CN108271785B - 一种利用豆腐黄水发酵生产的生物农药及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用豆腐黄水发酵生产的生物农药及其制备方法,所述生物农药是由微生物利用豆腐黄浆水作为发酵原料发酵得到的，发酵产物中含有γ‑聚谷氨酸和抗菌肽。所述生物农药对植物病原性真菌有明显的抑菌效果。取豆腐生产中沥出的黄浆水，调节豆腐黄浆水的pH=6.5~7.5；将微生物种子液按2%~10%（V/V）的接种量接入豆腐黄浆水中，发酵温度25℃~40℃，好氧发酵20 h~72 h；发酵产物中含有γ‑聚谷氨酸和抗菌肽作为生物农药。本发明方法可以充分回收利用废弃物豆腐黄浆水，综合利用，减少环境污染，同时变废为宝，提高经济效益；利用豆腐黄浆水粗原料降低成本，能耗低，污染小，生产效率高，工艺简单，操作方便。

Description

一种利用豆腐黄水发酵生产的生物农药及其制备方法
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种生物农药及其制备方法和应用。
背景技术
近年来,随着人类对生存环境质量的要求越来越高,无公害、无污染、无残留且不易产生抗性的微生物农药又重新受到关注。此外,微生物农药开发费用较化学农药低。植物真菌病原物引起的植物病害是农作物的重要病害之一，给农业生产造成巨大的经济损失。当前，植物病害的防治方法主要还是抗病品种的培育和化学农药的防治为主。但由于长期过度使用化学物药剂，给生态环境带来了严重污染，人类健康来了巨大威胁。为了绿色农产品的开发和可持续农业的发展，我们广泛采用无公害的生物农药，这些活体微生物成功定殖在植物体内或体表，通过竞争或代谢产物直接抑菌、诱导植物产生系统抗性、促进植物生长等机理来防治植物病害，国内外应用芽抱杆菌防治植物病害已经非常广泛,如水稻纹枯病、水稻白叶枯病、辣椒炭疽病、番茄灰霉病、苹果红腐病、黄瓜苗期碎倒病、小麦赤霉病、西瓜枯萎病、棉花枯萎病、棉花立枯病等。其主要是通过构建表达抗菌肽基因，最终以转基因植物来防治病虫害。本专利主要是以发酵产物直接应用植物病虫害的防治，工艺简单，价格低廉。
豆腐黄浆水主要来源于豆腐加工生产过程中沥出的废水，其含有的有机物十分丰富。现今，大多数食品加工企业将豆腐加工过程中产生的豆腐黄浆水直接由下水道排出,直接增加了水质COD和BOD值,既污染环境,又浪费资源。通过检测,豆腐黄浆水基本的化学成分有蛋白质、粗脂肪、金属离子K、Na、Mg、Ca、Fe等、碳酸根、磷酸根等，在这些组分中蛋白质、大豆低聚糖、大豆异黄酮和大豆皂普都属于营养成分,其中的大豆低聚糖,具有促进双歧杆菌增殖、促进肠胃有益细菌的生长,预防和改善便秘,促进钙镁等微量元素的吸收,同时具有较低的热量。因此，使用安全菌株工业化纯种发酵黄浆水具有现实意义。
同时，由于各地豆制品厂数量庞大，加工产生的豆腐黄浆水营养丰富，COD和BOD值严重超标，如果直接排放，会造成水体COD和BOD值的明显增加，对环境造成严重的污染。如果将豆制品厂的豆腐黄浆水回收再充分利用，不仅能够变废为宝，降低成本，还能减少环境污染，提高综合效益。
γ-聚谷氨酸是一种具有良好的生物亲和性和生物降解性的新型功能性肥料，可作为土壤和植物的保水剂；作为农药、肥料、杀虫剂、除草剂等的缓释剂；还可作为污染水体的絮凝剂等。其不仅可以改进土壤的团粒，还能增强土壤的保湿、
保肥性能，在改造荒山、秀岭、沙漠等方面有很大的应用价值。吸水后呈凝胶状，可以作为种子的包衣材料，提高种子在干旱沙地的发芽率。另外，在使用肥料、杀虫剂、除草剂、驱虫剂等药物时，加入适量的可以延长这些药物停留在作用对象表面上的时间，不易因下雨而被冲刷掉。
因此，γ-聚谷氨酸可以增强生物农药的效果，市场前景广阔。由于聚谷氨酸的合成方式主要为化学合成、液态发酵、固态发酵。其中，液态发酵仍是利用微生物发酵生产聚谷氨酸的主流，优于另两种生产方式，但液态生产上存在成本高、产量低等问题，限制了其在生物农药领域的应用，因此急需开发新型生产工艺，降低成本，扩大市场。
抗菌肽具有分子量小、热稳定性好、水溶性高、抗菌谱广，不易诱发细菌产生耐药性，不易引起药物过敏反应等优点，是目前国际上公认的抗生素最佳替代品，但同时也存在着来源限制等问题。芽抱杆菌属是一种常见的优势微生物种群，其嗜温好氧、能产生热稳定的内生芽抱,抗逆能力强,耐热、耐干、抗紫外线,抗电磁辐射,繁殖速度快,营养要求简单,易定殖在植物表面广泛分布于上壤和植物体内，主要是通过稳定的定殖至植物根部、叶部或植物生境中，与病原菌共同竞争植物生态环境的营养和空间，主要机理有：产生抗生物质直接抑制病原物正常生长，诱导植物防卫系统抵抗病原菌侵入，从而达到生物防治的效果，其主要防治对象为植物真菌所侵染的植物。在实际生产和应用中,生产工艺简单,施用方便,贮存期长,有些菌株甚至具有增产菌的效果,所以该属细菌正成为越来越受瞩目的生防研究材料。目前用于防治植物病害的芽抱杆菌的种类主要有：枯草芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，多粘芽孢杆菌,短小芽孢杆菌等。目前用于产γ-聚谷氨酸及抗菌肽的菌株有地衣芽杆菌、苏云金芽胞杆菌、枯草芽杆菌等。在专利201710158450.7《一种枯草芽杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的应用》中记载，其发酵产γ-聚谷氨酸量为46g/L，培养基成分复杂。在专利201410443738.5《一种无公害抗菌肽生物农药》中记载，蚯蚓肽抗菌肽饲料及成分配制复杂。同时，在专利201210588335.0《一种利用解淀粉乳酸菌发酵生产豆腐酸浆的方法》中记载，利用豆腐黄浆水发酵主要用于乳酸菌大量生长，这与本专利的产γ-聚谷氨酸及抗菌肽有明显的不同。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物农药及其制备方法和应用，利用豆腐黄浆水作为发酵原料生产得到生物农药，其发酵产物中主要包括γ-聚谷氨酸和抗菌肽，该发酵方法生产的γ-聚谷氨酸产量高和同时产抗菌肽,且可有效利用豆腐黄浆水这类废弃物进行发酵生产，降低生产成本且安全环保，同时解决了豆腐黄浆水带来的环境污染。
