JPH07246097A - トレハロースの製造方法 - Google Patents
トレハロースの製造方法Info
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- JPH07246097A JPH07246097A JP6220594A JP6220594A JPH07246097A JP H07246097 A JPH07246097 A JP H07246097A JP 6220594 A JP6220594 A JP 6220594A JP 6220594 A JP6220594 A JP 6220594A JP H07246097 A JPH07246097 A JP H07246097A
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- trehalose
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- candida
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 医薬品、食品、農業分野への応用が期待され
るトレハロースの新規な製造方法を提供する。 【構成】 キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する
トレハロース生産性酵母、例えば、トレハロース資化性
を欠損させた突然変異株であるキャンディダ フェアメ
ンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．
３１１０ｔｎ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１８７）、トレハ
ロースの資化性と蓄積性を同時に欠損した菌株から得た
トレハロース資化性復帰変異株であるキャンディダ フ
ェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）
Ｎｏ．３１１０ｔｒ株（ＦＥＲＭＰ−１４１８８）など
を培養し、培養物からトレハロースを採取することによ
りトレハロースを効率的に製造する。
るトレハロースの新規な製造方法を提供する。 【構成】 キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する
トレハロース生産性酵母、例えば、トレハロース資化性
を欠損させた突然変異株であるキャンディダ フェアメ
ンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．
３１１０ｔｎ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１８７）、トレハ
ロースの資化性と蓄積性を同時に欠損した菌株から得た
トレハロース資化性復帰変異株であるキャンディダ フ
ェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）
Ｎｏ．３１１０ｔｒ株（ＦＥＲＭＰ−１４１８８）など
を培養し、培養物からトレハロースを採取することによ
りトレハロースを効率的に製造する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医薬品、食品、農業分
野への応用が期待されるトレハロースの新規な製造方法
に関する。
野への応用が期待されるトレハロースの新規な製造方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】トレハロースは、生物に普遍的に存在
し、微生物や植物においてはエネルギー貯蔵物質とし
て、また熱、乾燥、凍結、浸透圧などの環境変化に対す
る保護物質として知られている。酵母においても、例え
ばパン酵母におけるトレハロースの蓄積と環境耐性との
関係が明らかにされている（化学と生物 ３１，６，３
７４〜３８１，１９９３）。また昆虫においては、飛行
のエネルギー源として利用されることが知られている。
し、微生物や植物においてはエネルギー貯蔵物質とし
て、また熱、乾燥、凍結、浸透圧などの環境変化に対す
る保護物質として知られている。酵母においても、例え
ばパン酵母におけるトレハロースの蓄積と環境耐性との
関係が明らかにされている（化学と生物 ３１，６，３
７４〜３８１，１９９３）。また昆虫においては、飛行
のエネルギー源として利用されることが知られている。
【０００３】一方、トレハロースの製造方法として、
１）パン酵母などのトレハロース蓄積量の多い菌株を培
養し、熱水やアルコールなどで抽出する方法（特開平４
−３６０６９２号、特開平５−９１８９０号）、２）ブ
レビバクテリウム属などの細菌を用いて培養液中に生産
させる方法（特開平５−２１２８８２号）、３）マルト
ースをマルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホ
リラーゼ処理することによる方法（特開昭５８−２１６
６９５号）などが知られている。
１）パン酵母などのトレハロース蓄積量の多い菌株を培
養し、熱水やアルコールなどで抽出する方法（特開平４
−３６０６９２号、特開平５−９１８９０号）、２）ブ
レビバクテリウム属などの細菌を用いて培養液中に生産
させる方法（特開平５−２１２８８２号）、３）マルト
ースをマルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホ
リラーゼ処理することによる方法（特開昭５８−２１６
６９５号）などが知られている。
【０００４】また、パン酵母などでは、トレハロースの
蓄積量を増加させるために細胞内のトレハロース分解酵
素（トレハラーゼ）の活性を抑える試み（例えば、変異
によるトレハラーゼ活性の欠損、酵素阻害剤の添加な
ど）がなされてきたが、細胞内には性質の異なる種々の
トレハラーゼが各所に存在し、また様々な原因でそれら
は誘導されるので、その活性を抑えることは困難である
とされている。
蓄積量を増加させるために細胞内のトレハロース分解酵
素（トレハラーゼ）の活性を抑える試み（例えば、変異
によるトレハラーゼ活性の欠損、酵素阻害剤の添加な
ど）がなされてきたが、細胞内には性質の異なる種々の
トレハラーゼが各所に存在し、また様々な原因でそれら
は誘導されるので、その活性を抑えることは困難である
とされている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、トレハロー
スを効率的に製造する方法を提供するものである。
スを効率的に製造する方法を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、キャンデ
ィダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、特にキャンディダ フェア
メンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）に属
する酵母が細胞内にトレハロースを構成的に蓄積するこ
と、その酵母のトレハラーゼ活性が変異処理により容易
に欠損できること、さらにこれらの突然変異株が変異す
る前の酵母に比べ著量のトレハロースを生産することを
見出し、本発明を完成した。
ィダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、特にキャンディダ フェア
メンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）に属
