KR100418104B1

KR100418104B1 - 운남 ｓｌ-001 균

Info

Publication number: KR100418104B1
Application number: KR10-2001-7004140A
Authority: KR
Inventors: 히로유키 스미
Original assignee: 가부시키가이샤 혼다 트레이딩; 히로유키 스미
Priority date: 1999-11-16
Filing date: 1999-11-16
Publication date: 2004-02-11
Also published as: EP1170360A4; EP1170360A1; US6420145B1; DE69933705T2; EP1170360B1; KR20010106497A; DE69933705D1; AU1180800A; WO2001036591A1

Abstract

비타민 K 또는 그 유도체를 고효율로 생산할 수 있는 미생물을 제공한다. 본 발명은 고초균(Bacillus subtilis)에 속하는 신규 미생물인 운남 SL-001 균 FERM BP-6713 에 관한 것이다.

Description

운남 ＳＬ-001 균 {YUNNAN STRAIN SL-001}

비타민 K 는 종래 혈액이 응고한 때에 필요한 인자로서 알려져 있으며 이 비타민 K 의 결핍은 혈액 응고능의 저하를 초래하기 때문에 항출혈성 비타민이라고도 불리는 지용성 비타민의 일종이다. 이 비타민 K 의 결핍이 혈액 응고능의 저하를 초래하는 원인으로서는 최근 프로트롬빈을 함유하는 수종의 혈액 응고 인자의 생합성에 비타민 K 가 불가결한 것이 시사되었다. 그러나, 혈액 응고능의 저하를 방지하기 위하여 필요하다고 여겨지는 비타민 K 의 양은 ㎍ 수준의 매우 미량으로 일반적으로는 성인은 장내 세균으로부터 공급되기 때문에 비타민 K 결핍증이 되는 일은 드물고 또 비타민 K 결핍성 출혈증의 치료에는 합성 비타민 K₁이나 K₂가 의약품으로서 사용되며 지금까지는 이 예방을 목적으로서 천연 비타민 K₁농축물이 식품으로서 이용되고 있기 때문에 비타민 K 는 지금까지 그다지 주목받는 일은 없었다.

그러나, 최근 비타민 K 에는 골형성 촉진 작용 및 골흡수 억제 작용이 있고,비타민 K 의 투여로 골밀도가 증가하는 것이 밝혀졌다. 한편, 골다공증은 노화나 질병 등의 원인에 의해 일어나는 뼈가 물러지는 병태로 골절되거나 심한 통증 등을 수반하고 노인 의료의 면에서 큰 사회적 문제가 되고 있는 병으로, 골다공증 환자에 있어서의 비타민 K 의 혈중 농도를 조사해 보면 정상인에 비하여 약 1/2 로 적은 것이 보고되었다. 이 때문에, 합성 비타민 K 가 골다공증용 치료약으로서 임상 시험이 실시되고 있지만, 출혈증의 치료ㆍ예방의 경우와 달리 골다공증의 치료ㆍ예방에서는 하루에 45 mg 이상이라는 다량의 비타민 K 의 투여로 골량을 증가시키는 개선 효과가 있는 것이 임상 시험에 의해 증명되고 있다. 또, 골다공증은 발병한 후의 치료보다 예방이 중요하여 이를 위해서는 식품으로부터 일상적으로 비타민 K 를 섭취하는 것이 바람직하지만, 정상인의 경우 하루에 어느 정도의 비타민 K 를 섭취하면 골량이 증가하여 골다공증의 예방에 도움이 되는가는 확실하지 않는데다가 기존의 식품에서 상기와 같은 양을 섭취하는 것은 어렵다고 생각된다.

상술한 바와 같이 비타민 K 의 섭취는 일상의 식품을 통하여 이루어지는 것이 바람직하고, 실제 비타민 K₁은 녹황색 야채나 해초류 등으로부터, 비타민 K₂는 낫또 (일본 콩 발효 식품) 등의 발효 식품으로부터 섭취할 수 있다. 그러나, 시판되는 식품으로부터 골다공증의 개선에 유효한 양이라는 보고가 있는 45 mg 의 비타민 K 를 섭취하고자 할 경우, 예를 들어 비타민 K 를 1 ppm 함유하는 식품에서는 하루에 45 kg 이라는 다량의 식품을 먹을 필요가 있지만, 이와 같은 일은 실제로는 매우 곤란하다. 또, 식품 중에서 비타민 K 의 함량이 수십 ppm 으로 가장 많은 것은 낫또이지만, 아무리 이 같은 낫또를 먹어도 하루에 수백 g 에서 수 kg 의 양을 먹어야만 하며, 기호상 이 만큼의 양을 매일 먹는 것은 곤란한데다가 섭취된 비타민 K 의 반감기는 짧고, 단발로 경구 섭취한 것으로는 효과가 불충분하거나, 또는 역으로 일시에 대량 섭취하면 부작용의 문제도 남게된다. 이 때문에, 비타민 K 가 농축된 것을 섭취하는 것이 바람직하지만, 출혈증 예방을 위하여 제조 분유에 첨가하고 있는 시판되는 천연 비타민 K 농축물은 고가이다.

그런데, 비타민 K 류 중에서 자연계에 존재하는 것은 비타민 K₁및 비타민 K₂군만이다. 비타민 K₁은 식품 중에서는 특히 녹색 야채, 식물유, 해조 등에 많이 포함되어 있으며 예를 들어 해조ㆍ해태ㆍ차엽 등에 수십 ppm, 대두유, 시금치나 브로콜리 등에 수 ppm 이 포함되어 있고, 또 2-메틸-1,4-나프토퀴논과 피틸아세테이트를 축합함으로써 합성된다. 또, 비타민 K₂군은 측쇄 길이의 차이에 의해 메나퀴논-1∼14 (MK-1∼14) 의 동족체가 알려져 있다. 이들 중 특히 메나퀴논-7 (본 명세서에서는 단순히 「MK-7」이라고도 함) 은 비타민 K₂의 대표적인 물질로 주로 낫또균에 의해 합성되지만, 자연계에서는 낫또라도 수 ∼ 십수 ppm 으로 비교적 미량 밖에 존재하지 않는 상반감기가 짧기 때문에 단리가 매우 곤란하며, 지금까지 MK-7 고함량의 지질을 제조한 예는 일본 공개특허공보 평8-73396 호에 일례로서 정도 밖에 알려져 있지 않다.

이 때문에, 비타민 K₂를 낫또균 등의 미생물을 사용하여 대량으로 생산하는 것이 시도되고 천연 비타민 K₂를 얻는 방법으로서는 많은 연구가 알려져 있으며 예를 들어 플라보 박테리아 속에 속하는 미생물의 배양액으로부터 비타민 K₂를 채취하는 방법 (일본 특허공보 평7-28748 호 및 일본 특허공보 평7-51070 호), 글리세린을 첨가한 대두 조림즙이나 두부 찌꺼기 등에 낫또균을 접종하여 발효시킴으로써 비타민 K 를 생산하는 방법 (일본 공개특허공보 평10-295393 호), 특정한 배양 온도 및 시간에서 낫또균에 의한 발효시킴으로써 비타민 K 를 생산하는 방법 (일본 공개특허공보 평8-9916 호, 일본 공개특허공보 평8-19378 호) 을 들 수 있다. 이들 방법과 더불어 낫또균의 발효물을 알코올, 에테르, 에스테르나 케톤 등의 유기 용매에 의한 용매 추출 등을 실시함으로써 천연 비타민 K₂, 특히 천연 MK-7 을 다량으로 함유하는 농축 지질을 얻는 방법 (일본 공개특허공보 평8-73396 호) 이 제안되고 있다.