本实验室既可利用芽孢杆菌类进行液态发酵，其产物中含有聚谷氨酸和抗菌肽，还可以利用其益生菌的性质应用于病虫害的防治。实验选取四种不同芽孢类菌株作为出发菌株，采用传统的液体发酵的方式进行单独发酵，利用豆腐黄浆水这类废弃物作为发酵原料可以极大程度上减少成本，同时解决环境污染，并且提高了γ-聚谷氨酸的产量及抗菌肽广泛地应用于农业生产行业。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种利用豆腐黄水发酵生产的生物农药，所述生物农药是由微生物利用豆腐黄浆水作为发酵原料发酵得到的，发酵产物中含有γ-聚谷氨酸和抗菌肽。
所述微生物为芽孢杆菌，包括但不限于：枯草芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，多粘芽孢杆菌,短小芽孢杆菌等，这些菌株都可以用于不同种类的植物病虫害作用。
所述生物农药对植物病原性真菌有明显的抑菌效果。
所述植物病原性真菌包括但不限于棉花立枯、水稻纹枯、西瓜枯萎、小麦赤霉、苹果纶纹、花生叶霉、棉花枯萎、油菜白斑、番茄灰霉病、苹果红腐病、蚕豆黑斑、辣椒疫霉菌、黄瓜霜霉病、玉米小斑、小麦纹枯、甜瓜枯萎、小麦叶霉、烟草赤星病、灰葡萄孢霉、芦笋枯萎、三叶草核盘、立枯丝核、辣椒炭疽病、黄瓜苗期碎倒病、水稻白叶枯病、甘蔗黑穗病、桃软腐病菌、油菜菌核盘、小麦根腐、小麦全蚀。
所述生物农药的制备方法，包括如下步骤：
1）取豆腐生产中沥出的黄浆水，调节豆腐黄浆水的pH=6.5~7.5；
2）将微生物种子液按2%~10%（V/V）的接种量接入豆腐黄浆水中，发酵温度25 ℃~40 ℃，好氧发酵20 h~72 h；发酵产物中含有γ-聚谷氨酸和抗菌肽作为生物农药。
发酵产物中50g/L以上，抗菌肽主要为伊枯草菌素（iturin）、表面活性素（surfactin)及丰原素（fengycin），并且有明显地抑菌。
步骤1）中豆腐黄浆水可以灭菌或者不灭菌进行发酵，优选灭菌后发酵效果更佳，灭菌条件为本领域常规灭菌方式均可，比如：121 ℃灭菌20 min,冷却至25 ℃以下。
步骤1）中豆腐黄浆水中还添加有葡萄糖;所述葡萄糖的添加量为2~10 g/L。
步骤2）中所述微生物为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或者枯草芽杆菌枯草亚种中的一种或几种混合。进一步优选地，所述微生物为枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)BNCC189983、枯草芽杆菌枯草亚种BNCC190341、枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.13932、地衣芽杆菌BNCC132665按质量比为1:2:4:1混合的混合菌株。
本发明中，发酵原料为豆腐黄浆水，通过不同的芽孢类菌株进行发酵，按2%~10%（V/V）的接种量接入已冷却的豆腐黄浆水中，发酵温度25 ℃~40 ℃，好氧发酵20 h~72 h，所产的γ-聚谷氨酸产量为50g/L以上，抗菌肽作用明显。
发酵所得的产物γ-聚谷氨酸和抗菌肽可应用于植物病害防治等领域。本发明的生物农药能有效用于防治水稻、瓜果蔬菜的病虫害,并且生产工艺简单,生产过程不产生污染。该产品具有十分巨大的应用价值和市场开发潜力。同时，本发明中的四种不同芽类杆菌发酵优点在于：具有联产Surfactin、Fengycin、Iturin三种抗菌脂肽和γ-聚谷氨酸的能力。该方法与其他发酵方法相比，可以充分回收利用废弃物豆腐黄浆水，减少豆制品加工中的黄浆水自然发酵酸浆存在致病菌等安全隐患，同时使得其得以综合利用，减少环境污染，同时变废为宝，提高经济效益；在发酵原料方面，利用豆腐黄浆水粗原料降低成本，能耗低，污染小，生产效率高，工艺简单，操作方便。因此本发明具有广阔的市场前景和工业化生产应用价值。
本发明具有以下优点：
（1）经过不同种类的芽杆菌菌株在豆腐黄浆水中发酵后，所产γ-聚谷氨酸产量高同时含有大量抗菌肽，安全且环保。
（2）与传统的液体发酵法相比，该菌株发酵可利用豆腐黄浆水，从成本上来说，得到了很大幅度的降低。
（3）综合利用豆制品加工中产生的大量黄浆水，降低废水排放，减少环境污染，同时变废为宝，提高企业和生产的综合效益；
（4）发酵工艺简单、易操作。
具体实施方式
通过下述实施例，可以更好地理解本发明。然后，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料比，工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书说所详细描述的本发明。
实施例1 本实施例说明枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)，菌株编号BNCC189983利用豆腐黄浆水发酵生产生物农药
马铃薯固体培养基（PDA）：将 200g 马铃薯切成小块，煮沸 30min，用 4层纱布过滤，加20g 葡萄糖，充分搅拌均匀，蒸馏水定容至1L，加入20g琼脂，121℃灭菌待用，用于真菌类培养，培养温度28 ℃，培养时间3~5天；
平板培养基：蛋白胨16 g/L，酵母膏8 g/L，NaCl 16 g/L，琼脂20 g/L，pH自然；
种子培养基：蛋白胨16 g/L，酵母膏8 g/L，NaCl 16 g/L；
好氧发酵培养基：豆腐黄浆水（豆腐生产中沥出的新鲜的黄浆水，无论是石膏豆腐、内酯豆腐或卤水豆腐均可），葡萄糖5 g/L。