する酵母が細胞内にトレハロースを構成的に蓄積するこ
と、その酵母のトレハラーゼ活性が変異処理により容易
に欠損できること、さらにこれらの突然変異株が変異す
る前の酵母に比べ著量のトレハロースを生産することを
見出し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、キャンディダ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ）属に属するトレハロース生産性酵母の突然
変異株を培養し、培養物からトレハロースを採取するこ
とを特徴とするトレハロースの製造方法を提供するもの
である。
ｎｄｉｄａ）属に属するトレハロース生産性酵母の突然
変異株を培養し、培養物からトレハロースを採取するこ
とを特徴とするトレハロースの製造方法を提供するもの
である。
【０００８】本発明に使用する酵母は、キャンディダ
（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属し、トレハロースを生産する
能力を有する菌株を変異処理によりトレハロース資化性
を欠損させた菌株であるか、あるいは同じくキャンディ
ダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属し、トレハロースを生産す
る能力を有する菌株を変異処理によりトレハロースの資
化性と蓄積性を同時に欠損した菌株から得たトレハロー
ス資化性復帰変異株であれば、いずれの菌株でも使用で
きる。
（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属し、トレハロースを生産する
能力を有する菌株を変異処理によりトレハロース資化性
を欠損させた菌株であるか、あるいは同じくキャンディ
ダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属し、トレハロースを生産す
る能力を有する菌株を変異処理によりトレハロースの資
化性と蓄積性を同時に欠損した菌株から得たトレハロー
ス資化性復帰変異株であれば、いずれの菌株でも使用で
きる。
【０００９】本発明に使用する酵母の親菌株は、例えば
中華民国台中市で採取された土壌から分離されたキャン
ディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅ
ｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１２３４
８）を挙げることができるが、この菌株以外でもキャン
ディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属し、トレハロースを生
産する能力を有する菌株であれば、いずれも本発明に用
いられる変異菌株の親菌株として用いることができる。
また、本発明の目的に適する変異菌株を単離するには、
トレハロースを生産する能力を有する前述の親菌株をそ
れ自体公知の変異方法、例えば、紫外線処理、ＮＴＧ
（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン）処理などを行い、適宜選択すればよい。
中華民国台中市で採取された土壌から分離されたキャン
ディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅ
ｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１２３４
８）を挙げることができるが、この菌株以外でもキャン
ディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属し、トレハロースを生
産する能力を有する菌株であれば、いずれも本発明に用
いられる変異菌株の親菌株として用いることができる。
また、本発明の目的に適する変異菌株を単離するには、
トレハロースを生産する能力を有する前述の親菌株をそ
れ自体公知の変異方法、例えば、紫外線処理、ＮＴＧ
（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン）処理などを行い、適宜選択すればよい。
【００１０】なお、キャンディダ フェアメンティ（Ｃ
ａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０株
は、以下の菌学的性状を有する。 １．形態的性質 ３〜７μｍの卵型ないしは球形をし、菌糸様の構造体は
ない。セッコウ、クライン培地、麦芽エキス培地のいず
れでも胞子は全く形成しない。
ａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０株
は、以下の菌学的性状を有する。 １．形態的性質 ３〜７μｍの卵型ないしは球形をし、菌糸様の構造体は
ない。セッコウ、クライン培地、麦芽エキス培地のいず
れでも胞子は全く形成しない。
【００１１】２．生理学的性質 バーネット（Ｊ．Ａ．Ｂａｒｎｅｔ）らによるイースト
（Ｙｅａｓｔ）：キャラクタリゼーション アンド ア
イデンティフィケーション（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ
ｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）第
２版に従い、分類同定を行った。本菌株の各種生理学的
性質は、以下の通りである。
（Ｙｅａｓｔ）：キャラクタリゼーション アンド ア
イデンティフィケーション（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ
ｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）第
２版に従い、分類同定を行った。本菌株の各種生理学的
性質は、以下の通りである。
【００１２】 （１） 発酵性試験 Ｄ−グルコース ＋ ラクトース − Ｄ−ガラクトース − セロビオース − マルトース − メレチトース − メチルα−Ｄ−グルコサイド − ラフィノース ＋ シュークロース ＋ イヌリン ＋ α，α−トレハロース − スターチ − メリビオース − Ｄ−キシロース −
【００１３】 （２） 生育試験 Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−ガラクトース − Ｌ−ソルボース ＋ Ｄ−グルコサミン − Ｄ−リボース − Ｄ−キシロース − Ｌ−アラビノース − Ｌ−ラムノース − シュークロース ＋ マルトース − α，α−トレハロース ＋ メチルα−Ｄ−グルコサイド − セロビオース − サリシン − アルブチン − メリビオース − ラクトース − ラフィノース ＋ メレチトース − イヌリン ＋ スターチ − グリセロール ＋ エリスリトール − リビトール − キシリトール ＋ Ｌ−アラビトニール − Ｄ−グルシトール − Ｄ−マンニトール ＋ ガラクチトール − ミオイノシトール − Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ ２−ケト−Ｄ−グルコン酸 ＋ ５−ケト−Ｄ−グルコン酸 − Ｄ−グルコン酸 − Ｄ−グルクロン酸 ＋ Ｄ−ガラクツロン酸 − ＤＬ−乳酸 ＋ コハク酸 − クエン酸 − メタノール − エタノール − プロパン−１，２−ジオール − ブタン−１，２−ジオール − 硝酸カリウム − 亜硝酸カリウム − エチルアミン − Ｌ−リジン ＋ ガダベリン Ｄ クレアチニン − グルコサミン ＋ ビタミン 欠 ＋ Ｄ：生育が遅れる
