10的来源。
现有技术中，从发酵菌体中提取制备高纯度辅酶Q10的工艺主要包括从原料中提取得到粗提物以及粗提物的纯化精制。公开号为CN102557912A的中国专利文献公开了一种皂化法制备辅酶Q10粗提物的方法。用碱液皂化辅酶Q10提取液，有机相水洗后得到皂化后的提取液，用于进一步的纯化精制。此工艺能在一定程度上提高辅酶Q10粗提物的纯度，但是工艺过程中有机溶剂消耗量大，产生大量皂化废水和洗涤废水，严重污染环境，是环境非友好型工艺。同时，处理后得到的浓缩物中辅酶Q10含量为58％，纯度不高。公开号为CN103819326A的中国专利文献公开了一种超声破碎提取、层析纯化制备辅酶Q10的方法。此工艺能制备得到辅酶Q10，但是工艺过程中有机溶剂耗量大，层析纯化过程消耗的大量硅胶重复利用次数低，严重污染环境，是环境非友好型工艺。
因此，现有的从菌渣中提取、纯化辅酶Q10的工艺，都还存在着一定的缺点，应用于工业化生产存在溶剂、硅胶耗量大，废水、固废污染大等问题。因而需要在现有技术的基础上，简化、优化工艺，寻找到一种工艺简单、低成本、高收率的从菌渣中提取高纯度辅酶Q10的方法。
发明内容
本发明提供了一种从菌渣中提取制备高纯度辅酶Q10的工艺，最终得到了纯度98％以上的高纯度辅酶Q10，收率为95％以上，整个工艺简单可靠、易操作，易于实现，参数便于控制。
一种从菌渣中提取制备高纯度辅酶Q10的工艺，包括如下步骤：
(1)渗漉提取：将菌渣进行渗漉提取，收集含辅酶Q10的渗漉液。
步骤(1)所述渗漉提取过程如下：
将菌渣装入渗漉柱，向渗漉柱中加入正己烷，5～30℃下浸泡90～120min，保温状态下，在渗漉柱中进行渗漉操作，收集出口处含辅酶Q10的渗漉液，并同时以0.5～3BV/h的流速向渗漉柱中连续补加提取剂，直至收集到的渗漉液的体积为4～6BV。
优选地，浸泡时加入的提取溶剂的体积为0.6～1BV。
步骤(1)中在5～30℃下用正己烷提取，辅酶Q10在该温度下的正己烷中溶解度较大，而菌渣中其他成分在其中的溶解度相对较小，因此该温度下，辅酶Q10的提取率高，而杂质的含量低，从而在提高辅酶Q10提取率的同时提高提取物中辅酶Q10的含量。辅酶Q10的提取率能达到95％以上，渗漉提取液中辅酶Q10的质量百分比为65％～75％(以干基为基准)，提取液中同时含有还原型辅酶Q10、辅酶Q10异构体等杂质。最优选在10℃操作温度下，用正己烷提取。
将原料菌渣浸泡90～120min，使菌渣充分溶胀，渗漉时需保证菌渣能够完全浸泡在提取溶剂中。保温状态下在收集渗漉液的同时向渗漉柱中连续补加提取溶剂，从而在保证辅酶Q10高提取率的同时减少溶剂消耗，并降低回收溶剂的能耗。连续补加的提取溶剂流速优选为0.5～3BV/h。在该流速范围内，既可以保证提取溶剂和菌渣有充分的接触时间，提高溶剂的利用率，又能兼顾生产能力。
该步骤中为了提高溶剂的利用效率，可对溶剂按以下方式进行回收处理：收集得到的渗漉液浓缩成固态粗提物的过程中，回收分离出的溶剂，其在下次渗漉过程中可作为新鲜溶剂重复利用。
(2)萃取除杂：将步骤(1)所得渗漉液经浓缩除溶剂处理得到固态粗产物，将所述固态粗产物溶解在有机溶剂A中得萃取原料液，原料液用有机溶剂B多级萃取，收集多级萃取后的萃余液。
优选地，该步骤中所述有机溶剂A为正己烷、正庚烷和石油醚中的任一种，固态粗产品溶解后的原料液体积不大于最初渗漉液体积的20％。若原料液中固态粗产物浓度过低，多级萃取除杂操作处理能力低，不利于工业化应用。因此需将原料液中固态粗产物浓度控制在较合适的范围内，优选地，原料液中固态粗产物的浓度为50～700mg/mL，进一步优选为200～500mg/mL。
进一步优选正己烷，可得到溶解较好的澄清原料液。