取新鲜的豆腐黄浆水（调节pH=6.5~7.5）分装在500mL锥形瓶中，装液量为50 mL，不灭菌。将枯草芽杆菌(Bacillus subtilis) BNCC189983于32 ℃平板活化菌种，24 h后接两环生长良好的菌体入50 mL种子培养基，32 ℃，180 rpm培养12 h，然后按照4 %( v/v )接种量转接入装液量为50 ml发酵液/500ml三角瓶，32 ℃培养，转速为180 rpm。发酵36 h后枯草芽杆菌(Bacillus subtilis) BNCC189983（购买自百纳生物）的发酵液产γ-聚谷氨酸的产量为45 g/L和伊枯草菌素（iturin）及丰原素（fengycin）。
实施例2 本实施例说明枯草芽杆菌枯草亚种，保藏号BNCC190341利用豆腐黄浆水发酵生产生物农药
平板培养基：蛋白胨16 g/L，酵母膏8 g/L，NaCl 16 g/L，琼脂20 g/L，pH自然；
种子培养基：蛋白胨16 g/L，酵母膏8 g/L，NaCl 16 g/L；
发酵培养基：豆腐黄浆水。
取新鲜的豆腐黄浆水（调节pH=6.5~7.5）分装在500mL锥形瓶中，装液量为50 mL，不灭菌。将枯草芽杆菌枯草亚种保藏号BNCC190341于32 ℃平板活化菌种，24 h后接两环生长良好的菌体入50 mL种子培养基，32 ℃，180 rpm培养12 h，然后按照4 %( v/v )接种量转接入装液量为50 ml发酵液/500ml三角瓶，32 ℃培养，转速为180 rpm。发酵36 h后枯草芽杆菌枯草亚种保藏号BNCC190341（购买自百纳生物）的发酵液产γ-聚谷氨酸的产量为62g/L和表面活性素（surfactin)及丰原素（fengycin）。
实施例3 本实施例说明枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)保藏号CGMCC NO.13932利用豆腐黄浆水发酵生产生物农药
平板培养基：蛋白胨16 g/L，酵母膏8 g/L，NaCl 16 g/L，琼脂20 g/L，pH自然；
种子培养基：蛋白胨16 g/L，酵母膏8 g/L，NaCl 16 g/L；
发酵培养基：豆腐黄浆水。
取新鲜的豆腐黄浆水（调节pH=6.5~7.5）分装在500mL锥形瓶中，装液量为50 mL，不灭菌。将枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)保藏号CGMCC NO.13932于32 ℃平板活化菌种，24 h后接两环生长良好的菌体入50 mL种子培养基，32 ℃，180 rpm培养12 h，然后按照4 %( v/v )接种量转接入装液量为50 ml发酵液/500ml三角瓶，32 ℃培养，转速为180rpm。发酵36 h后枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)保藏号CGMCC NO.13932的发酵液产γ-聚谷氨酸的产量为57 g/L和伊枯草菌素（iturin）、表面活性素（surfactin)及丰原素（fengycin）。
实施例4本实施例说明地衣芽杆菌BNCC132665利用豆腐黄浆水发酵生产生物农药
平板培养基：蛋白胨16 g/L，酵母膏8 g/L，NaCl 16 g/L，琼脂20 g/L，pH自然；
种子培养基：蛋白胨16 g/L，酵母膏8 g/L，NaCl 16 g/L；
发酵培养基：豆腐黄浆水。
取新鲜的豆腐黄浆水（调节pH=6.5~7.5）分装在500mL锥形瓶中，装液量为50 mL，不灭菌。将地衣芽杆菌BNCC132665于32 ℃平板活化菌种，24 h后接两环生长良好的菌体入50 mL种子培养基，32 ℃，180 rpm培养12 h，然后按照4 %( v/v )接种量转接入装液量为50 ml发酵液/500ml三角瓶，32 ℃培养，转速为180 rpm。发酵36 h后地衣芽杆菌BNCC132665（购买自百纳生物）的发酵液产γ-聚谷氨酸的产量为49 g/L和伊枯草菌素（iturin）、表面活性素（surfactin)。
实施例5 实施例1-4中发酵得到的生物农药的抑菌实验
将实施例1-4的发酵产物进行植物病原菌的抑菌试验，抑菌效果有明显的不同，抑菌结果（如表1）。
表1 四种芽孢类菌利用不灭菌的豆腐黄水发酵后产物抑菌效果
枯草芽孢杆菌CGMCCN.13932 枯草芽杆菌枯草亚种BNCC190341 枯草芽杆菌BNCC189983 地衣芽孢杆菌BNCC132665
植物病原菌 抑菌圈（mm） 抑菌圈（mm） 抑菌圈（mm） 抑菌圈（mm）
棉花立枯 21.3±0.3 18.2±0.5 12.3±0.3 17.3±0.2
水稻纹枯 25.1±0.5 11.7±0.2 19.2±0.4 0
西瓜枯萎 16.2±0.5 17.2±0.6 0 18.9±0.5
小麦赤霉 13.7±0.2 9.2±0.2 18.2±0.1 13.1±0.2
苹果纶纹 11.8±0.4 20.2±0.8 13.7±0.6 0
花生叶霉 17.5±0.2 10.3±0.3 18.2±0.5 16.2±0.4
棉花枯萎 19.3±0.4 0 11.3±0.2 17.2±0.3
油菜白斑 12.7±0.2 7.8±0.2 0 16.2±0.2
番茄灰霉病 6.3±0.1 15.8±0.3 21.9±0.7 18.2±0.7
苹果红腐病 16.8±0.7 20.1±0.6 10.2±0.1 12.4±0.3
蚕豆黑斑 17.9±0.3 0 5.8±0.9 22.1±0.5
辣椒疫霉菌 21.6±0.5 9.2±0.7 0 16.5±0.3
黄瓜霜霉病 15.2±0.3 13.9±0.4 0 18.2±0.7
玉米小斑 13.1±0.2 11.2±0.1 19.2±0.8 19.3±0.4
小麦纹枯 25.3±0.4 11.3±0.4 9.2±0.4 0