【００１４】（３） 耐性試験 ０．０１％シクロヘキシミド − ０．１％シクロヘキシミド − １％酢酸 − ５０％Ｄ−グルコース ＋ ６０％Ｄ−グルコース ＋
【００１５】（４） 生育温度 ２５℃ ＋ ３０℃ ＋ ３５℃ − ３７℃ − ４０℃ − （５） 追加試験 ＤＢＢ反応 −
【００１６】３．その他の性質 （１） ユビキノン側鎖数 アグリカルチュラル アンド バイオロジカルケミスト
リー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第３７巻、第３号、６２１頁
（１９７３年）に従い、逆相薄層クロマトグラフィーを
用いて測定したところ、ユビキノン側鎖数は６単位であ
った。
リー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第３７巻、第３号、６２１頁
（１９７３年）に従い、逆相薄層クロマトグラフィーを
用いて測定したところ、ユビキノン側鎖数は６単位であ
った。
【００１７】（２） ＧＣ含量 学会出版センター刊、駒形和男編、微生物の化学分類実
験法、２２７頁−２４２頁の方法で行い、島津分光光度
計ＵＶ−２１１０と温度コントローラーＳＲＰ−８を用
いて、６０−１００℃の４０分間の直線温度勾配の際
の、１×ＳＳＣ緩衝液中の染色体ＤＮＡのＡ２６０変化
を追跡し、測定したＴｍ値からＧＣ（％）＝（ＴＭ−６
９．３）／０．４１の式のより求めたところ、本菌株の
核ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）は、４４．９％であっ
た。
験法、２２７頁−２４２頁の方法で行い、島津分光光度
計ＵＶ−２１１０と温度コントローラーＳＲＰ−８を用
いて、６０−１００℃の４０分間の直線温度勾配の際
の、１×ＳＳＣ緩衝液中の染色体ＤＮＡのＡ２６０変化
を追跡し、測定したＴｍ値からＧＣ（％）＝（ＴＭ−６
９．３）／０．４１の式のより求めたところ、本菌株の
核ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）は、４４．９％であっ
た。
【００１８】本発明の方法に使用するトレハロース資化
性を欠損しトレハロースを生産する菌株としては、上記
のキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母に由
来するもので、トレハロース資化性を欠損する変異によ
り得られる、トレハロース資化性がなくトレハロースを
生産する菌株がすべて含まれるが、好適なものとして、
前記キャンディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａ
ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０株を紫外線による
変異処理により得られたキャンディダ フェアメンティ
（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１
０ｔｎ株を挙げることができる。
性を欠損しトレハロースを生産する菌株としては、上記
のキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母に由
来するもので、トレハロース資化性を欠損する変異によ
り得られる、トレハロース資化性がなくトレハロースを
生産する菌株がすべて含まれるが、好適なものとして、
前記キャンディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａ
ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０株を紫外線による
変異処理により得られたキャンディダ フェアメンティ
（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１
０ｔｎ株を挙げることができる。
【００１９】本発明の目的に適する、トレハロース資化
性を欠損しトレハロースを生産する菌株を単離するに
は、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属し、トレハ
ロースを生産する能力を有する菌株をそれ自体公知の変
異処理を行うことにより取得することができる。以下、
その一例を示す。
性を欠損しトレハロースを生産する菌株を単離するに
は、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属し、トレハ
ロースを生産する能力を有する菌株をそれ自体公知の変
異処理を行うことにより取得することができる。以下、
その一例を示す。
【００２０】キャンディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄ
ｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０株の１白
金耳をＭＹ液体培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス
０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１％、ｐ
Ｈ５．５）に接種し、２８℃で１６時間培養し、滅菌水
で２回洗浄した。これをシャーレに入れ、３０ｃｍの距
離から紫外線ランプ（１５Ｗ）で２分間照射した後、炭
素源を欠くイーストニトロゲン培地（Ｄｉｆｃｏ）５ｍ
ｌに懸濁し、一夜培養した。遠心分離により集菌し、ト
レハロースを０．５％含むイーストニトロゲン培地に懸
濁し、５時間培養した後、ナイスタチンを１０μｇ／ｍ
ｌ添加し、さらに２時間培養を継続した。これを滅菌水
で２回洗浄し、グリセリンＭＹプレート（酵母エキス
０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５
％、グリセリン１％、寒天２％、ｐＨ５．５）にまき、
生育したコロニーの中でトレハロースを炭素源とする培
地で生育できない菌株を選択した。
ｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０株の１白
金耳をＭＹ液体培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス
０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１％、ｐ
Ｈ５．５）に接種し、２８℃で１６時間培養し、滅菌水
で２回洗浄した。これをシャーレに入れ、３０ｃｍの距
離から紫外線ランプ（１５Ｗ）で２分間照射した後、炭
素源を欠くイーストニトロゲン培地（Ｄｉｆｃｏ）５ｍ
ｌに懸濁し、一夜培養した。遠心分離により集菌し、ト
レハロースを０．５％含むイーストニトロゲン培地に懸
濁し、５時間培養した後、ナイスタチンを１０μｇ／ｍ
ｌ添加し、さらに２時間培養を継続した。これを滅菌水
で２回洗浄し、グリセリンＭＹプレート（酵母エキス
０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５
％、グリセリン１％、寒天２％、ｐＨ５．５）にまき、
生育したコロニーの中でトレハロースを炭素源とする培
地で生育できない菌株を選択した。
【００２１】単離した菌株をＭＹ液体培地で上記と同様
に培養し、遠心分離により菌体を集め、冷却したアセト
ンで２回洗浄した。吸引によりアセトンを除き、粉末を