优选地，该步骤中萃取所用有机溶剂B为甲醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜中的任一种，有机溶剂的单级用量为原料液体积的0.5～1.5倍。
进一步优选N,N-二甲基甲酰胺，单级用量为原料液体积的0.5～1.5倍，可萃取脱除大部分杂质，正己烷相逐渐从深棕色变成黄色，N,N-二甲基甲酰胺相变成深褐色。
优选地，该步骤中所述多级萃取操作包括但不仅限于多级逆流萃取、多级错流萃取、多级分馏萃取等，优选萃取级数2～10级。多级萃取可以提高杂质脱除效果，且将萃取级数控制在合理范围内，兼顾除杂效率和辅酶Q10回收率。
该步骤中单级萃取结束后静置10～60min分层后分离得到两相。相比于皂化等除杂工艺，设备及操作更为简单，溶剂耗量以及产生的废水量大大减少，更加环境友好，且除杂效果明显。
(3)结晶：将步骤(2)得到的萃余液进行浓缩，有机溶剂溶解后，冷却结晶，得到辅酶Q10精品。
步骤(3)所述结晶过程如下：
将步骤(2)所得萃余液浓缩除去溶剂，在20～70℃下添加有机溶剂至刚好完全溶解，再将温度逐步降至-5～5℃，冷却结晶12～36小时后过滤，滤饼洗涤后在20～40℃真空干燥得到纯度达98％以上的辅酶Q10精品。结晶母液可并入萃取原料液中，进行多级萃取处理，以提高辅酶Q10的回收率。
优选的，该步骤中所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、正庚烷或任意两种的混合物，加入量和浓缩后固体的比例为(20～80)L：1kg。该步骤中所用有机溶剂最优选为乙醇，溶解温度40～60℃，加入量为40～70L：1kg。
优选地，该步骤中降温幅度为0.5～3℃/min，结晶温度为-5～5℃，进一步优选为-5～0℃，最优选为0℃。
本发明中所涉及到的术语意义具体解释如下：
BV：床层体积，将菌渣湿法装填入渗漉柱，菌渣处于自由堆积状态下的体积。
固形物浓度100mg/mL的溶液，是指每毫升溶液浓缩至质量不变时含有100mg固形物，由于溶液成分复杂，会有一定的不溶物质，计算总质量时指的是整个体系的总质量，包括悬浮或沉淀的质量。
干基是指溶液干燥后得到的固体的质量，即溶液中的全部溶质的质量总和。
本发明的工艺采用低温渗漉法代替溶剂浸取法从菌渣中提取辅酶Q10大大降低了提取过程的溶剂消耗和废液产出，采用多级萃取纯化了菌渣粗提物大大降低了杂质含量，避免了皂化纯化及柱层析纯化的高污染，且利于直接结晶得到高纯度的产品，在简单工艺和低成本的条件下可获得高的辅酶Q10提取率。
本发明中采用渗漉法从菌渣中提取辅酶Q10，与常规的溶剂浸取法相比，渗漉过程中始终保持着原料内外最大的浓度梯度，可以加速溶出传质，显著提高提取速率、降低溶剂消耗，使辅酶Q10提取率达到95％以上，渗漉提取液中辅酶Q10的质量百分比(以干基为准)在65％～75％之间。
本发明采用多级萃取脱除提取物中的大部分杂质，利用N,N-二甲基甲酰胺等有机溶剂对还原型辅酶Q10等杂质萃取能力强于辅酶Q10的特点，选择性地萃取杂质，达到脱除大部分杂质的效果。相比于提取液皂化纯化，所需操作简单，溶剂耗量低，废液产出少，成本更为低廉，也更环境友好。且处理后辅酶Q10含量更高，不需要再进行树脂吸附、硅胶柱层析纯化等操作即可直接结晶，缩短了操作流程，溶剂耗量低，无大量硅胶等固废的产生。
并采用一次结晶便可得到纯度达98％以上的辅酶Q10精品，降低了多次重结晶中辅酶Q10的损失，提高了辅酶Q10的收率。
总的来说，本发明将以上三道工序结合起来从菌渣中提取提纯辅酶Q10的技术，相对现有技术所具有的有益效果如下：