甜瓜枯萎 15.9±0.2 19.2±0.2 0 16.8±0.6
小麦叶霉 14.2±0.4 7.2±0.3 8.2±0.5 0
烟草赤星病 11.9±0.7 4.5±0.4 22.4±0.3 12.8±0.4
灰葡萄孢霉 15.6±0.3 11.3±0.4 16.8±0.4 23.2±0.6
芦笋枯萎 17.2±0.4 0 14.3±0.5 18.4±0.5
三叶草核盘 12.4±0.9 17.4±0.5 10.1±0.2 21.1±0.4
立枯丝核 0 11.4±0.3 22.1±0.7 0
辣椒炭疽病 22.3±0.2 10.3±0.5 0 17.8±0.3
黄瓜苗期碎倒病 15.8±0.1 14.5±0.7 0 22.1±0.4
水稻白叶枯病 21.9±0.5 11.5±0.8 18.6±0.8 0
甘蔗黑穗病 22.1±0.1 11.2±0.2 12.3±0.8 16.4±0.5
桃软腐病菌 17.±0.3 10.3±0.3 22.1±0.4 14.5±0.1
油菜菌核盘 13.9±0.4 8.3±0.5 0 13.8±0.2
小麦根腐 22.6±0.5 10.4±0.8 11.1±0.3 21.2±0.2
小麦全蚀 23.4±0.8 11.2±0.2 10.7±0.4 20.8±0.6
实施例6 四种芽孢类菌利用灭菌的豆腐黄水发酵后产物抑菌效果
平板培养基：蛋白胨16 g/L，酵母膏8 g/L，NacL16 g/L，琼脂20 g/L，pH自然；
种子培养基：蛋白胨16 g/L，酵母膏8 g/L，NaCl 16 g/L；
好氧发酵培养基：豆腐黄浆水（豆腐生产中沥出的新鲜的黄浆水，无论是石膏豆腐、内酯豆腐或卤水豆腐均可），葡萄糖5 g/L；
取新鲜的豆腐黄浆水（pH=6.5~7.5）分装在500mL锥形瓶中，装液量为50 mL，121℃，灭菌20 min，葡萄糖单独灭菌。
将枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)保藏号BNCC189983、枯草芽杆菌枯草亚种保藏号BNCC190341、枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)保藏号CGMCCNo.13932、地衣芽杆菌BNCC132665这四种菌分别于32 ℃平板活化菌种，24 h后接两环生长良好的菌体入50 mL种子培养基，32 ℃，180 rpm培养12 h，然后按照4 %( v/v )接种量转接入装液量为50 ml发酵液/500ml三角瓶，32 ℃培养，转速为180 rpm。发酵36 h后枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)保藏号BNCC189983的发酵液产γ-聚谷氨酸的产量为60 g/L和伊枯草菌素（iturin）及丰原素（fengycin）；枯草芽杆菌枯草亚种保藏号BNCC190341的发酵液产γ-聚谷氨酸的产量为75 g/L和表面活性素（surfactin)及丰原素（fengycin）；枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)保藏号CGMCC NO.13932的发酵液产γ-聚谷氨酸的产量为70 g/L和伊枯草菌素（iturin）、表面活性素（surfactin)及丰原素（fengycin）；地衣芽杆菌BNCC132665的发酵液产γ-聚谷氨酸的产量为53 g/L和伊枯草菌素（iturin）、表面活性素（surfactin)。其中，将这四种菌进行单独发酵实验后单独利用各自发酵产物进行植物病原菌的抑菌试验，抑菌效果有明显的不同，抑菌结果（如表2）。
表2 四种芽孢类菌利用灭菌的豆腐黄水发酵后产物抑菌效果
枯草芽孢杆菌CGMCCN.13932 枯草芽杆菌枯草亚种BNCC190341 枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)BNCC189983 地衣芽孢杆菌BNCC132665
植物病原菌 抑菌圈（mm） 抑菌圈（mm） 抑菌圈（mm） 抑菌圈（mm）
棉花立枯 32.3±0.3 28.3±0.2 23.3±0.1 28.3±0.4
水稻纹枯 36.3±0.3 21.7±0.3 31.2±0.5 0
西瓜枯萎 26.8±0.2 26.2±0.7 0 30.9±0.4
小麦赤霉 23.8±0.3 19.2±0.4 27.2±0.4 21.1±0.3
苹果纶纹 21.2±0.5 21.2±0.9 21.7±0.7 0
花生叶霉 27.5±0.1 19.3±0.2 26.2±0.4 24.2±0.5
棉花枯萎 29.3±0.9 0 19.3±0.7 30.2±0.6
油菜白斑 28.9±0.4 17.8±0.8 0 28.2±0.7
番茄灰霉病 12.3±0.1 24.8±0.2 29.9±0.3 29.2±0.2
苹果红腐病 21.8±0.7 30.1±0.2 13.2±0.4 21.4±0.6
蚕豆黑斑 29.9±0.4 0 13.8±0.3 29.1±0.7
辣椒疫霉菌 32.6±0.2 18.2±0.6 0 28.5±0.2
黄瓜霜霉病 29.2±0.4 21.9±0.4 0 30.2±0.6
玉米小斑 23.2±0.1 20.2±0.3 31.2±0.5 31.3±0.3
小麦纹枯 35.3±0.4 21.3±0.4 21.2±0.4 0
甜瓜枯萎 25.9±0.3 28.2±0.5 0 31.8±0.9
小麦叶霉 24.2±0.4 18.2±0.3 17.2±0.5 0
烟草赤星病 21.9±0.8 12.5±0.2 31.4±0.2 21.8±0.3
灰葡萄孢霉 25.6±0.1 19.3±0.2 26.8±0.5 28.2±0.9
芦笋枯萎 27.2±0.8 0 21.3±0.2 30.4±0.