得た。 獲られた粉末の１０ｍｇを２５ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．５）１８０μｌに懸濁し、さらに
２５０ｍＭトレハロース水溶液２０μｌを加え、経時的
に残存するトレハロースを液体クロマトグラフィー法に
より測定したところ、多数のトレハロース分解活性欠損
株が得られた。なお、カラムはＣＬＣ−ＮＨ２（島津製
作所）、移動相は７０％アセトニトリル、検出器は示差
屈折計ＲＩＤ−７Ａ（島津製作所）を用いた。
に培養し、遠心分離により菌体を集め、冷却したアセト
ンで２回洗浄した。吸引によりアセトンを除き、粉末を
得た。 獲られた粉末の１０ｍｇを２５ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．５）１８０μｌに懸濁し、さらに
２５０ｍＭトレハロース水溶液２０μｌを加え、経時的
に残存するトレハロースを液体クロマトグラフィー法に
より測定したところ、多数のトレハロース分解活性欠損
株が得られた。なお、カラムはＣＬＣ−ＮＨ２（島津製
作所）、移動相は７０％アセトニトリル、検出器は示差
屈折計ＲＩＤ−７Ａ（島津製作所）を用いた。
【００２２】次にこれらトレハロース分解活性欠損株の
細胞内トレハロース量を以下の方法で測定し、親菌株と
比較してトレハロース蓄積量が顕著に増加した菌株を選
択した。すなわち、上記の操作により得られたトレハロ
ース分解活性欠損株を３０ｍｌのＭＹ液体培地（酵母エ
キス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．
５％、グルコース１％、ｐＨ５．５）を含む２５０ｍｌ
フラスコに接種し、２５℃で１〜２日間培養し、これを
遠心分離で集菌し水でよく洗浄した後、さらに３０ｍｌ
の水の懸濁し、１２０℃、１５分加熱処理し、細胞内の
トレハロースを抽出し、液体クロマトグラフィー法によ
りトレハロースを定量して、親菌株と比較し蓄積量が顕
著に増加した菌株を選択した。
細胞内トレハロース量を以下の方法で測定し、親菌株と
比較してトレハロース蓄積量が顕著に増加した菌株を選
択した。すなわち、上記の操作により得られたトレハロ
ース分解活性欠損株を３０ｍｌのＭＹ液体培地（酵母エ
キス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．
５％、グルコース１％、ｐＨ５．５）を含む２５０ｍｌ
フラスコに接種し、２５℃で１〜２日間培養し、これを
遠心分離で集菌し水でよく洗浄した後、さらに３０ｍｌ
の水の懸濁し、１２０℃、１５分加熱処理し、細胞内の
トレハロースを抽出し、液体クロマトグラフィー法によ
りトレハロースを定量して、親菌株と比較し蓄積量が顕
著に増加した菌株を選択した。
【００２３】以上の方法により、本発明の目的に適する
変異菌株は、グリセリンＭＹプレートに生育するコロニ
ー１００株に約１株の割合で取得された。このようにし
て得られる菌株の一つであるキャンディダ フェアメン
ティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３
１１０ｔｎ株の菌学的性状は、トレハロース資化性が欠
損していることを除き、親菌株であるＮｏ．３１１０株
と同一の性質を示した。
変異菌株は、グリセリンＭＹプレートに生育するコロニ
ー１００株に約１株の割合で取得された。このようにし
て得られる菌株の一つであるキャンディダ フェアメン
ティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３
１１０ｔｎ株の菌学的性状は、トレハロース資化性が欠
損していることを除き、親菌株であるＮｏ．３１１０株
と同一の性質を示した。
【００２４】本菌株は、平成６年１月 日付けで工業技
術院生命工学工業技術研究所へ、キャンディダ フェア
メンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎ
ｏ．３１１０ｔｎ（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１８７）として
寄託されている。
術院生命工学工業技術研究所へ、キャンディダ フェア
メンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎ
ｏ．３１１０ｔｎ（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１８７）として
寄託されている。
【００２５】さらに本発明の方法に使用するもう一つの
変異株であるトレハロースの資化性と蓄積性を同時に欠
損した菌株から得たトレハロース資化性復帰変異株とし
ては、上記のキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属す
る酵母に由来するもので、トレハロースの資化性と蓄積
性を同時に欠損した菌株からトレハロース資化性が回復
した復帰変異により得られる、トレハロースを生産する
菌株がすべて含まれるが、好適なものとして、前記キャ
ンディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａｆｅｒｍｅ
ｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０株を紫外線により変異させた
トレハロースの資化性と蓄積性を同時に欠損した菌株か
ら分離した、トレハロース資化性復帰変異株キャンディ
ダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔ
ｉｉ）Ｎｏ．３１１０ｔｒ株を挙げることができる。
変異株であるトレハロースの資化性と蓄積性を同時に欠
損した菌株から得たトレハロース資化性復帰変異株とし
ては、上記のキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属す
る酵母に由来するもので、トレハロースの資化性と蓄積
性を同時に欠損した菌株からトレハロース資化性が回復
した復帰変異により得られる、トレハロースを生産する
菌株がすべて含まれるが、好適なものとして、前記キャ
ンディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａｆｅｒｍｅ
ｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０株を紫外線により変異させた
トレハロースの資化性と蓄積性を同時に欠損した菌株か
ら分離した、トレハロース資化性復帰変異株キャンディ
ダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔ
ｉｉ）Ｎｏ．３１１０ｔｒ株を挙げることができる。
【００２６】本発明の目的に適する、トレハロースの資
化性と蓄積性を同時に欠損した菌株からトレハロース資
化性が回復したトレハロースを生産する復帰変異菌株を
単離するには、それ自体公知の手法により、キャンディ
ダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属するトレハロース生産菌株
を処理して取得することができる。以下、その一例を示
す。
化性と蓄積性を同時に欠損した菌株からトレハロース資
化性が回復したトレハロースを生産する復帰変異菌株を
単離するには、それ自体公知の手法により、キャンディ
ダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属するトレハロース生産菌株