그러나, 일본 특허공보 평7-28748 호 및 일본 특허공보 평7-51070 호에 개시된 바와 같은 플라보 박테리아 등의 비타민 K 생산균을 사용하는 방법은 플라보 박테리아가 식품으로서의 안전성이 증명되어 있지 않기 때문에 플라보 박테리아에 의한 배양물이나 배양액 등을 바로 식품첨가물, 그 외의 식용으로 사용할 수 없다는 문제가 있다. 또, 일본 공개특허공보 평10-295393 호에 개시된 바와 같은 글리세린을 첨가한 대두 조림즙이나 두부 찌꺼기 등으로 낫또균을 배양하는 방법에서는 분명히 최대 약 40 mg/l 배양액이라는 비교적 비타민 K 함유량이 높은 배양물을 얻을 수 있지만, 배지 중에 3 ∼ 10 질량% 정도의 글리세린이 함유되어 있기 때문에 배양물에는 당연히 글리세린이 잔존한다. 이 때문에, 대두 조림즙, 두부 찌꺼기 등의 배지나 낫또균 등의 배양 전의 원료는 그대로 식용으로 사용할 수 있지만, 배양 후의 배양물이나 배양액 등은 글리세린의 존재에 의해 바로 식품첨가물, 그 외의 식용으로 사용할 수 없다는 문제가 있다. 또한, 일본 공개특허공보 평8-9916 호 및 일본 공개특허공보 평8-19378 호에 개시된 바와 같은 특정한 배양 온도 및 시간으로 낫또균에 의해 발효시키는 방법에서는, 목적으로 하는 비타민 K 함유량이 각각 최대로 약 53 mg/kg 대두 및 약 117 mg/l 배양액이라는 비타민 K 함유량이 매우 높은 배양물을 얻을 수 있다. 그러나, 상기 방법 중 일본 공개특허공보 평8-9916 호에서는 명세서 중에도 기재되어 있지만, 수득된 배양물은 암모니아 냄새가 나기 때문에, 식품 소재로서는 부적절하다. 또, 일본 공개특허공보 평8-19378 호에 개시된 방법에서는 분명히 배양액에서는 높은 비타민 K 함유량을 얻을 수 있지만, 여기에서 생산되는 비타민 K 의 대부분은 수용성이 아니라 지용성의 비타민 K 이기 때문에 그 사용할 수 있는 용도는 매우 한정된 것이 된다.

또한, 일본 공개특허공보 평8-73396 호에 개시된 바와 같은 낫또균의 발효물을 유기 용매로 추출함으로써 제조되는 천연 메나퀴논-7 고함량 지질은 대두 등의 식용에 사용할 수 있는 것을 원료로서 제조되고는 있지만, 추출 공정에 유기 용매를 사용하고 있기 때문에, 얻은 천연 메나퀴논-7 고함량 지질을 식품 중에 또는 식품으로서 사용할 때에는 이 유기 용매를 완전히 제거하지 않으면 안되며 이를 위한 설비나 시간이 추가로 필요한데다가 상기와 같이 얻은 메나퀴논-7 함유 지질은 그명칭으로부터도 확실한 바와 같이 지용성이기 때문에 그 사용할 수 있는 용도가 한정된다.

상술한 바와 같이 낫또, 낫또의 제조과정에서 발생하는 찌꺼기, 조림즙 등의 부산물의 발효물로부터 낫또균 등의 미생물을 사용하여 비타민 K 나 메나퀴논-7 을 생산하는 방법은 다수 보고되어 왔지만, 식용으로 사용할 수 있는 비타민 K 나 그 수용성의 유도체를 고생산량으로 생산할 수 있는 미생물 자체에 관한 보고는 종래 거의 없었다.

따라서, 본 발명은 비타민 K 또는 그 유도체를 효율 좋게 생산할 수 있는 미생물을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.

본 발명은 신규의 고초균 (Bacillus subtilis) 에 관한 것이다. 상세하게 설명하면 본 발명은 고효율로 비타민 K 또는 그 유도체를 생산하는 능력을 가진 고초균에 관한 것이다.

제 1 도는 운남 SL-001 균, 미야기노균, 야요이균, 다까하시균 및 나루세균의 RAPD 법에 의한 DNA 패턴을 나타내는 도면이다.

제 2 도는 실시예 1 에서 4 일간 배양한 후의 각종 낫또균의 배양물의 물 및 이소프로판올 추출물 중의 MK-7 양을 나타내는 도면이다.

제 3 도는 실시예 4 에서 배양 시간에 대한 미야기노균 및 운남 SL-001 균의 배양물의 이소프로판올 추출물 중의 MK-7 양을 나타내는 도면이다.

제 4 도는 실시예 5 에서 4 일간 배양한 후의 각종 낫또균의 배양물의 수 추출물 중의 MK-7 유도체의 양을 나타내는 도면이다.

제 5 도는 실시예 6 에서 수용성 비타민 K 유도체 및 비지 배양물의 이소프로판올 추출 시료의 HPLC 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

본 발명에 의한 운남 SL-001 균은 바실러스 속 (Bacillus), 상세하게는 고초균(Bacillus subtilis)에 속하고 비타민 K 또는 그 유도체를 높은 수율로 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는 신규한 미생물이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

중국 운남성의 군밍시내에서 제조ㆍ판매되는 낫또 (비파나무의 잎을 용기로서 사용하여 그 용기 중에서 대두를 발효 및 숙성시킨 것) 를 멸균수로 희석하여 이 희석액에 관하여 낫또 시험법 (65 ∼ 66 면, 가부시끼가이샤 코오린 발행, 낫또 시험법 연구회편, 1990) 에 기재된 희석 분리법에 따라서 보통 한천 배지(10 ml) 상에서 30 ℃ 에서 48 시간 배양하고, 소정 시간 배양 후에 형성된 콜로니를 채취하고 상기 조작을 반복함으로써 단일의 균주를 단리하였다.

이와 같이 하여 단리된 균주의 균학적 성질을 이하에 나타낸다.

(a) 형태적 성질

1) 세포의 형태 및 크기 : 브렌치균으로 육즙 중에서 30 ℃ 에서 24 시간 배양한 후의 세포를 현미경에 의해 직접 관찰한 바, 폭 1 ㎛ × 길이 3 ∼ 4 ㎛ 의 양단이 둥근 브렌치가 된다.

2) 세포의 다형성의 유무 : 없음

3) 운동성의 유무 : 있음

보다 상세하게는 반유동 배지 (0.3 % 한천을 첨가한 부용 배지를 고층으로 단단하게 한 것) 의 2/3 의 깊이까지 천자 접종하여 35 ℃ 에서 배양하고, 천자선으로부터 전면에 생육이 확산되었기 때문에, 또 현미경에 의해 직접 관찰한 바, 운동성이 있다고 판단하였다.

4) 포자의 유무 : 있음 (내열성의 포자를 생산)

포자는 직경 약 1 ㎛ 의 크기로 세포의 중앙에 타원형의 포자를 발생시킨다. 또, 포자낭은 형성되지 않는다.

상기 4) 에서 포자의 확인 방법을 간결하게 말하면 Moeller 법 (Moeller, H., 1891, Ueber eine neue Methode der Sporenfarbung., Zentbl. Bakt. Parasitkde Abt. I, 10, 273) 으로 아포를 염색하였다. 보다 상세하게는 화염 고정한 균체를 석탄산 푸크신액으로 염색, 물로 세정한 후 에탄올로 탈색하고, Loffler 메틸렌 블루액으로 후염색, 물로 세정한 바, 균체가 청색으로 및 아포가 적색으로 염색되었다. 또, 배양 균체를 80 ℃ 에서 10 분간 가열하여 균의 생잔에 의해 아포가 내열성 아포인가 아닌가를 판정한 바, 내열성 아포이라는 것을 알았다.