本发明的工艺路线短，对生产设备要求低，操作简单；本工艺路线中的各溶剂均可回收，因此本工艺中大多数的原料均可重复利用；萃取步骤使杂质含量大大降低；避免了皂化纯化、树脂吸附和硅胶柱层析操作，节省了溶剂和硅胶，减少废弃物产出；工艺流程短，各个阶段回收率较高，总回收率较高。本工艺路线中工艺流程简单、生产成本低、生产效率高，污染少，易于工业化大规模生产。
附图说明
图1为根据本发明建立的测定纯品辅酶Q10浓度方法而得到的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面结合一种从菌渣中提取高纯度辅酶Q10的制备方法和测试结果对本发明进一步说明。
实施例1
(1)称取菌渣(其中，辅酶Q10质量百分比为2.6％)70g，湿法装填入渗漉柱(Φ2.0×35cm)内，装填均匀后其堆积体积约为100mL，10℃恒温浸泡2h，使其充分溶胀，开启渗漉柱出口阀，并同时从柱顶连续加入正己烷，控制流速2.5～3.0mL/min，直至收集的渗漉液体积为530mL。
重复多次收集足够的渗漉液作为后续操作的原料液，经分析，固形物浓度为4.7mg/mL，辅酶Q10含量为72.1％，提取率为98.7％。
(2)将渗漉液浓缩除去溶剂，加正己烷溶解，配制成固形物浓度300mg/mL的溶液。取20ml该溶液，进行三级错流萃取，每级加入等量N,N-二甲基甲酰胺作萃取剂。萃取平衡后，分析萃余液正己烷相，三级萃取后正己烷相中辅酶Q10含量为92.9％，固形物浓度为199.6mg/mL，此萃取工艺三级错流萃取辅酶Q10总回收率为85.7％。
(3)将萃取后萃余液浓缩，在30℃下添加正己烷至刚好完全溶解，固液比1:20，再将温度逐步降至5℃，冷却结晶24h后过滤，并用适量冷乙醇洗涤。充分抽干后，放入真空干燥箱中30℃干燥6h，得3.414g黄色辅酶Q10精品，纯度为98.0％，以菌渣中辅酶Q10为基准，整个工艺辅酶Q10的收率为77.8％。结晶后的母液可再进一步循环套用至萃取分离步骤，结晶阶段回收率可以100％计算，从而使工艺总收率提高至84.6％。
实施例2
(1)操作方法同实施例1。
(2)将渗漉液浓缩除去溶剂，加正己烷溶解，配制成固形物浓度300mg/mL的溶液。取20ml该溶液，等量N,N-二甲基甲酰胺作萃取剂进行五级逆流萃取。萃取平衡后，分析萃余液正己烷相，五级萃取后正己烷相中辅酶Q10含量为94.3％，固形物浓度为205mg/mL，此萃取工艺五级逆流萃取辅酶Q10总回收率为89.4％。
(3)将萃取后萃余液浓缩，在30℃下添加丙酮至刚好完全溶解，固液比1:25，再将温度逐步降至5℃，冷却结晶24h后过滤，并用适量冷乙醇洗涤。充分抽干后，放入真空干燥箱中30℃干燥6h，得3.571g黄色辅酶Q10精品，纯度为98.7％，以菌渣中辅酶Q10为基准，整个工艺辅酶Q10的收率为81.5％。结晶后的母液可再进一步循环套用至萃取分离步骤，结晶阶段回收率可以100％计算，从而使工艺总收率提高至88.2％。
实施例3
(1)操作方法同实施例1。
(2)将渗漉液浓缩除去溶剂，加正己烷溶解，配制成固形物浓度300mg/mL的溶液。取20ml该溶液，用等量N,N-二甲基甲酰胺作萃取剂，正己烷作洗涤剂，进行六级分馏萃取。具体过程为：分馏萃取分为萃取段三级和洗涤段三级，萃取剂从萃取段第一级进入分馏萃取体系，原料液从萃取段的最后一级进入分馏萃取体系，洗涤剂从洗涤段第一级进入分馏萃取体系，在洗涤段最后一级并入原料液一起进入萃取段，萃取相和洗涤相进行多级逆流萃取，从洗涤段的第一级流出萃取液，从萃取段的第一级流出富含辅酶Q10的萃余液。分析萃余液，萃取后正己烷相中辅酶Q10含量为96.4％，固形物浓度为217mg/mL，此萃取工艺六级分馏萃取辅酶Q10总回收率为96.5％。