を処理して取得することができる。以下、その一例を示
す。
【００２７】キャンディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄ
ｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０株を前記
したトレハロースの分解活性欠損株を取得する操作と同
様の手順で変異処理及び細胞内トレハロース量の測定を
行い、トレハロースの資化性と蓄積性を同時に欠損した
菌株を取得した。以上の方法により、資化性と蓄積性を
同時に欠損した変異菌株は、グリセリンＭＹプレートに
生育するコロニー１００株に約１株の割合で取得され
た。この１０8〜１０9個をトレハロースを炭素源とする
イーストニトロゲン培地（トレハロース０．５％）に塗
布し、２８℃、３日間培養することにより、１０-8程度
の頻度でトレハロースを資化できる復帰変異株を得るこ
とができる。
ｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０株を前記
したトレハロースの分解活性欠損株を取得する操作と同
様の手順で変異処理及び細胞内トレハロース量の測定を
行い、トレハロースの資化性と蓄積性を同時に欠損した
菌株を取得した。以上の方法により、資化性と蓄積性を
同時に欠損した変異菌株は、グリセリンＭＹプレートに
生育するコロニー１００株に約１株の割合で取得され
た。この１０8〜１０9個をトレハロースを炭素源とする
イーストニトロゲン培地（トレハロース０．５％）に塗
布し、２８℃、３日間培養することにより、１０-8程度
の頻度でトレハロースを資化できる復帰変異株を得るこ
とができる。
【００２８】このようにして得られる菌株の一つである
キャンディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅ
ｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０ｔｒ株の菌学的性状
は、親菌株であるＮｏ．３１１０株と同一の性質を示し
た。
キャンディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅ
ｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０ｔｒ株の菌学的性状
は、親菌株であるＮｏ．３１１０株と同一の性質を示し
た。
【００２９】本菌株は、平成６年１月 日付けで工業技
術院生命工学工業技術研究所へ、キャンディダ フェア
メンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎ
ｏ．３１１０ｔｒ（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１８８）として
寄託されている。
術院生命工学工業技術研究所へ、キャンディダ フェア
メンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎ
ｏ．３１１０ｔｒ（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１８８）として
寄託されている。
【００３０】本発明のよるトレハロースの製造は、キャ
ンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母に由来し、
トレハロース資化性を欠損したトレハロースを生産する
菌株、例えば、前記キャンディダ フェアメンティ（Ｃ
ａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０ｔ
ｎ株、あるいはキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属
する酵母に由来し、トレハロースの資化性と蓄積性を同
時に欠損した菌株から得たトレハロース資化性復帰変異
株、例えばキャンディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉ
ｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０ｔｒ株を栄
養源含有培地に接種して、好気的に増殖させることによ
り生産される。
ンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母に由来し、
トレハロース資化性を欠損したトレハロースを生産する
菌株、例えば、前記キャンディダ フェアメンティ（Ｃ
ａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０ｔ
ｎ株、あるいはキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属
する酵母に由来し、トレハロースの資化性と蓄積性を同
時に欠損した菌株から得たトレハロース資化性復帰変異
株、例えばキャンディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉ
ｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０ｔｒ株を栄
養源含有培地に接種して、好気的に増殖させることによ
り生産される。
【００３１】その栄養源としては、酵母の栄養源として
通常使用されるもの、例えば炭素源としては、グルコー
ス、グリセリン、シュークロースなどが使用でき、窒素
源としては、例えば肉エキス、酵母エキス、ペプトン、
コーンスティープリカーなどの有機物、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アン
モニウムなどの無機体窒素が利用できる。また、必要に
応じて、食塩、塩化カリウム、リン酸塩、その他重金属
塩などの無機塩類およびビタミン類を添加する他、培養
中の発泡を抑制するため、例えばシリコーン（信越化学
株式会社製−ＫＭ７５；商標）などの消泡剤を適宜添加
することができる。
通常使用されるもの、例えば炭素源としては、グルコー
ス、グリセリン、シュークロースなどが使用でき、窒素
源としては、例えば肉エキス、酵母エキス、ペプトン、
コーンスティープリカーなどの有機物、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アン
モニウムなどの無機体窒素が利用できる。また、必要に
応じて、食塩、塩化カリウム、リン酸塩、その他重金属
塩などの無機塩類およびビタミン類を添加する他、培養
中の発泡を抑制するため、例えばシリコーン（信越化学
株式会社製−ＫＭ７５；商標）などの消泡剤を適宜添加
することができる。
【００３２】温度、ｐＨ、通気攪拌および培養時間のよ
うな培養条件は、用いられる菌株が最大量のトレハロー
スを蓄積するように選択する。例えば、ＭＹ液体培地を
用いた場合、２０〜３７℃、好ましくは２８〜３３℃の
温度でｐＨ４〜７、好ましくは５〜６において１〜２日
間行うのが有利である。
うな培養条件は、用いられる菌株が最大量のトレハロー
スを蓄積するように選択する。例えば、ＭＹ液体培地を
用いた場合、２０〜３７℃、好ましくは２８〜３３℃の
温度でｐＨ４〜７、好ましくは５〜６において１〜２日
間行うのが有利である。
【００３３】培養物よりトレハロースを単離するには、
公知の分離手段を適宜組合せて行うことができる。トレ
ハロースは酵母菌体内に蓄積するので、例えば菌体をメ
