CN101381747A

CN101381747A - 一种从微生物中提取辅酶q10的方法

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Publication number: CN101381747A
Application number: CNA2008102252251A
Authority: CN
Inventors: 于群; 李伟静; 贺敏; 宋丽雅; 乔志新; 任鹏
Original assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2008-10-28
Filing date: 2008-10-28
Publication date: 2009-03-11
Anticipated expiration: 2028-10-28
Also published as: CN101381747B

Abstract

本发明公开了一种从微生物中提取辅酶Q₁₀的方法。其中超声破碎法是将有辅酶Q₁₀生产能力的微生物与对辅酶Q₁₀溶解良好的有机溶剂按质量体积比1－5∶10－20混合，然后在0℃下超声，超声频率为0.2－0.8，功率为300－500W，得到辅酶Q₁₀。碱裂解法是从类球红细菌发酵物中提取辅酶Q₁₀。所述微生物优选为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)属的微生物。本发明的辅酶Q₁₀提取方法具有提取效率高、低污染、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，适合推广应用。

Description

一种从微生物中提取辅酶Q10的方法

技术领域

本发明涉及辅酶Q₁₀的提取方法，特别是涉及一种从微生物中提取辅酶Q₁₀的方法。

背景技术

辅酶Q₁₀(Coenzyme Q₁₀，Ubiquinone)广泛存在于动植物组织与微生物细胞内，它是呼吸链中的重要递氢体，是生成ATP的必需辅酶。辅酶Q₁₀作为一种天然抗氧化剂、细胞激活剂，具有直接提高人体免疫力、增强抗氧化能力、延缓衰老的功能。辅酶Q₁₀在临床上主要应用于心血管疾病的治疗，还可用于病毒性肝炎、亚急性肝坏死、暴发性肝炎所致的脑水肿的综合治疗。辅酶Q₁₀先天缺乏症(在临床上为四类：伴随肌红蛋白尿的肌疾病与中枢神经系统疾病；小脑运动性共济失调并出现不同的中枢神经系统疾病；肌溶胶化疾病；新生儿脑肌疾病。)与后天缺乏症经口服辅酶Q₁₀后症状明显改善。辅酶Q₁₀也用于肿瘤病人的综合治疗，以改善其免疫功能。此外，辅酶Q₁₀还可用于胃肠道疾病、重症肌无力、高血压、呼吸衰竭、帕金森症、艾滋病等的辅助治疗。

目前，辅酶Q₁₀的主要生产方法是从微生物中提取，它的醌环中的苯醌的羟基取代基使它倾向于极性，而结构中的聚异戊二烯侧链使它在疏水环境中具有较低的自由能，能在生物膜中迅速扩散。辅酶Q₁₀的醌环具有典型的烯烃和羰基化合物的特征反应。对辅酶Q₁₀在细胞内与卵磷脂双层混合物的相的改变进行热量扫描，数据说明辅酶Q₁₀定位在生物膜脂双层疏水环境中心独立的空间，辅酶Q₁₀之间通过醌环亚层电子的范德华力相连，分散在脂双层内，并可与膜平行的平面为轴旋转。

目前，常用于生产辅酶Q₁₀的菌种有光合细菌和酵母，已报道的有寄也蒙假丝酵母CG108，根癌土壤杆菌，假白布勒弹孢菌(bullera psedoalba)，栗酒裂殖酵母，热带假丝酵母(Candida tropicalis)，深红酵母(Rhodotorula rubra)，粉红掷孢酵母(Sporobolom ycesroseus)，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，夹膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)，黑曲霉，类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，三孢布拉氏霉JSF412，黄色隐球酵母(Cryptococcus luteolus)L3302，放射性根瘤菌(Rhizobium radiobacter)WSH2601，Gluconobacter suboxydans，土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)KCCM10413，Paracoccus DenitrificansATCC19367，Rhodopseudomonas Spheroides等。