(b) 배양적 성질

1) 육즙 한천 평판 배양 (30 ℃, 48 시간) : 콜로니는 백색 원형으로 표면은 주름형을 띄고, 건조한 듯이 보인다. 또, 콜로니의 크기는 30 ℃ 에서 48 시간 배양하였을 때, 직경 약 2 mm 이다.

2) 육즙 액체 배양 (30 ℃) : 10 ml 의 배지에 일백금이를 접종한 바, 36 시간의 배양으로 백탁하며 그 배양액의 흡광도 (OD₆₆₀) 는 0.85 였다.

3) 육즙 젤라틴 천자 배양 : +

젤라틴 첨가 한천 배지에 균을 접종하여 배양한 후, Frazier 시약 (Frazier, W.C., 1926, A method for the detection of changes in gelatin due to bacteria., J. infect. Dis., 37, 302) 을 배지 표면에 붓고 균의 발육 주위에 명료한 투명띠가 형성되는가 마는가를 관찰하고 투명띠가 형성된 것을 양성 (+) 이라 하였다.

(c) 생리학적 성질

1) 그람 염색 : +

2) 질산염의 환원 : -

3) VP 테스트 : +

4) 인돌의 생성 : -

5) 황화수소의 생성 : -

6) 시트르산의 이용 : -

7) 우레아제 : -

8) 옥시다제 : +

9) 산소에 대한 태도 : 호기성

10) 아르기닌의 분해 (아르기닌디히드로라제 활성) : -

11) 리진의 탈탄산 반응 (리진 탈탄소 효소 활성) : -

12) 오르니틴의 탈탄산 반응 (오르니틴 탈탄소 효소 활성) : -

13) 트립토판의 탈아미노 반응 : -

14) ONPG 테스트 (β-갈락토시다제 활성) : -

15) 비오틴의 요구성 : -

16) 점착물의 생성 : +

또한, 상기 생리학적 성질의 일부에 관하여 그 판정 방법을 이하에 간단히 설명한다.

1) 그람 염색

Hucker 의 변법에 의해 판정하였다. 보다 상세하게는, 화염 고정한 균체를 먼저 Hucker 크리스탈 바이올렛액으로 염색하고 요소 처리를 실시한 후 탈색, Pfeiffer 푸크신액으로 후염색을 실시한 바, 균체는 자색으로 염색되었다. 이 때, 그람 양성균은 자색으로 및 그람 음성균은 적색으로 각각 염색된다.

2) 질산염의 환원

질산염 부용 배지에 균을 접종하여 배양한 후, 배양액에 0.8 % 술포닐산 용액 (5 N 아세트산 용액에서의) 및 0.5 % α-나프틸아민 용액 (5 N 아세트산 용액에서의)을 첨가하고 이 때, 적색 또는 적갈색으로 발색한 것을 양성이라 판정하였다.

3) VP 테스트 (아세토인의 생성)

Voges-Proskauer 테스트에서 핑크에서 적색으로 발색된 균을 양성이라고 판정하였다. 보다 상세하게는 MR-VP 부용 배지에 균을 접종하여 30 ℃ 에서 24 시간 배양한 후, 6 % α-나프톨 (에탄올에서의) 용액 및 40 % 수산화 나트륨 용액을 첨가하여 심하게 혼합시킨 후, 정치하여 배양액이 핑크에서 적색으로 변색한 균을 양성이라 판정하였다 (Eddy, B.P., 1961, The Voges-Proskauer reaction and its significance : a review, Appl. Bact., 24, 27).

4) 인돌의 생성

인돌 테스트용 펩톤수에 균을 접종하고 35 ℃ 에서 10 ∼ 15 분간 방치한 후, 코박 시약을 첨가하여 적색으로 발색한 것을 양성이라 판정하였다 (Kovacs, N., 1928, Eine vereinfachte Methode zum Nachweis der Indolbildung durch Bakterien, Z. ImmunForsch. exp. Ther., 55, 311).

5) 황화 수소의 생성

블리세라 부용 배지에 균을 접종하고 캡과 시험관의 사이에 아세트산아연 종이를 끼우고 배지에 접촉되지 않도록 하여 시험관 내에 드리운다. 배양 후, 여과지의 선단이 갈색 또는 흑색으로 된 것을 양성이라 판정하였다 (ZoBell, C.E. Feltham, C.B., 1934, A comparison of lead, bismuth, and iron as detectors of hydrogen sulphide produced by bacteria, J. Bact., 28, 169).

6) 시트르산의 이용

시몬즈 시트르산 한천 배지 (Simmons 의 배지) 에 균을 접종한 후, 35 ℃ 에서 4 일간 배양하여 확실한 생육이 보이며 배지가 청색으로 변한 것을 양성이라 판정하였다.

7) 우레아제

크리스텐센 요소 한천 배지에 균을 농후하게 접종하여 35 ℃ 에서 밤새 배양하고 배지 전체가 적색으로 변한 것을 양성이라 판정하였다 (Christensen, W.B., 1946, Urea decomposition as a means of differentiating Proteus and paracolon cultures from each other and from Salmonella and Shigella, J. Bact., 52, 461).

8) 옥시다제

균체의 덩어리에 코박 시약을 적가하여 암자색으로 변색한 균을 양성이라 판정하였다 (Kovacs, N., 1956, Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction, Nature, 178, 703).

9) 산소에 대한 태도

평판 배지 2 장에 균을 접종하고 이들 중, 1 장에 호기 배양하여 타방은 혐기 배양한다. 이 때, 혐기 배양에는 BBL 사 제조 가스팩 파우치를 사용한다. 이 결과 호기 배양한 평판에만 균이 생육된 것을 호기성이라 판정하였다.

10) ∼ 12) 아르기닌의 분해 (아르기닌디히드로라제 활성), 리진의 탈탄산 반응 (리진 탈탄소 효소 활성) 및 오르니틴의 탈탄산 반응 (오르니틴 탈탄소 효소 활성)

멜라데카르복시라제 배지에 아르기닌, 리진 또는 오르니틴 (모두 염산염) 을 각각 1 % 첨가하여 고압 멸균한다. 이 배지에 균을 각각 접종하고 멸균 유동 파라핀을 중층하여 배양하고 배양액이 자색으로 변색한 것을 양성으로 판정하였다.

13) 트립토판의 탈아미노 반응

트립토판 한천 배지에 균을 농후하게 접종하여, 35 ℃ 에서 24 시간 배양한 후, 3.4 % 염화 제 2 철 용액을 사면을 따라서 첨가하고 시약에 접촉한 사면부가 적갈색으로 변색한 것을 양성이라 판정하였다.

14) ONPG 테스트 (β-갈락토시다제 활성)

ONPG (o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드) 테스트로 황색으로 변한 것을 양성이라 판정하였다. 바꾸어 말하면, ONPG 부용 배지에 균을 접종하고, 35 ℃ 에서 24 시간 배양한 후, 황색으로 변한 것을 양성이라 판정하였다.

15) 비오틴의 요구성

기다 세쯔꼬들의 합성 배지 (기다 세쯔꼬, 하시다 와타루, 테라모토 시로, 1956, 낫또 및 낫또균에 관한 영양학적 연구, 발효 공학 잡지, 34, 542) 를 사용하여 비오틴 첨가 및 무첨가 합성 배지에 균을 접종하여 35 ℃ 에서 6 일간 배양하여 균이 생육하여 배양이 탁해진 것을 양성이라 판정하였다.

16) 점착물의 생성

점착물 생산용 평판 배지 (무라마쯔 호따꼬 등, 1995, 일본농예화학회 1995 년도 대회 강연 요지집, 315면) 에 균을 접종하고 배양한 후, 형성된 콜로니를 관찰하여 점착물을 생산한 것을 양성이라 판정하였다.