タノール、エタノール、アセトンなど水と混和する有機
溶媒に懸濁し、菌体からトレハロースを抽出し遠心分離
または濾過により菌体を分離し上清を得、これを減圧濃
縮、イオン交換樹脂処理、結晶化などの精製操作を単独
あるいは適宜組合せて、さらに場合によっては反復して
適用することによりトレハロース結晶を得ることができ
る。
公知の分離手段を適宜組合せて行うことができる。トレ
ハロースは酵母菌体内に蓄積するので、例えば菌体をメ
タノール、エタノール、アセトンなど水と混和する有機
溶媒に懸濁し、菌体からトレハロースを抽出し遠心分離
または濾過により菌体を分離し上清を得、これを減圧濃
縮、イオン交換樹脂処理、結晶化などの精製操作を単独
あるいは適宜組合せて、さらに場合によっては反復して
適用することによりトレハロース結晶を得ることができ
る。
【００３４】上記の培養方法で培養した場合には、前記
のとおりトレハロースは酵母菌体内に蓄積するが、培養
の途中でメタノール、エタノール、アセトンなど水と混
和する有機溶媒を２〜６％、あるいはデジトニンなどの
界面活性剤を０．１〜１％培地中に添加するか、または
培養した酵母菌体を冷却したメタノール、エタノール、
アセトンなど水と混和する有機溶媒で洗浄することによ
り菌体内で生産されたトレハロースが菌体外に排出する
透過型の菌体にすることができる。これらの処理により
菌体の増殖能は失われるが、培地中の栄養物からトレハ
ロースを生産する能力は失われない。
のとおりトレハロースは酵母菌体内に蓄積するが、培養
の途中でメタノール、エタノール、アセトンなど水と混
和する有機溶媒を２〜６％、あるいはデジトニンなどの
界面活性剤を０．１〜１％培地中に添加するか、または
培養した酵母菌体を冷却したメタノール、エタノール、
アセトンなど水と混和する有機溶媒で洗浄することによ
り菌体内で生産されたトレハロースが菌体外に排出する
透過型の菌体にすることができる。これらの処理により
菌体の増殖能は失われるが、培地中の栄養物からトレハ
ロースを生産する能力は失われない。
【００３５】有機溶媒で洗浄することにより調製した透
過型の菌体は直ちにトレハロースの生産に使用してもよ
いが、０〜１０℃、好ましくは４℃で保存することがで
きる。さらにκ−カラギーナン、アルギン酸カルシウム
などのゲル化担体を用いて固定化菌体とすることによ
り、その安定性が向上する。このような処理を施した菌
体を用いるとトレハロースが培養液中に生産されるので
精製の際に菌体からの抽出操作を省略でき有利である。
過型の菌体は直ちにトレハロースの生産に使用してもよ
いが、０〜１０℃、好ましくは４℃で保存することがで
きる。さらにκ−カラギーナン、アルギン酸カルシウム
などのゲル化担体を用いて固定化菌体とすることによ
り、その安定性が向上する。このような処理を施した菌
体を用いるとトレハロースが培養液中に生産されるので
精製の際に菌体からの抽出操作を省略でき有利である。
【００３６】
【実施例】以下、実施例を示し本発明をさらに詳細に説
明する。
明する。
【００３７】実施例１ 酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプト
ン０．５％、グルコース１％（ｐＨ５．５）からなるＭ
Ｙ液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容振とうフラスコに
入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。この培地にキャ
ンディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍ
ｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０ｔｎ株を１白金耳接種し、
２８℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液を５
０００×ｇ、５分間遠心分離して集菌し、これに５０ｍ
ｌの水を加えて攪拌し、同様に遠心分離を繰り返し計３
回洗浄した。得られた湿菌体１ｇを６０％エタノール２
５ｍｌに懸濁し、８０℃で１時間加熱処理した。室温ま
で冷却し、５０００×ｇ、５分間遠心分離することによ
り菌体を除去してトレハロース含有抽出液を得た。これ
を活性炭処理し、凍結乾燥して純度９０．５％のトレハ
ロース粉末９０．５ｍｇを得た。
ン０．５％、グルコース１％（ｐＨ５．５）からなるＭ
Ｙ液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容振とうフラスコに
入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。この培地にキャ
ンディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍ
ｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０ｔｎ株を１白金耳接種し、
２８℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液を５
０００×ｇ、５分間遠心分離して集菌し、これに５０ｍ
ｌの水を加えて攪拌し、同様に遠心分離を繰り返し計３
回洗浄した。得られた湿菌体１ｇを６０％エタノール２
５ｍｌに懸濁し、８０℃で１時間加熱処理した。室温ま
で冷却し、５０００×ｇ、５分間遠心分離することによ
り菌体を除去してトレハロース含有抽出液を得た。これ
を活性炭処理し、凍結乾燥して純度９０．５％のトレハ
ロース粉末９０．５ｍｇを得た。
【００３８】実施例２ ５００ｍｌ容振とうフラスコにＭＹ液体培地１００ｍｌ
を入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。この培地にキ
ャンディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａｆｅｒｍ
ｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０ｔｒ株を１白金耳接種し、
２８℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液を５
０００×ｇ、５分間遠心分離して集菌し、これに５０ｍ
ｌの水を加えて攪拌し、同様に遠心分離を繰り返し計３
回洗浄した。得られた湿菌体１ｇを６０％エタノール２
５ｍｌに懸濁し、８０℃で１時間加熱処理した。室温ま
で冷却し、５０００×ｇ、５分間遠心分離することによ
り菌体を除去してトレハロース含有抽出液を得た。これ
を活性炭処理し、凍結乾燥して純度９１．２％のトレハ
ロース粉末８９．５ｍｇを得た。
を入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。この培地にキ
ャンディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａｆｅｒｍ
ｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０ｔｒ株を１白金耳接種し、
２８℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液を５
０００×ｇ、５分間遠心分離して集菌し、これに５０ｍ
ｌの水を加えて攪拌し、同様に遠心分離を繰り返し計３
回洗浄した。得られた湿菌体１ｇを６０％エタノール２
５ｍｌに懸濁し、８０℃で１時間加熱処理した。室温ま
で冷却し、５０００×ｇ、５分間遠心分離することによ