(3)将萃取后萃余液浓缩，在50℃下添加乙醇至刚好完全溶解，固液比1:50，再将温度逐步降至0℃，冷却结晶24h后过滤，并用适量冷乙醇洗涤。充分抽干后，放入真空干燥箱中30℃干燥6h，得3.966g黄色辅酶Q10精品，纯度为98.0％，以菌渣中辅酶Q10为基准，整个工艺辅酶Q10的收率为90.5％。结晶后的母液可再进一步循环套用至萃取分离步骤，结晶阶段回收率可以100％计算，从而使工艺总收率提高至95.2％。
辅酶Q10浓度测定方法
以上实施例均采用以下方法测试辅酶Q10的浓度。
采用美国WATERS高效液相色谱仪建立HPLC分析方法，检测器为紫外检测器；色谱柱为：WATERS Atlantis T3column(250mm×4.6mm,5μm)；进液量：10μL；流动相为甲醇-乙醇(1:1,v/v)；流速：1mL/min；柱温：30℃。
辅酶Q10线性范围：0～3.2mg/mL
标准曲线：y＝8.14322×106x，x——峰面积，y——浓度。
经检测，辅酶Q10的保留时间为22.779min(附图1)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种从菌渣中提取制备辅酶Q10的工艺，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将菌渣进行渗漉提取，收集含辅酶Q10的渗漉液，渗漉提取所用溶剂为正己烷、乙酸乙酯、正庚烷、石油醚和丙酮中的任一种；
(2)将步骤(1)所得渗漉液经浓缩处理得固态粗产物，将所述固态粗产物溶解得到原料液，所得原料液经有机溶剂多级萃取除杂，取萃余液；所述有机溶剂为甲醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜中的任一种；
(3)将步骤(2)所得萃余液浓缩，有机溶剂溶解后降温结晶，过滤、干燥处理后得辅酶Q10精品；该步骤中所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、正庚烷或任意两种的混合物。
2.根据权利要求1所述从菌渣中提取制备辅酶Q10的工艺，其特征在于，步骤(1)所述渗漉提取过程为：渗漉柱用循环水控温，菌渣湿法装柱后溶剂浸泡，然后进行渗漉提取。
3.根据权利要求2所述从菌渣中提取制备辅酶Q10的工艺，其特征在于，步骤(1)中渗漉提取时渗漉柱温度控制在5～30℃，浸泡时间为1～5小时，渗漉提取液流速为1～3BV/h，收集渗漉液4～7BV。
4.根据权利要求1所述从菌渣中提取制备辅酶Q10的工艺，其特征在于，步骤(2)中所述多级萃取操作为多级逆流萃取、多级错流萃取或多级分馏萃取，萃取级数为2～10级。
5.根据权利要求1所述从菌渣中提取制备辅酶Q10的工艺，其特征在于，步骤(2)中固态粗产物溶解所用溶剂为正己烷、正庚烷和石油醚中的任一种。
6.根据权利要求1所述从菌渣中提取制备辅酶Q10的工艺，其特征在于，步骤(2)中溶解所得原料液的固形物浓度为50～700mg/mL。
7.根据权利要求1所述从菌渣中提取制备辅酶Q10的工艺，其特征在于，步骤(2)中所述有机溶剂单级用量为原料液体积的0.5～1.5倍。
8.根据权利要求1所述从菌渣中提取制备辅酶Q10的工艺，其特征在于，步骤(3)中所述降温结晶过程为：所得萃余液浓缩后在20～70℃下溶解于有机溶剂中，逐步降温至-5～5℃，冷却结晶12～36小时后过滤，滤饼洗涤后在20～40℃真空干燥得辅酶Q10精品。
9.根据权利要求8所述从菌渣中提取制备辅酶Q10的工艺，其特征在于，步骤(3)中所述有机溶剂加入量和浓缩后固体的比例为(20～80)L：1kg。
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