(d) 당류로부터의 산의 생성

이하에 각종 당류로부터의 산의 생성의 유무를 기재한다.

또한, 이하의 당 (탄수화물) 로부터의 산의 생산은 최종 1 % 농도가 되도록 탄수화물을 첨가한 당가 암모늄 한천 배지에 균을 접종하여 35 ℃ 에서 4 일간 배양하여 황색으로 변한 것을 양성이라 판정하였다.

1) 글리세롤 : ±

2) L-아라비노오스 : -

3) 리보오스 : -

4) D-글루코오스 : +

5) D-프럭토오스 : ±

6) D-만노오스 : +

7) 이노시톨 : -

8) D-만니톨 : -

9) D-솔비톨 : -

10) α-메틸-D-글루코시드 : ±

11) 에스크린 : +

12) 말토오스 : -

13) 사카로오스 : +

14) 트레할로오스 : +

15) 이눌린 : +

16) 글리코겐 : +

본 균에 대해서 버지 매뉴얼 오브 시스테매틱 박테리올로지 (Bergey's Manunal of Systematic Bacteriology 8th) 등을 참고로 하여 분류, 동정한 결과, 고초균에 근사하고 있음을 알 수 있었다.

이어서, (a) ∼ (d) 의 모든 성질에 대해서 상기 중국 운남성의 군밍시내에서 제조 판매되는 낫또에서 단리된 균주와, 고초균의 대표적인 기준 균주인 마버그 (Marburg) 및 시판되는 낫또균인 미야기노균 (유겐가이샤 미야기노 낫또 세이조쇼 제조, 센다이), 야요이균(가부시까가이샤 스즈요 고오교 제조, 도오꾜), 다까하시균 (다까하시 유조 겡꾸쇼 제조, 야마가따) 및 나루세균 (가부시끼가이샤 나루세 핫꼬오 가가꾸 겡꾸쇼 제조, 도오꾜) 을 비교하여 그 결과를 아래 표 1 ∼ 표 3 에 나타낸다.

상기 표 1 ∼ 표 3 에서, 시트르산의 이용, ONPG 테스트 (β-갈락토시다아제 활성) 및 비오틴의 요구성에 대해서, 중국 운남성의 군밍시내에서 제조 판매되는 낫또에서 단리된 균주는 다른 고초균, 특히 시판되는 균과 비교하여 유의한 차이를 보이며, 또 당으로부터의 산 생성에 대해서도, L-아라비노오스, 리보오스, 이노시톨, D-만니톨, D-솔비톨, 말토오스 및 글리코겐에 대해서, 중국 운남성의 군밍시내에서 제조 판매되는 낫또에서 단리된 균주가 다른 고초균, 특히 시판되는 균에 비해 유의한 차이를 나타냄을 알 수 있다.

또, 중국 운남성의 군밍시내에서 제조 판매되는 낫또에서 단리된 균주 및 시판되는 낫또균인 미야기노균 (유겐가이샤 미야기노 낫또 세이조쇼 제조, 센다이), 야요이균(가부시까가이샤 스즈요 고오교 제조, 도오꾜), 다까하시균 (다까하시 유조 겡꾸쇼 제조, 야마가따) 및 나루세균 (가부시끼가이샤 나루세 핫꼬오 가가꾸 겡꾸쇼 제조, 도오꾜) 의 DNA 패턴을, RAPD 법 (니시모또 가쓰꼬, 가와구찌 히로시, 요꼬떼 다마미, 기시모또 노리아끼, 다노 다쓰오, 1999, RAPD (random amplified polymorphic DNA) 을 니시모또 가쓰꼬, 사용된 간편한 낫또균 분류법, 일본농예화학회 1999년도 대회강연요지집, 75페이지 ; 가와구찌 히로시, 니시모또 가쓰꼬, 요꼬떼 다마미, 모리시따 히데끼, 기시모또 노리아끼, 다노 다쓰오, 1999, RAPD 법을 사용한 식품미생물의「주」레벨에서의 분류, 일본식품과학공학대회 대46회 대회강연요지집, 98페이지) 에 따라 비교하였다. 결과를 도 1 에 나타낸다.

도 1 에서 알 수 있듯이 중국 운남성의 군밍시내에서 제조 판매되는 낫또에서 단리된 균주 (도 1 에서의 운남 SL-001 균) 는 다른 4 종류의 시판되는 낫또 균주와는 명확히 그 DNA 패턴에 상이함이 보였다.

상기한 바와 같은 상이함에 덧붙여, 하기 실시예에서 상세하게 기재하지만, 중국 운남성의 군밍시내에서 제조 판매되는 낫또에서 단리된 균주 및 시판되는 다양한 낫또균에 대해서 배양 세포 중의, 및 배양액 중의 비타민K 의 일종인 메나퀴논-7(MK-7) 및 그 유도체 양을 측정한 결과 이들 생산량에 유의한 차이가 보였다.

이들 결과에서 본 균주는 공지된 고초균과는 다른 성질을 갖는 것이기 때문에, 본 균주를 고초균에 속한 신규 미생물로 판단하여, 본 균주를 운남 SL-001 균으로 명명하였다. 또, 운남 SL-001 균은 1999년 5월 7일자로 일본 이바라기껭 쓰꾸바시 히가시 1쵸메 1반 3고에 소재인 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 수탁번호 FERM BP-6713 호로 국제 기탁되었다.

한편, 본 발명자는 운남 SL-001 균의 배양물을 여과나 원심분리 등의 이미 알려진 방법으로 집균한 후 그것을 동결 건조, 바람 건조, 진공열 건조 등의 공지된 방법으로 건조시키고 이 건조 균체를 물에 용해시킨 바 용해된 것을 발견하였다. 따라서, 하기 실시예에서 상세하게 서술하지만, 배양물을 물 및 이소프로판올로 추출한 것을 HPLC 로 조사한 결과 양자에 비타민K (특히 MK-7) 가 함유되어 있음을 알 수 있었다. 이 점에서 본 발명의 운남 SL-001 균이 생산되는 비타민K (특히 MK-7) 는 균체 내에서는 어떠한 변화를 받아 수용성이 되리라고 생각되며, 이러한 수용성이 부여된 형태의 비타민K 및 메나퀴논-7 (MK-7) 을 본원 명세서에서 각각 「수용성 비타민K 유도체」(또는 단순히 「비타민K 유도체」) 및「수용성 메나퀴논-7 유도체 (또는 단순히「MK-7 유도체」」라고 한다. 이 때 수용성 메나퀴논-7 유도체는 역시 아래 실시예에서 더 상세하게 설명되지만, SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 측정될 때에 약 10만의 분자량의 단일 밴드를 나타내는 점, 겔 여과로 측정될 때에는 10 만 이상의 분자량을 나타내는 점 및 메나퀴논-7 의 분자량이 약 649 인 점을 고려함으로써, MK-7 에 어떠한 물질 (예컨대, 당단백질) 이 결합하여 안정화되어 물에 가용성인 비타민K 유도체 (비타민K₂유도체 및 메나퀴논-7 유도체를 함유함 ; 이하 생략) 가 균체 내에서 형성되는 것이 아닌가 하고 추정된다. 그러나, 상기 가설에 의해 본 발명의 개념이 한정되는 것이 아니라는 것은 말할 필요도 없다.