り菌体を除去してトレハロース含有抽出液を得た。これ
を活性炭処理し、凍結乾燥して純度９１．２％のトレハ
ロース粉末８９．５ｍｇを得た。
【００３９】実施例３ ５００ｍｌ容振とうフラスコにＭＹ液体培地１００ｍｌ
を入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。この培地にキ
ャンディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａｆｅｒｍ
ｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０ｔｎ株を１白金耳接種し、
２８℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液を５
０００×ｇ、５分間遠心分離して集菌し、これに新たな
ＭＹ液体培地１００ｍｌを加えて懸濁した。さらに２％
となるようアセトンを添加し、２８℃、４０時間振とう
培養したところ、培地中に１．６６ｇ／ｌ（液体クロマ
トグラフィー法）のトレハロースが蓄積した。
を入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。この培地にキ
ャンディダ フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａｆｅｒｍ
ｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１１０ｔｎ株を１白金耳接種し、
２８℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液を５
０００×ｇ、５分間遠心分離して集菌し、これに新たな
ＭＹ液体培地１００ｍｌを加えて懸濁した。さらに２％
となるようアセトンを添加し、２８℃、４０時間振とう
培養したところ、培地中に１．６６ｇ／ｌ（液体クロマ
トグラフィー法）のトレハロースが蓄積した。
【００４０】実施例４ ５００ｍｌ容振とうフラスコにＭＹ液体培地１００ｍｌ
を入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。キャンディダ
フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉ
ｉ）Ｎｏ．３１１０ｔｎ株を１白金耳接種し、２８℃、
１６時間振とう培養した。得られた培養液を５０００×
ｇ、５分間遠心分離して集菌し、これに２５ｍＭリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍｌを加えて攪拌
し、再度前記条件で遠心分離して洗浄菌体１ｇを得た。
さらにこれを冷却したアセトン５０ｍｌで２回洗浄し、
真空ポンプで吸引し乾燥させた。こうして得られた粉末
０．１ｇを２５０ｍｌフラスコに入れ、これに１％グル
コースを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）２０ｍｌを加えて懸濁し、２８℃で振とうさせた。
緩衝液中のトレハロース濃度を液体クロマトグラフィー
により測定した。
を入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。キャンディダ
フェアメンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉ
ｉ）Ｎｏ．３１１０ｔｎ株を１白金耳接種し、２８℃、
１６時間振とう培養した。得られた培養液を５０００×
ｇ、５分間遠心分離して集菌し、これに２５ｍＭリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍｌを加えて攪拌
し、再度前記条件で遠心分離して洗浄菌体１ｇを得た。
さらにこれを冷却したアセトン５０ｍｌで２回洗浄し、
真空ポンプで吸引し乾燥させた。こうして得られた粉末
０．１ｇを２５０ｍｌフラスコに入れ、これに１％グル
コースを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）２０ｍｌを加えて懸濁し、２８℃で振とうさせた。
緩衝液中のトレハロース濃度を液体クロマトグラフィー
により測定した。
【００４１】同様の方法でキャンディダ フェアメンテ
ィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１
１０ｔｒ株についても測定した。これらの結果を表１に
示す。
ィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１
１０ｔｒ株についても測定した。これらの結果を表１に
示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】実施例５ κ−カラギーナン１％を含む２５ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌを加熱し、溶解させた後、４
２℃まで冷却した。これに実施例４で得たＮｏ．３１１
０ｔｎ株の乾燥粉末０．１ｍｇを懸濁させ、さらに室温
まで冷却し、固化させた。これを約０．５ｃｍ角に切
り、１％グルコースを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、２８℃で振とうした。緩
衝液中のトレハロース濃度を液体クロマトグラフィーに
より測定した。
衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌを加熱し、溶解させた後、４
２℃まで冷却した。これに実施例４で得たＮｏ．３１１
０ｔｎ株の乾燥粉末０．１ｍｇを懸濁させ、さらに室温
まで冷却し、固化させた。これを約０．５ｃｍ角に切
り、１％グルコースを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、２８℃で振とうした。緩
衝液中のトレハロース濃度を液体クロマトグラフィーに
より測定した。
【００４４】同様の方法でキャンディダ フェアメンテ
ィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１
１０ｔｒ株についても測定した。これらの結果を表２に
示す。
ィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．３１
１０ｔｒ株についても測定した。これらの結果を表２に
示す。
【００４５】
【表２】
Claims (5)
- 【請求項１】 キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属
するトレハロース生産性酵母を培養し、培養物からトレ
ハロースを採取することを特徴とするトレハロースの製
造方法。 - 【請求項２】 キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属
するトレハロース生産性酵母がトレハロース資化性を欠
損させた菌株である請求項１記載のトレハロースの製造
方法 - 【請求項３】 キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属
するトレハロース生産性酵母がトレハロースの資化性と
蓄積性を同時に欠損した菌株から得たトレハロース資化
性復帰変異株である請求項１記載のトレハロースの製造
方法 - 【請求項４】 キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属