现国内辅酶Q₁₀提取的技术主要是碱醇皂化法，随着超声破碎技术的发展，目前也在辅酶Q₁₀的分离纯化中使用了该技术，但根据文献及专利报道，目前已使用了该技术的相关研究都是使用超声破碎作为菌体前期破碎的辅助手段，而在超声破碎之后，仍然需要对菌体碎片进行皂化提取，分离纯化步骤没有任何简化。日本相关文献报道的实验室分离技术是单纯使用有机溶剂进行长时间萃取，过于耗时，且提取率过低，不适用于批量样品应用。

发明内容

本发明提供了一种操作简单有效的从微生物中提取辅酶Q₁₀的方法。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种从微生物中提取辅酶Q₁₀的方法，是将有辅酶Q₁₀生产能力的微生物与对辅酶Q₁₀溶解良好的有机溶剂按质量体积比1-5：1-25混合，然后在0℃下超声，超声频率为0.2-0.8，功率为300-500W，得到辅酶Q₁₀。

在上述辅酶Q₁₀的提取方法中，所述有辅酶Q₁₀生产能力的微生物包括酵母、细菌和真菌等，具体如酵母菌中的布氏弹孢酵母属、假丝酵母属、隐球酵母属、红酵母属、裂殖糖酵母属和酒香酵母属；细菌中有红色杆菌属、微环菌属、副球菌属、土壤杆菌属、鱼精蛋白杆菌属、假单胞菌属、红细菌属和黄单胞菌属；真菌中有红曲霉属、侧孢霉属和外担子菌属等微生物；另外，也可使用经诱变的被强化的具有生产辅酶Q₁₀能力的该种属的微生物。

所述微生物优选为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)属的微生物，具体来讲优选为类球红细菌ATCC 17023。

所述对辅酶Q₁₀溶解良好的有机溶剂可选自水、丙酮、氯仿、正己烷、乙醚、甲醇、乙醇和石油醚等中的任意一种，优选为丙酮。

为获得更好的提取效果，所述微生物优选为经过发酵培养的，发酵培养条件优选为：在有氧条件下搅拌，温度为25-35℃，培养pH值为6-8，培养时间为18-72小时。

所述用于培养上述微生物的培养基的选择是广泛的，只要是含有该微生物可利用的碳源、氮源、无机盐等的天然培养基、合成培养基均可使用。作为碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有此类糖的淀粉、淀粉水解物等碳水化合物；作为氮源，可以使用含氮化合物，如蛋白胨、肉提取物、酵母膏、玉米浆、大豆饼及其水解物等；作为无机物，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸锰、硫酸铜等。

此外，为获得更高的提取率，所述超声次数为一次以上，每次不少于10min

为解决上述技术问题，本发明还可以采取以下技术方案：一种从微生物中提取辅酶Q₁₀的方法，包括以下步骤：

1)将有辅酶Q₁₀生产能力的微生物菌体与溶液I按质量体积比为1-5：1-20混合，剧烈振荡，以混匀；所述溶液I的配方为：每100mL含0.9908g葡萄糖，0.3028gTris·Cl，0.3722g EDTA，pH 8.0。

2)按体积比为1-2：1-3加入溶液II，混匀；所述溶液II的配方为：每100mL含0.8000g NaOH，1.0000g SDS；

3)按体积比为1-2：1-3加入溶液III，剧烈振荡后静置1-10min；所述溶液III的配方为：每100mL含29.4450g乙酸钾，11.5000mL冰乙酸；

4)按体积比为1-2：1-10加入氯仿，剧烈震荡后，在100-300rpm下摇匀20-60min，离心，吸取下层萃取液，得到辅酶Q₁₀。

为提高萃取率，可将步骤4)重复1-3次，合并每次的萃取液。

用上述方法提取的辅酶Q₁₀也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种从微生物中提取辅酶Q₁₀的方法。用本发明的方法仅使用有机溶剂超声破碎就可达到分离纯化的目的，不需要再辅助其它皂化等方法，整个过程中使用的试剂及操作步骤简单而且迅速(完成分离仅需要十几分钟)，此外，该方法较传统的碱醇皂化法提取率高很多(单位重量收率提高6倍)。因此，本发明的辅酶Q₁₀提取方法具有提取效率高、低污染、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，适合推广应用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为HPLC法测定辅酶Q₁₀标准曲线