본 발명에서 운남 SL-001 균의 배양은 고초균을 일반적으로 배양하는 것과 동일한 배지 및 배양 조건이 사용되고, 예컨대 본 발명에 의한 배양에 사용되는 배지는 당업자에게는 공지된 성분으로 이루어진 배지를 사용할 수 있으며 특별히 제한되지 않고, 각종 배양 성분을 적절하게 혼합함으로써 제조해도, 또는 시판되는 배지를 그대로 사용해도, 또는 시판되는 배지에 상기 공지 성분을 보조성분으로서 첨가한 배지를 사용해도 된다. 이 때, 배지는 고체 또는 액체 배지 어느것을 사용해도 되고 사용 목적에 따라 적절하게 선택되고, 또한 사용되는 미생물이 자화될 수 있는 탄소원, 적당량의 질소원, 무기염 및 기타 영양소를 함유한 배지라면 합성 배지 또는 천연 배지 어느 것이어도 된다.

본 발명의 운남 SL-001 균의 배양에서 사용할 수 있는 탄소원은 운남 SL-001 균이 자화될 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로는 전분 또는 그 조성 분획, 배소 덱스트린, 가공 전분, 전분 유도체, 물리처리 전분, α-전분, 가용성 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 말토올리고당, 시클로덱스트린, 푸란, 옥수수 전분, 감자 전분, 고구마 전분 및 덱스트린, 글리세린, 갈락토오스, 락토오스, 맥아즙, 글루코오스, 프럭토오스, 만노오스, α-메틸-D-글루코시드, 에스크린, 사카로오스, 트레할로오스, 이눌린 및 글리코겐 등의 탄수화물을 들 수 있다. 이들 탄소원 중 운남 SL-001 균의 생육이라는 관점에서 사카로오스, 만노오스, 에스크린, 글루코오스, 전분, 트레할로오스, 이눌린 및 글리코겐이 바람직하게 사용된다. 이들 탄소원은 단독 또는 2 종류 이상의 혼합물 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 운남 SL-001 균 배양에서 사용할 수 있는 질소원도 역시 자화될 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로는 고기엑기스, 맥아엑기스, 펩톤, 대두 유래의 폴리펩톤 (예컨대 폴리펩톤-S), 효모 엑기스, 미액 (대두 단백산 가수분해물), 대두 분말, 밀크카제인, 카자미노산, 글루타민산, 알기닌, 아스파라긴 및 프롤린 등의 각종 아미노산, 옥수수 침지액 등의 유기질소화합물 ; 및 암모니아, 탄산암모늄, 질산암모늄, 황산암모늄 및 염화암모늄 등의 암모늄염, 질산나트륨, 황산나트륨 등의 나트륨염, 요소 및 요산 등의 무기질소화합물 등을 들 수 있다. 이들 질소원 중 운남 SL-001 균의 생육을 고려하면 대두 유래의 폴리펩톤 (예컨대 폴리펩톤-S) 및 대두 분말이 바람직하게 사용된다. 이들 질소원도 단독 또는 2 종류 이상의 혼합물 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 운남 SL-001 균 배양에 사용할 수 있는 무기염 역시 운남 SL-001 균을 양호하게 생육할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는 마그네슘, 망간, 칼슘, 나트륨, 칼륨, 구리, 철 및 아연 등의 인산염, 염산염, 황산염 및 아세트산염 등에서 선택된 1 종류 또는 2 종류 이상을 사용할 수 있다.

또, 본 발명의 운남 SL-001 균의 배양용 배지에 비타민을 함유시켜도 된다. 이 때 비타민으로는 운남 SL-001 균을 바람직하게 생육할 수 있는 것이라면 특별히제한되지 않지만, 구체적으로는 티아민, 리보플라빈, 비타민B₆류, 판토덴산칼슘, 니코틴산아미드, p-아미노벤조산 및 엽산 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 운남 SL-001 균 배양에 시판되는 배지를 사용하는 경우의 시판되는 배지로는 예컨대 영양 부용 (nutrient broth) (건조 부용) (닛쓰이 세이야꾸 가부시까가이샤 또는 니혼 세이야꾸 가부시까가이샤 제조), 폴립펩톤-S (와꼬오 쥰야꾸 제조) 등을 들 수 있다.

또는 본 발명에서 운남 SL-001 균 배양에 사용되는 배지로서, 비지, 대두, 된장이나 낫또 제조시에 부산물로 생성되는 대두 조림즙, 두부나 유부 제조시에 부산물로 생성되는 두부 찌꺼기, 대두를 원료로 한 오일 제조시에 부산물로 생성되는 대두 찌꺼기, 된장 제조시의 부산물인 대두 종피 등 낫또균에 의해 발효될 수 있는 재료를 사용해도 된다. 이 때 필요하면 이 재료에 상기한 바와 같은 탄소원, 질소원 및 무기염을 적절하게 첨가해도 된다.

본 발명에서 운남 SL-001 균 배양은 종래 공지된 방법과 동일하게 실시되며, 이 때 배양조건은 배지 조성 및 배양법에 의해 적절하게 선택되고, 양호하게 생육할 수 있는 조건이면 특별히 제한되지 않는다. 배양 온도는 통상 20 ∼ 45℃, 바람직하게는 37 ∼ 42℃ 이고, 또 배양에 적당한 배지의 pH 는 통상 6.0 ∼ 9.5, 바람직하게는 7.0 ∼ 8.5 이다.

이렇게 해서 얻은 본 발명의 운남 SL-001 균의 배양물 및 배양액은 운남 SL-001 균이 식품을 근원으로 하기 때문에 높은 안정성을 갖는다. 그러므로, 본 발명의 운남 SL-001 균의 배양물 및 배양액을 그대로 식품 첨가물로서 또는 식품으로서 사용하는 것을 기대할 수 있다.

본 발명의 운남 SL-001 균은 아래에 상세하게 서술한 바와 같이 효율적으로 비타민K 또는 그 유도체를 생산하는 능력을 갖는 것이나, 운남 SL-001 균에서의 비타민K 또는 그 유도체 분리·정제 방법으로는 배양 조건 등에 따라 다르지만, 예컨대 목적하는 비타민K 또는 그 유도체가 배양 세포 중에 축적되는 경우에는 상기 배양조건 하에서 배양을 한 후 균체를 여과 또는 원심분리 등으로 모아서 예컨대 동결융해처리, 초음파처리, 가압처리, 삼투압차 처리, 마쇄 처리 등의 물리적 수단 또는 리조팀 등의 세포벽 용해 효소처리 또는 계면활성제와의 접촉처리 등의 화학적 처리를 단독 또는 조합하여 실시함으로써 균체를 파쇄하고, 파쇄된 균체에서 목적하는 비타민K 또는 그 유도체를 분별결정법, 분별침전법, 이온교환 크로마토그래피법 및 용매추출법 등 이미 알려진 방법을 단독 또는 조합하면서 사용하여 정제하는 방법을 들 수 있다.

또는, 배양 균체를 속슬렛 추출함으로써 비타민K 또는 그 유도체를 회수해도 된다. 구체적으로는 상기와 같이 해서 배양된 균체를 속슬렛 추출기를 사용하며 헥산, 디에틸에테르, 아세톤, 에탄올 및 이소프로판올 등의 유기 용매로 사용하는 유기용매의 비점에서 속슬렛 추출하여 지용성 분획을 얻는다. 이어서, 이 분획을 헥산, 디에틸에테르, 아세톤, 에탄올 및 이소프로판올 등의 유기용매로 30 ∼ 100℃ 에서 0.1 ∼ 20 시간 동안 추출한다. 얻은 추출물 상기와 동일한 유기용매로 소정의 총 용량까지 희석한다. 희석된 추출물 일부를 물과 이소프로판올과 혼합하고, 다시 터치믹서를 사용하는 등으로 하여 상기와 동일한 유기용매와 추가로 혼합한다. 얻은 액체혼합물을 원심하고 상청을 건조시킨 후 잔사를 에탄올에 용해시킴으로써 비타민K 또는 그 유도체를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에서 운남 SL-001 균이 생성되는 비타민K 유도체가 수용성일 때에는 이하와 같은 조작으로 원하는 비타민K 유도체를 회수할 수 있다. 간결하게 말하면 상기와 같이 해서 배양된 운남 SL-001 균체의 배양액 또는 그 배양 상청의 pH 를 바람직하게는 pH 를 1 ∼ 3 까지 내려 침전물을 얻으며, 이 침전물을 원심 분리 등으로 분리함으로써 수용성 비타민K 유도체를 분리하여 취할 수 있다.