三叶草核盘 21.4±0.4 27.4±0.8 18.1±0.8 32.1±0.1
立枯丝核 0 18.4±0.5 31.1±0.7 0
辣椒炭疽病 33.3±0.2 20.3±0.5 0 26.8±0.3
黄瓜苗期碎倒病 24.8±0.5 22.5±0.4 0 33.1±0.2
水稻白叶枯病 32.9±0.4 22.5±0.8 28.6±0.8 0
甘蔗黑穗病 31.1±0.2 19.2±0.2 21.3±0.8 25.4±0.5
桃软腐病菌 27.±0.5 21.3±0.3 29.1±0.4 23.5±0.1
油菜菌核盘 22.9±0.9 18.3±0.2 0 21.8±0.2
小麦根腐 34.6±0.2 19.4±0.8 19.1±0.1 32.2±0.3
小麦全蚀 35.4±0.3 21.2±0.2 20.7±0.4 29.8±0.9
实施例7 本实施例说明枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)保藏号CGMCCNo.13932在不同发酵培养基发酵产γ-聚谷氨酸及抗菌肽对植物病原菌的抑菌效果
平板培养基：蛋白胨16 g/L，酵母膏8 g/L，NacL16 g/L，琼脂20 g/L，pH 自然；
发酵培养基：（1）葡萄糖15 g/L，豆粕20g/L，K2HPO4•3H2O 1.2g/L，KH2PO41.6g/L，MgSO4•7H2O 0.45g/L,Cacl2 0.21g/L,其余为水，pH=7.4；
（2）糖蜜10 g/L，大豆蛋白胨10 g/L，K2HPO4•3H2O 1.2g/L，KH2PO41.6g/L，MgSO4•7H2O 0.45g/L,Cacl2 0.21g/L,其余为水，pH=7.4；
（3）豆腐黄浆水、葡萄糖5 g/L。
分别取三种不同发酵培养基（pH=6.5~7.5）分装在500mL锥形瓶中，装液量为50mL，121℃，灭菌20min，葡萄糖单独灭菌。将枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)保藏号CGMCCNo.13932于32℃平板活化菌种，24 h后接两环生长良好的菌体入50 mL种子培养基，32 ℃，190 rpm培养12 h，然后按照3.5%( v/v )接种量转接入装液量为50 ml发酵液/500ml三角瓶，32℃培养，转速为190 rpm。利用不同发酵培养基作为发酵主体，在发酵36 h后枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)，保藏号CGMCCNo.13932的发酵产γ-聚谷氨酸分别为45g/L、56g/L、70 g/L和并且含有伊枯草菌素（iturin）、表面活性素（surfactin)及丰原素（fengycin）。但发酵实验后利用不同发酵培养基的发酵产物进行植物病原菌的抑菌试验，抑菌效果有明显的不同，抑菌结果如表3所示。
表3 CGMCCNo.13932利用不同发酵培养基发酵后产物抑菌效果
植物病原菌 培养基(1)抑菌圈（mm） 培养基（2）抑菌圈（mm） 培养基（3）抑菌圈（mm）
棉花立枯 16.3±0.2 15.2±0.5 32.3±0.3
水稻纹枯 21.3±0.7 23.2±0.9 36.3±0.3
西瓜枯萎 11.4±0.5 10.4.2±0.2 26.8±0.2
小麦赤霉 9.2±0.4 8.7±0.8 23.8±0.2
苹果纶纹 9.7±0.2 10.8±0.5 21.2±0.3
花生叶霉 12.4±0.8 11.3±0.1 27.5±0.3
棉花枯萎 13.9±0.9 14.2±0.5 29.3±0.5
油菜白斑 6.9±0.4 7.3±0.3 28.9±0.2
番茄灰霉病 3.4±0.4 4.6±0.5 12.3±0.2
苹果红腐病 10.2±0.2 13.2±0.3 21.8±0.7
蚕豆黑斑 16.1±0.2 19.2±0.1 29.9±0.3
辣椒疫霉菌 13.4±0.2 18.3±0.3 32.6±0.5
黄瓜霜霉病 11.9 13.4±0.4 29.2±0.3
玉米小斑 6.4±0.3 15.3±0.6 23.2±0.2
小麦纹枯 10.3±0.5 15.8±0.9 35.3±0.4
甜瓜枯萎 7.8±0.3 16.8±0.1 25.9±0.2
小麦叶霉 5.9±0.2 13.4±0.5 24.2±0.4
烟草赤星病 4.9±0.4 15.3±0.3 21.9±0.7
灰葡萄孢霉 5.6±0.5 11.5±0.6 25.6±0.3
芦笋枯萎 11.2±0.3 15.2±0.8 27.2±0.4
三叶草核盘 6.4±0.3 13.8±0.4 21.4±0.9
立枯丝核 0 0 0
辣椒炭疽病 13.4±0.5 22.3±0.5 33.3±0.2
黄瓜苗期碎倒病 5.8±0.3 14.3±0.5 24.8±0.1
水稻白叶枯病 10.3±0.3 23.4±0.6 32.9±0.5
甘蔗黑穗病 7.8±0.5 18.4±0.8 31.1±0.1
桃软腐病菌 14.3±0.2 14.5±0.4 27.1±0.3
油菜菌核盘 6.5±0.3 15.3±0.3 22.9±0.4
小麦根腐 13.2±0.2 23.4±0.8 34.6±0.5
小麦全蚀 12.4±0.4 23.6±0.4 35.4±0.8
实施例8 本实施例说明枯草芽杆菌枯草亚种BNCC190341在不同发酵培养基发酵产γ-聚谷氨酸及抗菌肽对植物病原菌的抑菌效果
平板培养基：蛋白胨16 g/L，酵母膏8 g/L，NacL16 g/L，琼脂20 g/L，pH 自然。
发酵培养基：（1）葡萄糖15 g/L，豆粕20g/L，K2HPO4•3H2O 1.2g/L，KH2PO41.6g/L，MgSO4•7H2O 0.45g/L,Cacl2 0.21g/L,其余为水，pH=7.4；