图2为辅酶Q₁₀标准品扫描图

图3为超声粗提液扫描图

图4为碱醇皂化粗提液辅酶Q₁₀含量的HPLC色谱图

图5为碱裂解法提取液辅酶Q₁₀含量的HPLC色谱图

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂材料均可商购。

实施例1、从类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)中提取辅酶Q₁₀

用本发明的超声破碎法从类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)中提取辅酶Q₁₀，具体方法包括以下步骤：

一、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的发酵培养

将类球红细菌ATCC 17023(购于美国模式微生物菌种保藏中心)加入表1所示的培养基。所述培养基是将表1中各个成分混合，终体积调至1升，将pH调至7.0(pH6-8均可)，然后在121℃下高压灭菌20min。对固体培养基而言，混合以上成分和15g琼脂，然后进行高压灭菌，培养基被冷却至约60℃，倒入灭菌培养皿平板中。在有氧条件下搅拌，温度为25-35℃下发酵培养28小时(18-72小时均可)。培养结束后，采用离心法获得湿菌体4g。

表1 培养基成分

组分	含量(每升去离子水)
组分	含量(每升去离子水)	酵母粉	1-3g，
NaCl	2-5g，	酵母粉	1-3g，
NaCl	2-5g，	胰蛋白胨	4g，
牛肉膏	3g，	胰蛋白胨	4g，
牛肉膏	3g，	葡萄糖	4g，
蔗糖	4g，	葡萄糖	4g，
蔗糖	4g，	KH₂PO₄	1-3g，
K₂HPO₄	5-8g，	KH₂PO₄	1-3g，

二、用超声破碎法提取辅酶Q₁₀及HPLC含量检测

1、超声破碎法提取辅酶Q₁₀

用本发明的超声破碎法从步骤一的发酵物中提取辅酶Q₁₀：将4g类球红细菌ATCC17023发酵物与50mL丙酮(对辅酶Q₁₀溶解良好的有机溶剂均可，质量体积比为1-5：10-20)混合，然后在0℃(冰浴)下超声，超声频率为0.5(0.2-0.8均可)，功率为450W(300-500W均可)，超声时间3min。用上述方法提取3次。超声破碎后离心，保留上清，用具塞试管4℃保存待测辅酶Q₁₀含量。

2、高效液相色谱法(HPLC)含量检测

[1].高效液相色谱分析条件

色谱柱 SupelcosilTMLC-18柱，25cm×4.6mm，5μm，

色谱柱填充料十八烷基硅烷键合硅胶，

流动相异戊醇：甲醇(60:40)，

流速 1mL/min，

检测波长 275nm，

进样量 10μl。

[2].高效液相色谱法辅酶Q₁₀标准曲线的绘制

精确称取辅酶Q₁₀标准品5mg，溶于无水乙醇并定容至10mL，作为标准品储液，然后精确量取储液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别置于10mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，进样分析。以标准品浓度对峰面积做线性回归，得到高效液相色谱法辅酶Q₁₀标准曲线(图1)。方程为Y＝1.32+15.534X，(R＝0.99977，P<0.0001)。

[3].高效液相色谱法测定样品辅酶Q₁₀的含量

将辅酶Q₁₀乙醇粗提液用HPLC法测定其275nm处吸收峰面积，代入回归曲线方程进行计算，得到未知溶液的辅酶Q₁₀含量。

对步骤1的类球红细菌ATCC 17023发酵物超声破碎粗提液进行HPLC分析，结果如图2和图3所示，超声提取法提取液的HPLC图谱在辅酶Q₁₀的特征峰275nm附近处的有吸光值，说明该菌株可产辅酶Q₁₀，经标准曲线计算辅酶Q₁₀产量为523ug/g。

实施例2：碱醇皂化法提取辅酶Q₁₀及HPLC含量检测(对照)

1、碱醇皂化法提取辅酶Q₁₀

取4g类球红细菌ATCC 17023发酵物，加入3g焦性没食子酸，搅拌均匀，再加入氢氧化钠5g和甲醇水溶液26mL搅拌均匀，90℃皂化1小时，迅速冷却后，加入50mL正己烷，剧烈振荡后静置分层，萃取2次，取萃取清液，用去离子水洗至中性，再用无水硫酸钠除去水分，35℃减压旋转蒸发，无水乙醇重新溶解定容，得到辅酶Q₁₀粗提液，-20℃保存待测。