이렇게 해서 얻은 본 발명의 운남 SL-001 균의 배양물 및 배양액에서 얻은 비타민K 또는 그 비타민K 유도체 역시 운남 SL-001 균이 식품을 베이스로 하고 그 배양물 및 배양액은 안전하기 때문에, 높은 안전성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 운남 SL-001 균의 배양물 및 배양액에서 얻어진 비타민 K 또는 그 비타민 K 유도체를 그대로 식품첨가물로서 또는 식품으로 사용하는 것이 기대된다.

본 발명의 목적은 고초균에 속하는 운남 SL-001 균 FERM BP-6713 에 의해 달성된다.

다음에서, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

실시예 1

10 g (습중량) 의 비지 (아사히마쯔쇼꾸힌 가부시키가이샤 제조, 이이다시) 를 샬레에 넣어, 120 ℃ 에서 약 10 분간 가압가마에서 쪘다 (오토클레이브 멸균).

별도로, 슬랜트에 보존된 시판되는 낫또에 사용되고 있는 4 종의 낫또균주 (미야기노균, 아사히균, 나루세균 및 다까하시균), 약제로서 사용되고 있는 2 종의낫또균주 (닛또균 및 메구로균), 및 운남 SL-001 균 (FERM BP-6713) 의 합계 7 종의 낫또균을 각각 일백금이 9.5 ㎖ 의 멸균수에 현탁하여, 균체현탁수를 제조하였다. 또, 각 시판 낫또균에 대한 상세한 것은 하기와 같다. 이하, 낫또균은 균명만을 기재한다.

〈사용한 시판 낫또균〉

미야기노균 (유겐가이샤 미야기노낫또세이조쇼 제조, 센다이)

닛또균 (가부시끼가이샤 닛또야꾸힌고우교샤 제조, 교또)

메구로균 (가부시끼가이샤 메구로겐뀨쇼 제조, 오오사까)

아사히균 (가부시끼가이샤 아사히고우교 제조, 도꾜)

나루세 (가부시끼가이샤 나루세핫꼬가가꾸겐뀨쇼 제조, 도꾜)

다까하시균 (다까하시유조겐뀨쇼 제조, 야마가따)

다음으로, 상기 멸균이 완료된 비지에, 상기에서 제조된 균체현탁액 0.5 ㎖ 를 각각 식균한 다음, 37 ℃ 에서 4 일간 인큐베이션하였다.

이렇게 하여 얻은 각종 낫또균의 비지 배양물에 4 배량의 증류수 또는 이소프로판올을 각각 첨가하였다. 이 혼합액을, 20 ℃, 3,000 rpm 에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상청 0.5 ㎖ 을 추출시료로 하였다. 다음으로, 추출용매로서 증류수를 사용한 추출시료에는, 증류수 0.5 ㎖ 및 이소프로판올 1.5 ㎖ 을 혼합하였다. 또, 추출용매로서 이소프로판올을 사용한 추출시료에는, 증류수 1.0 ㎖ 및 이소프로판올 1.0 ㎖ 을 혼합하였다. 이어서, 이와 같은 방법으로 얻은 혼합액에 각각 헥산을 5.0 ㎖ 씩 첨가·교반한 후, 20 ℃, 3,000 rpm 에서 10 분간 원심분리하였다. 이어서, 얻어진 헥산층 4.0 ㎖ 을 증발기로 농축·건조고화하여 100 ㎕ 의 에탄올로 용해하였다. 이러한 방법으로 증류수 또는 이소프로판올을 추출용제로서 사용한 시료를 각각 수추출시료 및 이소프로판올 추출시료로 하였다. 이렇게 제조된 수추출시료 및 이소프로판올 추출시료를 사용하여 하기 HPLC 조건에 의해 MK-7 함량을 측정하였다. 결과를 도 2 에 나타낸다. 도 2 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 운남 SL-001 균은, 수추출시료 및 이소프판올 추출시료 양쪽다 다른 시판 낫또균에 비하여 높은 MK-7 양을 나타내고, 특히 수추출시료에서 의미있는 MK-7 양의 차가 인정되었다.

또, 본 실시예에서, 고속액체 크로마토그래피 (HPLC) 에 의한 MK-7 양의 측정은, 비타민 K 가 백금-알루미나 촉매에 의해 하이드로퀴논체로 환원되어 형광물질이 되는 것을 이용하는 것으로, 구체적으로는 다음의 조건에서 측정하였다.

장치

펌프 : PU-980 (닛뽄분꼬 제조)

인젝터 : 7125 (닛뽄분꼬 제조)

칼럼오븐: CO-965 (닛뽄분꼬 제조)

검출기 : 형광검출기 821-FP (닛뽄분꼬 제조)

데이터처리장치: C-R5A (시마즈세이사꾸쇼 제조)

조건

칼럼 : ODS-Ⅱ 칼럼 (4.6 ×250 ㎜) (시마즈세이사꾸쇼 제조)

환원칼럼 : 백금-알루미나 촉매 칼럼 (와꼬쥰야꾸 제조, 일급 백금-알루미나, Pt = 5 % 를 약 0.2 g 충전한다 ; 4.0 φ×10 ㎜)

이동상 : 97 % 에탄올 (유속 ; 0.7 ㎖ / 분)

분리·환원온도 : 40 ℃

측정파장 : 여기 320 ㎚

형광 430 ㎚

주입량 : 10 ㎕

이러한 측정방법에 의해, MK-7, 메나퀴논-4 및 비타민 K₁에 대하여 검량선을 작성한 결과, MK-7 양은 0.05 ∼ 50 ng 의 범위에서 식 [-0.89661 + 1.6993 ×10^-6×(비타민 K 에 상당하는 HPLC 의 면적 (μV, sec))] 에 의해, 및 메나퀴논-4 및 비타민 K₁의 양은, 0.01 ∼ 10 ng 의 범위에서 각각 식 [-0.58657 + 4.8030 ×10^-9×(비타민 K 에 상당하는 HPLC 의 면적 (μV, sec))] 및 식 [-0.44381 + 4.0626 ×10^-7×(비타민 K 에 상당하는 HPLC 의 면적 (μV, sec))] 에 의해 측정이 가능하였다.