（2）糖蜜10 g/L，大豆蛋白胨10 g/L，K2HPO4•3H2O 1.2g/L，KH2PO41.6g/L，MgSO4•7H2O 0.45g/L,Cacl2 0.21g/L,其余为水，pH=7.4；
（3）豆腐黄浆水、葡萄糖5 g/L。
分别取三种不同发酵培养基（pH=6.5~7.5）分装在500mL锥形瓶中，装液量为50mL，121℃，灭菌20min，葡萄糖单独灭菌。将枯草芽杆菌枯草亚种BNCC190341于32℃平板活化菌种，24 h后接两环生长良好的菌体入50 mL种子培养基，32 ℃，190 rpm培养12 h，然后按照3.5%( v/v )接种量转接入装液量为50 ml发酵液/500ml三角瓶，32℃培养，转速为190rpm。利用不同发酵培养基作为发酵主体，在发酵36 h后枯草芽杆菌枯草亚种BNCC190341的发酵产γ-聚谷氨酸分别为44 g/L、53 g/L、75 g/L和其中发酵液中含有表面活性素（surfactin)及丰原素（fengycin）。发酵实验后利用不同发酵培养基的发酵产物进行植物病原菌的抑菌试验，抑菌效果有明显的不同，抑菌结果如表4所示。
表4 枯草芽杆菌枯草亚种BNCC190341利用不同发酵培养基发酵后产物抑菌效果
植物病原菌 培养基(1)抑菌圈（mm） 培养基（2）抑菌圈（mm） 培养基（3）抑菌圈（mm）
棉花立枯 15.1±0.4 13.2±0.1 28.3±0.5
水稻纹枯 6.5±0.4 5.7±0.5 21.7±0.2
西瓜枯萎 15.9±0.3 13.1±0.4 26.2±0.6
小麦赤霉 6.2±0.5 4.2±0.6 19.2±0.2
苹果纶纹 17.3±0.4 15.2±0.5 21.2±0.8
花生叶霉 6.8±0.5 6.3±0.8 19.3±0.3
棉花枯萎 0 0 0
油菜白斑 5.3±0.5 3.9±0.9 17.8±0.2
番茄灰霉病 6.8±0.2 14.5±0.7 24.8±0.3
苹果红腐病 11.2±0.5 18.3±0.3 30.1±0.6
蚕豆黑斑 0 0 0
辣椒疫霉菌 5.2±0.3 11.2±0.2 18.2±0.7
黄瓜霜霉病 5.9±0.2 11.9±0.2 21.9±0.4
玉米小斑 8.2±0.2 11.2±0.4 20.2±0.1
小麦纹枯 5.3±0.2 12.2±0.8 21.3±0.4
甜瓜枯萎 7.2±0.3 11.3±0.2 28.2±0.2
小麦叶霉 4.2±0.3 10.3±0.4 18.2±0.3
烟草赤星病 3.4±0.5 6.7±0.2 12.5±0.4
灰葡萄孢霉 4.5±0.3 11.2±0.2 19.3±0.4
芦笋枯萎 0 0 0
三叶草核盘 7.4±0.2 11.4±0.3 27.4±0.5
立枯丝核 6.3±0.1 11.4±0.2 18.4±0.3
辣椒炭疽病 7.3±0.6 11.3±0.9 20.3±0.5
黄瓜苗期碎倒病 3.5±0.3 12.5±0.5 22.5±0.7
水稻白叶枯病 4.5±0.5 14.5±0.5 22.5±0.8
甘蔗黑穗病 4.2±0.6 15.3±0.4 19.2±0.2
桃软腐病菌 9.3±0.4 15.3±0.8 21.3±0.3
油菜菌核盘 8.3±0.4 12.1±0.8 18.3±0.5
小麦根腐 6±0.8 12.4±0.5 19.4±0.8
小麦全蚀 14.2±0.8 15.2±0.5 21.2±0.2
实施例9本实施例说明枯草芽孢杆菌BNCC189983在不同发酵培养基发酵产γ-聚谷氨酸及抗菌肽对植物病原菌的抑菌效果
平板培养基：蛋白胨16 g/L，酵母膏8 g/L，NacL16 g/L，琼脂20 g/L，pH 自然；
发酵培养基：（1）葡萄糖15 g/L，豆粕20g/L，K2HPO4•3H2O 1.2g/L，KH2PO41.6g/L，MgSO4•7H2O 0.45g/L,Cacl2 0.21g/L,其余为水，pH=7.4；
（2）糖蜜10 g/L，大豆蛋白胨10 g/L，K2HPO4•3H2O 1.2g/L，KH2PO41.6g/L，MgSO4•7H2O 0.45g/L,Cacl2 0.21g/L,其余为水，pH=7.4；
（3）豆腐黄浆水、葡萄糖5 g/L。
分别取三种不同发酵培养基（pH=6.5~7.5）分装在500mL锥形瓶中，装液量为50mL，121℃，灭菌20min，葡萄糖单独灭菌。将枯草芽孢杆菌BNCC189983于32℃平板活化菌种，24 h后接两环生长良好的菌体入50 mL种子培养基，32 ℃，190 rpm培养12 h，然后按照3.5%( v/v )接种量转接入装液量为50 ml发酵液/500ml三角瓶，32℃培养，转速为190rpm。利用不同发酵培养基作为发酵主体，在发酵36 h后枯草芽孢杆菌，BNCC189983的发酵产γ-聚谷氨酸分别为45 g/L、52 g/L、60 g/L和发酵液中含有伊枯草菌素（iturin）及丰原素（fengycin）。发酵实验后利用不同发酵培养基的发酵产物进行植物病原菌的抑菌试验，抑菌效果有明显的不同，抑菌结果如表5所示。
表5 枯草芽孢杆菌BNCC189983利用不同发酵培养基发酵后产物抑菌效果
植物病原菌 培养基(1)抑菌圈（mm） 培养基（2）抑菌圈（mm） 培养基（3）抑菌圈（mm）
棉花立枯 10.3±0.1 9.3±0.4 23.3±0.3
水稻纹枯 15.4±0.5 13.8±0.4 31.2±0.4
西瓜枯萎 0 0 0
小麦赤霉 16.4±0.9 14.2±0.5 27.2±0.1
苹果纶纹 9.9±0.4 10.4±0.6 21.7±0.6
花生叶霉 15.3±0.8 14.3±0.4 26.2±0.5