するトレハロース生産性酵母がキャンディダ フェアメ
ンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．
３１１０ｔｎ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１８７）である請
求項１記載のトレハロースの製造方法 - 【請求項５】 キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属
するトレハロース生産性酵母がキャンディダ フェアメ
ンティ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）Ｎｏ．
３１１０ｔｒ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１８８）である請
求項１記載のトレハロースの製造方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6220594A JPH0822237B2 (ja) | 1994-03-08 | 1994-03-08 | トレハロースの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6220594A JPH0822237B2 (ja) | 1994-03-08 | 1994-03-08 | トレハロースの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07246097A true JPH07246097A (ja) | 1995-09-26 |
| JPH0822237B2 JPH0822237B2 (ja) | 1996-03-06 |
Family
ID=13193418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6220594A Expired - Lifetime JPH0822237B2 (ja) | 1994-03-08 | 1994-03-08 | トレハロースの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0822237B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6254912B1 (en) | 1998-04-22 | 2001-07-03 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Method for non-fry cooking and its uses |
| US6455096B1 (en) | 1998-04-28 | 2002-09-24 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Hard candy with a relatively-high moisture and hardness, and process of the same |
| JP2003116481A (ja) * | 2001-10-18 | 2003-04-22 | Hayashibara Biochem Lab Inc | トレハロースを使用した梅肉シート |
| US6723170B2 (en) | 1998-07-09 | 2004-04-20 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Crystalline trehalose dihydrate, its preparation and uses |
| US7186824B2 (en) | 1997-03-04 | 2007-03-06 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Reduction inhibitory agent for active-oxygen eliminating activity |
| US7749538B2 (en) | 2001-04-26 | 2010-07-06 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Molded object having high pullulan content, process for the producing the same, and use thereof |
| CN116210886A (zh) * | 2022-12-30 | 2023-06-06 | 安琪酵母股份有限公司 | 富含海藻糖的抽提物和其制备方法 |
-
1994
- 1994-03-08 JP JP6220594A patent/JPH0822237B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7186824B2 (en) | 1997-03-04 | 2007-03-06 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Reduction inhibitory agent for active-oxygen eliminating activity |
| US6254912B1 (en) | 1998-04-22 | 2001-07-03 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Method for non-fry cooking and its uses |
| US6455096B1 (en) | 1998-04-28 | 2002-09-24 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Hard candy with a relatively-high moisture and hardness, and process of the same |
| US6723170B2 (en) | 1998-07-09 | 2004-04-20 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Crystalline trehalose dihydrate, its preparation and uses |
| US7749538B2 (en) | 2001-04-26 | 2010-07-06 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Molded object having high pullulan content, process for the producing the same, and use thereof |
| JP2003116481A (ja) * | 2001-10-18 | 2003-04-22 | Hayashibara Biochem Lab Inc | トレハロースを使用した梅肉シート |
| CN116210886A (zh) * | 2022-12-30 | 2023-06-06 | 安琪酵母股份有限公司 | 富含海藻糖的抽提物和其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0822237B2 (ja) | 1996-03-06 |
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