또, 검량선을 작성할 때의 MK-7 의 표준품은 다음에 따라 제조하였다. 즉, 600 g 의 낫또에 75 % 이소프로판올 1 리터 및 n-헥산 1 리터를 첨가하여, 1 시간동안 천천히 교반, 정치하였다. 분리한 2 층 중 상층을 취하여, 무수황산나트륨으로 건조, 증발건조 고화함으로써 추출물 약 20 g 을 얻었다. 이것을 10 ㎖ 의 n-헥산과 혼합하여, 400 ㎖ 의 크로마토그래피용 실리카겔을 거쳐 흡착시키고, 2리터의 n-헥산/톨루엔 (1:1) 으로 용출·분획하였다. MK-7 을 포함하는 분획을 감압하에 증발 건조고화하여, 얻어진 실리카겔 농축물을 5 ㎖ 의 n-헥산으로 용해하고, 상기와 동일한 방법으로 다시 실리카겔칼럼으로 분획하고, 감압하에서 증발 건조고화하여 약 350 ㎎ 을 얻었다. 이 중, 50 ㎎ 를 소량의 아세톤에 용해하고, 아세토니트릴/메탄올 (1:1) 로 충전한 60 ㎖ 의 크로마토그래피용 ODS 실리카겔에 통액하여, 아세토니트릴/메탄올 (1:1) 에 의해 전개하였다. 용출액을 HPLC 로 모니터링하면서, MK-7 으로 생각되는 물질이 단독으로 용출되어 있는 분획을 분리채취하여, 감압 건조고화하였다. 얻어진 물질에 대하여 적외흡수 스펙트럼 및 매스 스펙트럼을 얻어, MK-7 임을 확인하였다. 또, 이 물질의 순도를 검정한 결과 99.8 % 였다. 또, 피로퀴논 (비타민 K₁) 및 메나퀴논-4 (MK-4) 의 표준품으로서는, 각각 시그마사 (Sigma) 제조의 특급품을 사용하였다. 측정은 3 회 추출하여 분석한 평균치에 의해 구하였다.

실시예 2

운남 SL-001 균의 수추출시료를 실시예 1 과 동일한 방법으로 제조하고, 표준 피브린 평판법에 따라 혈전의 용해성을 평가하였다. 간단히 말하면, 이 수추출시료 30 ㎕ 를 샬레안에서 제작한 인공혈전 (표준 피브린 평판) (H.Sumi et al.,Experientia, 43:1110-111, 1987) 위에 올리고, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션한 결과 혈전의 용해가 관찰되었다. 이 결과로부터, 운남 SL-001 균의 수추출시료가 너트 우키나아제 (NK) 에 의한 혈전용해활성이 있음이 확인되었다.

실시예 3

운남 SL-001 균의 수추출시료를 실시예 1 과 동일한 방법으로 제조하고, 합성기질 분해법에 따라 플라스민의 기질의 분해성을 평가하였다. 구체적으로는, 이 수추출시료 10 ㎕ 및 5 ×10^-3M 의 S-2251 (플라스민의 기질; H-D-Val-Leu-Lys-pNA) 20 ㎕ 을 0.1 M 트리스 완충액 (pH 7.4) 170 ㎕ 에 첨가하고, 이것을 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션한 결과, 405 ㎚ 에서의 흡광도 (A₄₀₅) 가 0.168 이고, S-2251 의 분해가 관찰되었다. 이 결과로부터도 역시, 운남 SL-001 균의 수추출시료에는 너트 우키나아제 (NK) 에 의한 혈전용해활성이 있음이 확인되었다.

실시예 4

별도로, 슬란트에 보존된 시판의 낫또균주인 미야기노균 및 운남 SL-001 균 (FERM BP-6713) 일백금이를 각각 슬란트에서 9.5 ㎖ 의 멸균수에 현탁하고, 이 균체현탁수 0.5 ㎖ 를 상기 멸균이 완료된 비지에 각각 식균한 후, 37 ℃ 에서 10 일간 인큐베이션하였다.

배양기간 중, 낫또균에 의한 비지 배양물을 시간의 경과에 따라 (1, 2, 4, 6, 8 및 10 일째) 에 빼어내어, 이 배양물로부터 실시예 1 과 동일한 방법으로 이소프로판올 추출시료를 각각 제조하고, 다시 이 이소프로판올 추출시료 중의 MK-7 함량을 실시예 1 과 동일한 방법으로 측정하였다. 결과를 도 3 에 나타낸다.

도 3 에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 운남 SL-001 균의 배양물은, 일반적인 시판의 낫또균주인 미야기노균에 비해 모든 배양시간에서 의미가 있는 높은 MK-7 양을 나타낼 뿐만 아니라, 보다 짧은 시간에서 MK-7 양의 피크가 관찰되기 때문에, 본 발명의 운남 SL-001 균이 신속하면서 고효율로 비타민 K 의 일종인 MK-7 을 생산할 수 있음을 나타내고, 대량생산에 매우 적합한 것을 알 수 있었다.

실시예 5

비지 (아사히마쯔쇼꾸힌 가부시키가이샤 제조, 이이다시) 를 - 25 ℃ 에서 동결보존하고, 필요시에 해동하여 사용하였다. 해동한 비지를, 120 ℃ 에서 30 분간 오토클레이브에서 멸균한 후, 약 120 ㎖ 용 폴리스티렌 페이퍼 (PSP) 용기에 넣어 이것을 낫또균의 배지로 하였다.

별도로, 시판의 낫또에 사용되어 있는 4 종의 낫또균주 (다까하시균, 나루세균, 미야기노균 및 아사히균), 약제로서 사용되고 있는 2 종의 낫또균주 (닛또균 및 메구로균), 및 운남 SL-001 균의 합계 7 종의 낫또균을 각각 500 ㎖ 용 삼각 플라스크 내에서 150 ㎖ 의 3 % 영양 부용 (nutrient broth) (건조 부용) (닛쓰이세이야꾸 가부시끼가이샤 제조) 배지 중에서 37 ℃, 3 일간, 진탕배양 (100 rpm) 함으로써 상기 7 종의 낫또균의 전 배양액을 제조하였다.

상기에서 제조된 비지 (습중량 50 g) 에 이들 합계 7 종의 낫또균의 전 배양액 (생균수 : 2 ×10⁸개/㎖) 0.5 ㎖ 를 각각 첨가하고, 37 ℃ 에서 정치하여 계속 발효하였다. 발효를 시작하고 나서 4 일째, 낫또균을 수중에 현탁하고, 이것을금속제의 쇠그물 조리로 여과한 다음 원심분리 (3,000 rpm ×10 분) 함으로써 각 균체의 배양물을 제조하고, 이 배양물에서 실시예 1 과 동일한 방법으로 수추출시료를 제조하고, 이 시료에서의 MK-7 유도체의 양을 실시예 1 에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 이 결과를 도 4 에 나타낸다.

도 4 에 나타낸 바와 같이, 4 일간 배양한 후의 각종 낫또균의 배양물에서의 MK-7 유도체의 생산량이 평균하여 운남 SL-001 균에서 36.6 ㎍/g 비지 습중량; 미야기노균에서 1.9 ㎍/g 비지 습중량; 나루세균에서 14.2 ㎍/g 비지 습중량; 다까하시균에서 6.8 ㎍/g 비지 습중량; 아사히균에서 11.9 ㎍/g 비지 습중량; 메구로균에서 1.9 ㎍/g 비지 습중량; 및 닛또균에서 5.2 ㎍/g 비지 습중량이고, 특히 본 발명의 운남 SL-001 균은 36.6 ㎍/g 비지 습중량으로 높은 MK-7 생산량을 나타내며, 이 값은 계산상 다른 낫또균의 생산량에 비하여 2 ∼ 20 배라는 높은 값으로, 또한 종래 보고 (야마구치 노부오 감수, 일본식품성분표, 의치약출판, 도꾜, 1997 년, pp.52-53; 사까노도시유끼 외, 비타민, 62, 393-398 (1998); H. Ikeda and Y.Doi, Eur.J.Biochem.,192, 219-223 (1990); 및 이께다히로, 가정지, 43, 643-648 (1992)) 되어 있는 낫또의 분석치 (6.2 ∼ 8.7 ㎍/g 비지 습중량) 의 4 배 이상이라고 하는 높은 것이었다.

실시예 6

비지는, 아사히마쯔쇼꾸힌 가부시키가이샤 (이이다시) 로부터 제공된 것을 - 25 ℃ 에서 동결보존하고, 필요시에 해동하여 사용하였다.