棉花枯萎 7.4±0.3 5.9±0.5 19.3±0.2
油菜白斑 0 0 0
番茄灰霉病 11.3±0.2 19.2±0.4 29.9±0.7
苹果红腐病 4.2±0.2 11.3±0.4 13.2±0.1
蚕豆黑斑 4.8±0.3 8.9±0.4 13.8±0.9
辣椒疫霉菌 0 0 0
黄瓜霜霉病 0 0 0
玉米小斑 8.2±0.2 11.3±0.4 31.2±0.8
小麦纹枯 5.4±0.3 12.4±0.5 21.2±0.4
甜瓜枯萎 0 0 0
小麦叶霉 5.6±0.4 11.2±0.3 17.2±0.5
烟草赤星病 14.3±0.2 16.8±0.5 31.4±0.3
灰葡萄孢霉 8.9±0.2 13.2±0.5 26.8±0.4
芦笋枯萎 11.4±0.4 15.7±0.3 21.3±0.5
三叶草核盘 4.5±0.3 8.3±0.7 18.1±0.2
立枯丝核 15.3±0.3 20.3±0.5 31.1±0.7
辣椒炭疽病 0 0 0
黄瓜苗期碎倒病 0 0 0
水稻白叶枯病 11.6±0.3 18.3±0.5 28.6±0.8
甘蔗黑穗病 15.3±0.2 17.8±0.4 21.3±0.8
桃软腐病菌 12.3±0.3 17.5±0.3 29.1±0.4
油菜菌核盘 0 0 0
小麦根腐 5.6±0.2 15.4±0.6 19.1±0.3
小麦全蚀 6.4±0.3 13.2±0.8 20.7±0.4
实施例10本实施例说明地衣芽孢杆菌BNCC132665在不同发酵培养基发酵产γ-聚谷氨酸及抗菌肽对植物病原菌的抑菌效果
平板培养基：蛋白胨16 g/L，酵母膏8 g/L，NacL16 g/L，琼脂20 g/L，pH 自然；
发酵培养基：（1）葡萄糖15 g/L，豆粕20g/L，K2HPO4•3H2O 1.2g/L，KH2PO41.6g/L，MgSO4•7H2O 0.45g/L,Cacl2 0.21g/L,其余为水，pH=7.4；
（2）糖蜜10 g/L，大豆蛋白胨10 g/L，K2HPO4•3H2O 1.2g/L，KH2PO41.6g/L，MgSO4•7H2O 0.45g/L,Cacl2 0.21g/L,其余为水，pH=7.4；
（3）豆腐黄浆水、葡萄糖5 g/L。
分别取三种不同发酵培养基（pH=6.5~7.5）分装在500mL锥形瓶中，装液量为50mL，121℃，灭菌20min，葡萄糖单独灭菌。将地衣芽孢杆菌BNCC132665于32℃平板活化菌种，24 h后接两环生长良好的菌体入50 mL种子培养基，32 ℃，190 rpm培养12 h，然后按照3.5%( v/v )接种量转接入装液量为50 ml发酵液/500ml三角瓶，32℃培养，转速为190rpm。利用不同发酵培养基作为发酵主体，在发酵36 h后地衣芽孢杆菌BNCC132665的发酵产γ-聚谷氨酸分别为38g/L、42g/L、53 g/L和发酵液中含有伊枯草菌素（iturin）、表面活性素（surfactin)。发酵实验后利用不同发酵培养基的发酵产物进行植物病原菌的抑菌试验，抑菌效果有明显的不同，抑菌结果如表6所示。
表6 地衣芽孢杆菌BNCC132665利用不同发酵培养基发酵后产物抑菌效果
植物病原菌 培养基(1)抑菌圈（mm） 培养基（2）抑菌圈（mm） 培养基（3）抑菌圈（mm）
棉花立枯 13.4±0.5 11.9±0.8 28.3±0.2
水稻纹枯 0 0 0
西瓜枯萎 14.5±0.6 12.8±0.4 30.9±0.5
小麦赤霉 10.1±0.3 8.5±0.2 21.1±0.2
苹果纶纹 0 0 0
花生叶霉 13.2±0.3 11.4±0.5 24.2±0.4
棉花枯萎 15.3±0.5 13.5±0.4 30.2±0.3
油菜白斑 14.5±0.6 12.2±0.7 28.2±0.2
番茄灰霉病 7.9±0.2 13.4±0.8 29.2±0.7
苹果红腐病 7.8±0.3 14.3±0.8 21.4±0.3
蚕豆黑斑 4.9±0.2 13.5±0.6 29.1±0.5
辣椒疫霉菌 9.8±0.2 13.2±0.6 28.5±0.3
黄瓜霜霉病 12.1±0.5 18.3±0.4 30.2±0.7
玉米小斑 11.3±0.3 16.3±0.6 31.3±0.4
小麦纹枯 0 0 0
甜瓜枯萎 12.4±0.5 20.3±0.5 31.8±0.6
小麦叶霉 0 0 0
烟草赤星病 10.3±0.5 12.5±0.9 21.8±0.4
灰葡萄孢霉 9.3±0.4 13.4±0.3 28.2±0.6
芦笋枯萎 13.2±0.3 17.2±0.3 30.4±0.5
三叶草核盘 11.2±0.2 15.3±0.3 32.1±0.4
立枯丝核 0 0 0
辣椒炭疽病 6.9±0.5 13.9±0.2 26.8±0.3
黄瓜苗期碎倒病 7.1±0.5 15.6±0.2 33.1±0.4
水稻白叶枯病 0 0 0
甘蔗黑穗病 5.6±0.2 13.2±0.3 25.4±0.5
桃软腐病菌 11.6±0.5 13.5±0.4 23.5±0.1
油菜菌核盘 7.8±0.5 16.3±0.3 21.8±0.2
小麦根腐 11.3±0.4 22.5±0.6 32.2±0.2
小麦全蚀 9.8±0.3 13.2±0.3 29.8±0.6
实施例11 本发明采用混合菌株在豆腐黄水发酵生产生物农药
平板培养基：蛋白胨16 g/L，酵母膏8 g/L，NacL16 g/L，琼脂20 g/L，pH自然。
好氧发酵培养基：豆腐黄浆水（豆腐生产中沥出的新鲜的黄浆水，无论是石膏豆腐、内酯豆腐或卤水豆腐均可），葡萄糖5 g/L。
将枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)保藏号BNCC189983、枯草芽杆菌枯草亚种保藏号BNCC190341、枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)保藏号CGMCCNo.13932、地衣芽杆菌BNCC132665）按质量比为1:2:4:1混合后按照4 %( v/v )接种量转接入装液量为50 ml发酵液/500ml三角瓶，32 ℃培养，转速为180 rpm。发酵36 h得到发酵产物，进行植物病原菌的抑菌试验，抑菌结果如表7所示，抑菌效果有明显的不同，利用豆腐黄浆水和葡萄糖作为发酵培养基后将四种芽孢类菌的发酵液混合按照比例为1:2:4:1，抑菌效果更加明显。
表7 四种芽孢类菌进行比例混合后利用豆腐黄水发酵后抑菌效果
植物病原菌 抑菌圈（mm）
棉花立枯 45.3±0.3
水稻纹枯 51.3±0.3
西瓜枯萎 42.2±0.2
小麦赤霉 39.4±0.3
苹果纶纹 38.2±0.5
花生叶霉 43.5±0.1
棉花枯萎 45.2±0.9
油菜白斑 46.2±0.4
番茄灰霉病 25.1±0.1
苹果红腐病 36.1±0.7
蚕豆黑斑 35.6±0.4
辣椒疫霉菌 49.2±0.2
黄瓜霜霉病 44.1±0.4
玉米小斑 46.1±0.1
小麦纹枯 51.2±0.4
甜瓜枯萎 39.3±0.3
小麦叶霉 37.2±0.4
烟草赤星病 38.9±0.8
灰葡萄孢霉 41.9±0.1
芦笋枯萎 41.4±0.8
三叶草核盘 35.9±0.4
立枯丝核 0
辣椒炭疽病 47.3±0.2
黄瓜苗期碎倒病 42.4±0.5
水稻白叶枯病 48.6±0.4
甘蔗黑穗病 45.5±0.2
桃软腐病菌 41.3±0.5
油菜菌核盘 42.8±0.9
小麦根腐 50.2±0.2
小麦全蚀 51.6±0.3
以上实施例中采用四种不同的芽类杆菌(Bacillus subtilis)在豆腐黄浆水中发酵高产γ-聚谷氨酸和抗菌肽（Surfactin、Fengycin、Iturin）。发酵所得的产物γ-聚谷氨酸和抗菌肽可应用于微生物饲料、饲料添加剂、微生物肥料、植物病害防治等领域。本发明的生物农药能有效用于防治水稻、瓜果蔬菜的病虫害,并且生产工艺简单,生产过程不产生污染。该产品具有十分巨大的应用价值和市场开发潜力。同时，本发明中的四种不同芽类杆菌发酵优点在于：具有联产Surfactin、Fengycin、Iturin三种抗菌脂肽和γ-聚谷氨酸的能力。该方法与其他发酵方法相比，可以充分回收利用废弃物豆腐黄浆水，减少豆制品加工中的黄浆水自然发酵酸浆存在致病菌等安全隐患，同时使得其得以综合利用，减少环境污染，同时变废为宝，提高经济效益；在发酵原料方面，利用豆腐黄浆水粗原料降低成本，能耗低，污染小，生产效率高，工艺简单，操作方便。因此本发明具有广阔的市场前景和工业化生产应用价值。
抗菌肽的提取方法:将发酵液于4 ℃、10000 rpm/min离心10 min，收集上清；用4mol/L的Hcl将上清液调至pH=2，4 ℃静置10-12 h后4 ℃、10000 rpm/min离心10 min，收集沉淀，将沉淀中加入5 mL的甲醇溶液，搅拌20min，4 ℃静置10 h，4 ℃、10000 rpm/min离心10 min，得到甲醇抽提物。经真空冷冻干燥后，得到抗菌物质，-20 ℃保存。
γ-聚谷氨酸的测定：发酵液经5000 rpm/min离心30 min，除去菌体，取上清液，加入3倍体积的无水乙醇，在4 ℃下静置过夜，8000 rpm/min离心20 min取沉淀，加入与发酵液等体积的蒸馏水溶解，即制得样液，稀释适当倍数后进行测定。
取2 mL标准液或样液于试管中，准确加入2 mLCTAB试液，自加入时开始计时，充分振荡，其间尽量避免反应液产生泡沫，静置至接近3 min，然后将反应液倒入比色皿中，3min时测定波长在250 nm下的吸光度(A250)，以未接种的培养基经相应处理后作为空白。
抗菌肽抗菌谱图的测定:将分离纯化的抗菌肽，用无菌水配制为5.0 µg/ml，利用真菌平板对峙实验(实验过程如下：病原真菌菌块放于含有15ml PDA 培养基的90 mm培养皿中央，在距离25 mm处打孔，将待测样品注入孔内，28℃培养 3天，观察抑菌效率)和细菌抑菌圈实验（实验过程如下：配制枯草芽孢杆菌水溶液，每毫升含菌120个，将枯草芽孢杆菌无菌水溶液1 ml加入LB培养基15ml中，待培养基凝固在其上打孔，将待测样品注入孔内，37℃培养8h，观察抑菌圈大小）进行生物活性测定。

Claims (4)

1.一种利用豆腐黄水发酵生产生物农药的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）取豆腐生产中沥出的黄浆水，调节豆腐黄浆水的pH=6.5~7.5；
2）将微生物种子液按2%~10%（V/V）的接种量接入豆腐黄浆水中，发酵温度25 ℃~40℃，好氧发酵20 h~72 h；发酵产物中含有γ-聚谷氨酸和抗菌肽作为生物农药；
所述微生物为枯草芽杆菌(Bacillus subtilis) BNCC189983、枯草芽杆菌枯草亚种BNCC190341、枯草芽杆菌(Bacillus subtilis) CGMCCNo.13932、地衣芽杆菌BNCC132665按质量比为1:2:4:1混合的混合菌株。
2.根据权利要求1所述的利用豆腐黄水发酵生产生物农药的制备方法，其特征在于，步骤1）中豆腐黄浆水121 ℃灭菌20 min,冷却至25 ℃以下。
3.根据权利要求1所述的利用豆腐黄水发酵生产生物农药的制备方法，其特征在于，步骤1）中豆腐黄浆水中还添加有葡萄糖。
4.根据权利要求3所述的利用豆腐黄水发酵生产生物农药的制备方法，其特征在于，所述葡萄糖的添加量为2~10 g/L。
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