2、HPLC含量检测

用与步骤二相同的方法进行HPLC分析，结果如图4所示，碱醇皂化法提取液的HPLC图谱在保留时间275nm处出现辅酶Q₁₀的特征吸收峰，经标准曲线计算辅酶Q₁₀产量为87ug/g。

实施例3：碱裂解法提取辅酶Q₁₀及HPLC含量检测

用本发明的碱裂解法从类球红细菌ATCC 17023发酵物中提取辅酶Q₁₀，具体方法包括以下步骤：

碱裂解液的配制：

溶液I：准确称取0.9908g葡萄糖，0.3028g Tris·Cl，0.3722g EDTA，溶解于蒸馏水中，定容至100mL，调pH至8.0。121℃灭菌20min后分装入10mL无菌EP管中，4℃保存备用。

溶液II：准确称取0.4000g NaOH，0.5000g SDS，溶解于蒸馏水中，定容至50mL，备用。

溶液III：准确称取14.7225g乙酸钾，溶解于蒸馏水中，加入5.75mL冰乙酸，蒸馏水补至50mL，分装入10mL无菌EP管中，4℃保存备用。

1、碱裂解法提取辅酶Q₁₀

a.取类球红细菌湿菌体(参照实施例1中获得菌体的方法)0.04g，在EP管中加入500μl溶液I，剧烈振荡。

b.继续加入溶液II1000μl，快速颠倒EP管5次。

c.加入溶液III750μl，振荡后静置3min(1-10min均可)。

d.加入1.5mL氯仿，剧烈振荡后，220rpm(100-300rpm均可)摇匀40min(20-60min均可)，6000rpm离心5min，吸取下层萃取液。

e.重复操作上一步操作，将两次的萃取液混合保存在一起。

2、HPLC含量检测

用与步骤二相同的方法进行HPLC分析，结果如图5所示，碱裂解法提取液的HPLC图谱在保留时间275nm处出现辅酶Q₁₀的特征吸收峰，经标准曲线计算辅酶Q₁₀产量为237ug/g。

需要说明的是，本发明使用的类球红细菌不限于ATCC 17023，其它具有相同或类似活性的类球红细菌也在本发明选择和使用范围之内。

Claims

1、一种从微生物中提取辅酶Q₁₀的方法，是将有辅酶Q₁₀生产能力的微生物与对辅酶Q₁₀溶解良好的有机溶剂按质量体积比1-5：10-20混合，在0℃下超声，超声频率为0.2-0.8，功率为300-500W，然后从分离液中得到辅酶Q₁₀。

2、根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述微生物为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)属的微生物；优选类球红细菌ATCC 17023。

3、根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述对辅酶Q₁₀溶解良好的有机溶剂为水、丙酮、氯仿、正己烷、乙醚、甲醇、乙醇或石油醚；优选丙酮。

4、根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述微生物为经过发酵培养的，发酵培养条件为：在有氧条件下搅拌，温度为25-35℃，培养pH值为6-8，培养时间为18-72小时。

5、根据权利要求1-4任意一项所述的提取方法，其特征在于：所述超声次数为一次以上，每次不少于10min。

6、用权利要求1-5任意一项所述方法提取的辅酶Q₁₀。

7、一种从微生物中提取辅酶Q₁₀的方法，包括以下步骤：

1)将类球红细菌湿菌体与溶液I按质量体积比为1-2：10-20混合，剧烈振荡；所述溶液I的配方为：每100mL含0.9908g葡萄糖，0.3028g Tris·Cl，0.3722g EDTA，pH8.0。

4)按体积比为1-2：1-5加入氯仿，剧烈震荡后，在100-300rpm下摇匀20-60min，离心，吸取下层萃取液，得到辅酶Q₁₀。

8、根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于：所述微生物为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)属的微生物；优选类球红细菌ATCC17023。

9、根据权利要求7或8所述的提取方法，其特征在于：将步骤4)重复1-3次，合并每次的萃取液。

10、用权利要求7-9任意一项所述方法提取的辅酶Q₁₀。