별도로, 본 발명의 운남 SL-001 균을, 500 ㎖ 용 삼각 플라스크 내에서 150㎖ 의 3 % 영양 부용 (nutrient broth) (건조 부용) (닛쓰이세이야꾸 가부시끼가이샤 제조) 배지 중에서 37 ℃, 3 일간, 진탕배양 (100 rpm) 함으로써 낫또균의 전 배양액을 제조하였다.

해동한 비지 1 kg (습중량) 을 120 ℃ 에서 30 분간 오토클레이브로 멸균한 다음, 약 120 ㎖ 용량의 폴리스티렌 페이퍼 (PSP) 용기에 넣었다. 이 용기에 상기에서 제조된 운남 SL-001 균의 전 배양액을 첨가하고, 37 ℃ 에서 4 일간 발효시켰다. 이렇게 하여 발효시킨 비지 낫또 1 kg (습중량) 에 대하여 5 리터의 물을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반한 후, 원심분리 (3,000 rpm, 10 분간) 하였다. 얻어진 상청에 대하여, 620 g 의 이온교환수지 (DEAE-Sepharose CL-613) 를 첨가하여 교반한 후, 실온에서 30 분간 정치하였다. 다음으로, 이것을 유리칼럼 (7.5 ㎝φ×100 ㎝) 에 충전하고, 증류수 및 0.05 M 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 세정한 후, 0.1 ∼ 0.8 M NaCl 을 포함하는 0.05 M 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 그래디언트(gradient) 융출하였다. 각 분획에 대하여 실시예 1 과 동일한 HPLC 법에 의해 비타민 K 양을 측정하여, 비타민 K 를 포함하는 분획을 멤브레인 필터 (Millipore 제, 분자량 10,000) 으로 농축하고, 증류수로 투석한 다음, 동결건조하여 엷은 황색 분말로서 수용성 비타민 K 유도체를 얻었다.

이렇게 하여 얻은 수용성 비타민 K 유도체 및 상기와 동일한 비지를 이소프로판올로서 추출한 것을 HPLC 에 의해 분석하고, 그 결과를 도 5 에 나타낸다. 또, 도 5 에서, MK-4, 비타민 K₁및 MK-7 의 보존시간은 각각 약 8.2 분, 약 11.3분 및 약 17.5 분이고, 화살표는 MK-7 의 보존시간을 나타낸다. 도 8 에서, 비지의 이소프로판올 추출물의 60 % 이상이 수용성 분획으로 추출되고, 또 비타민 K 로서는, 비타민 K₁, MK-4 의 양은 적으며, 항상 95 % 이상을 MK-7 이 차지하고 있음을 알았다.

또, 이 수용성 비타민 K 유도체에 대하여, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의한 분석을 실시한 결과, 분자량 약 10 만의 위치에 폭넓은 단일의 밴드를 나타내었다. 이 결과로부터, 수용성 비타민 K 유도체는 다른 당단백질과 분자량 약 10 만의 복합체를 형성하고 있는 것은 아닌지 고찰된다. 또, 이때의 낫또 1 kg 으로부터의 수용성 비타민 K 유도체의 수율은, 3 회의 조작에 의해 평균 약 5.3 g (830 ㎍ 수용성 MK-7 유도체/g 을 포함한다) 이었다.

실시예 7

500 ㎖ 용 삼각 플라스크 5 개에, 각각 300 ㎖ 의 3 % 건조 부용 (닛쓰이세이야꾸 가부시끼가이샤 제조) 배지를 넣어, 120 ℃ 에서 15 분간 오토클레이브 멸균하였다. 이들 배지에 운남 SL-001 균을 일백금이씩 접종하여, 37 ℃ 에서 진탕배양 (100 rpm) 하였다. 4 일후, 배양액을 합친 것을 원심분리 (5,000 rpm ×10 분) 하여, 얻어진 상청을 400 ㎖ 씩 3 개로 나눈 후, 각 상청의 pH 를 묽은 염산으로 1.02, 2.07 및 3.01 로 조절하였다. 실온에서 3 시간 방치한 다음, 상청을 원심분리 (5,000 rpm ×10 분, 10 ℃) 하여 백색의 침전을 분리하였다. 이 백색침전을 소량의 증류수에 녹이고, 중탄산 암모늄 분말에 의해 pH 를 7.0 으로 조절한 다음, 동결건조하였다. 그 결과, 동결건조물의 중량은, 1.02, 2.07 및 3.01 의 pH 의 경우 각각 0.52 g, 0.28 g 및 0.31 g 이었다. 이러한 조작을 반복하였다.

다음으로, 이 동결건조물 1 g (건조중량) 을 100 ㎖ 헥산으로 속슬렛 추출기 (SIBATA SPC 34, WATER BATH SIBATA WB-6C, 여과지: ADVANTEC 84 24 × 100 mm) 로 80 ℃ 에서 6 시간 추출한 후, 전체 액량을 헥산에 의해 100 ㎖ 로 조절하였다. 이 추출물 100 ㎕ 을 1.0 ㎖ 의 증류수 및 1.5 ㎖ 의 이소프로판올과 혼합하고, 또 4.9 ㎖ 의 헥산을 터치믹서에 의해 약 10 초간 혼합하였다. 이 혼합액을 원심분리 (3,000 rpm ×10 분, 20 ℃) 하였다. 얻어진 헥산층 4.0 ㎖ 을 이배퍼레이터로 농축·건조고화한 후, 이를 100 ㎕ 의 에탄올에 용해하였다. 이렇게 하여 제조된 시료에 대하여, 실시예 1 과 동일한 HLPC 법에 의해 MK-7 함량 (㎍/g 건조물) 을 측정한 결과, 1.02, 2.07 및 3.01 의 pH 의 경우, 각각 2,800 ㎍/g 건조물, 2,200 ㎍/g 건조물 및 2,000 ㎍/g 건조물이었다.

또, 각 동결건조물 15 ㎎ 을 증류수 5 ㎖ 에 첨가한 용액을 원심분리 (10,000 rpm ×10 분) 하였다. 얻어진 상청 (수용성 분획) 에 대하여 동일한 방법으로 MK-7 유도체의 함량을 조사한 결과, 1.02, 2.07 및 3.01 의 pH 의 경우, 각각 1,500 ㎍/g 건조물, 1,800 ㎍/g 건조물 및 1,800 ㎍/g 건조물이었기 때문에, 각 수용성 분획의 가용화율은 약 54 %, 약 82 % 및 약 90 % 임을 알았다.

본 발명의 운남 SL-001 균은 비타민 K 또는 그 유도체를 효율적으로 생산할 수 있다.

또, 본 발명의 운남 SL-001 균은 식품으로부터 단리한 것으로, 높은 안전성을 갖기 때문에, 본 발명의 운남 SL-001 균의 배양물 및 배양액을 그대로 식품첨가물로 또는 식품으로 사용하는 것이 기대된다.

또한, 본 발명의 운남 SL-001 균의 배양물 및 배양액에서 얻은 비타민 K 또는 그 비타민 K 유도체도 역시, 운남 SL-001 균이 식품을 베이스로 하고 그 배양물 및 배양액이 안전하기 때문에, 높은 안전성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 운남 SL-001 균의 배양물 및 배양액에서 얻은 비타민 K 또는 그 비타민 K 유도체를 그대로 식품첨가물로서 또는 식품으로 사용하는 것이 기대된다. 상기 이점에 추가하여, 본 발명의 운남 SL-001 균은, 지용성의 비타민 K 에 부가하여 수용성의 비타민 K 유도체도 고수율로 생산할 수 있기 때문에, 보다 광범위한 용도를 기대할 수 있다.

Claims

고초균 (Bacillus subtilis) 에 속하는 운남 SL-001 균 FERM BP-6713.