CN103648285B

CN103648285B - 抗菌剂及其制造方法

Info

Publication number: CN103648285B
Application number: CN201280034832.4A
Authority: CN
Inventors: 岩原正宜; 森田洋; 宫田和幸
Original assignee: OUJU SEIYAKU KK
Current assignee: OUJU SEIYAKU KK
Priority date: 2011-07-15
Filing date: 2012-07-13
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2032-07-13
Also published as: JP2015071639A; JP5669943B2; US20140134153A1; CN103648285A; JPWO2013011679A1; US9095143B2; WO2013011679A1

Abstract

本发明提供利用灯心草科的植物所具有的抗菌作用或药效等的同时，向灯心草科的植物植入蘑菇菌丝体种菌给营养源而培养上述菌丝体而进行增殖，仅使用少量干燥这些的原料而有优良的抗菌性，添加到食品，或散布到农作物或土壤，或可作为脚癣治疗药使用的抗菌剂及其制造方法。将以指定的长度截断或上述截断后粉碎的灯心草科的植物和蘑菇的菌丝体种菌的营养源混合之后，将上述菌丝体种菌接种于上述灯心草科的植物和上述营养源的混合物，将上述菌丝体种菌以其发育温度培养一定期间。

Description

抗菌剂及其制造方法

【技术领域】

本发明涉及以食用灯心草等的灯心草科的植物和万年茸（灵芝）等的蘑菇的菌丝体作为主原料的抗菌剂及其制造方法。再有，本发明的抗菌剂可在食品中使用，或作为植物用的农药实施到土壤改良剂或植物栽培根圈，或作为脚癣治疗药使用，或作为手、指的抗菌剂使用。

【背景技术】

在日本作为草席的原材料使用的灯心草是分类为灯心草属（Juncus）的多年生草本植物，作为灯心草的生药而被熟知。在灯心草无毒性，还被认为有作为抗菌药－利尿药－消炎药－精神稳定药－不眠药等的药草的效能。另外，灯心草被确认对食中毒菌或腐败细菌有抗菌性。再者，灯心草除了对作为食中毒菌的沙门氏菌（Salmonella）或金黄色葡萄球菌、肠道出血性大肠杆菌O157，O26，O111之外，对作为腐败细菌的枯草芽孢杆菌或微球菌（Micrococcus）也有抗菌性。由此，在Labscale中，以1～10%左右的灯心草浓度发挥这些的抗菌性（参照例如，专利文献1）。

此外，利用以植物作为底物的酶的制造方法，将至少水洗的灯心草作成粉末，使用将此灯心草粉末杀菌而作为培养底物培养丝状菌的灯心草的酶的生产方法也被提案（参照例如，专利文献2）。

根据专利文献1得知，通过将灯心草以pH9以上的碱溶液加热处理，得到对真菌的增殖抑止效果功能。由此处理，使作为附加真菌的增殖抑止功能的灯心草原料，在例如关于住宅的建材及原料、纸类、衣料原料、关于吃的包装原料等中使用变得可能。另外公开了，在碱处理之后，直接不经水洗而将灯心草以真菌的增殖抑止的目的使用也可，此时，除了灯心草所具有的真菌的增殖防止效果之外，也可附加由pH的真菌的增殖控制功能，对灯心草的真菌的增殖抑止效果再升高。

专利文献2通过使用灯心草作为培养丝状菌而生产有用的酶时的底物，由于灯心草之内部是多孔质的海绵状，在其内部含有很多空气，从而具有好氧的微生物适宜的环境。具体而言，将剪下干燥的灯心草水洗而除去附着物，再者干燥后将灯心草粉碎而成粉末。通过向这样的灯心草粉末加所要量的纯水和果胶而加热处理而杀菌，在冷却至室温的状态下作为培养的底物，此底物成呈现含水分的面包状的培养基，向该培养基接种要培养的微生物、例如，作为真菌的丝状菌（液状）而维持在指定的温度而培养数天。此时，根据培养的微生物的种类经例如，7天～30天或其以上的天数进行培养。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1:特开2006-1891901号公报

专利文献2:特开2003-310254号公报

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

在专利文献1记载，灯心草有对食中毒菌或腐败细菌的抗菌性，从而将灯心草作为住宅或衣料的原料使用。

在专利文献2记载，使用灯心草作为培养底物，接种真菌而生产有用的酶的方法，但不是接种蘑菇的菌丝体，另外，对于制造抗菌剂，或给菌丝体的营养源毫无记载。

另一方面，本发明旨在提供可利用灯心草科的植物所具有的抗菌作用或药效等的同时，向灯心草科的植物植入蘑菇的菌丝体种菌，给营养源而培养上述菌丝体而进行增殖，仅使用少量干燥这些的原料而有优良的抗菌性，添加到食品，或添加到鱼的饵，或散布到农作物或土壤，或作为脚癣治疗药使用的抗菌剂及其制造方法。

【解决课题的技术方案】

为了解决上述的课题，本发明涉及的抗菌剂的制造方法的特征在于，将以指定的长度截断或粉碎的灯心草科的植物（在食品中利用时，适宜的处理终了物，水洗植物的附着物而处理的）和蘑菇菌丝体种菌的营养源混合之后，将上述菌丝体种菌接种于上述灯心草科的植物和上述营养源的混合物，将上述菌丝体种菌以其发育温度培养一定期间。

通过本发明涉及的抗菌剂的制造方法，植入到灯心草科的植物及其营养源的蘑菇的菌丝体种菌一边摄取营养源一边被培养增殖。菌丝体主要侵入灯心草科的植物内，摄取营养源而增殖。由于菌丝体侵入到灯心草科的植物内而增殖，本发明涉及的抗菌剂是，菌丝体所具有的抗菌性或杀菌性、防腐性与灯心草科的植物所具有的药效或抗菌性等一起协同发挥。因此，相比仅培养蘑菇的菌丝体种菌而增殖时，抗菌性或防腐性或杀菌性大幅地升高，制造的抗菌剂以少量有高的抗菌－防腐效果。

如权利要求2所述，上述灯心草科的植物可为选自下列的至少1中植物：灯心草（蔺、灯心草、ビーグ（灯心草的冲绳方言））、小髭，细蔺，犬蔺，蝦夷细蔺，丝蔺，深山蔺，高根蔺，花火石菖，草蔺。

如权利要求3所述，上述菌丝体种菌可为选自下列的至少1中担子菌类的菌丝体：万年茸（灵芝）、木层孔菌、山伏茸、木耳、榆木茸、香菇及蘑菇（Agaricus）（姬松茸）。

如权利要求4所述，上述营养源可为选自下列的至少1中：豆腐渣，小麦麸（麦皮）、米糠、酒粕（烧酒蒸馏粕）及大豆煮汁（大豆蒸煮液）。

如权利要求5所述，上述灯心草科的植物是灯心草，上述菌丝体种菌是万年茸（万年茸科之一种、灵芝），上述营养源是豆腐渣是优选的。

由如此选择而制造的抗菌剂，灯心草自身也有优良的抗菌作用，万年茸的菌丝体还侵入灯心草的蜂巢结构内，同菌丝体摄取豆腐渣作为营养源而增殖。由此，增殖的菌丝体的抗菌作用或杀菌作用强，与灯心草的抗菌作用相伴而抗菌－杀菌－防腐作用协同发挥，所以以极其少量发挥优良的抗菌防腐作用。而且，对于食品或作物无害，可作为食品防腐剂或作物用消毒药使用。

如权利要求6所述，在权利要求5所述的抗菌剂的制造方法中，将上述混合物于121℃用灭菌锅进行灭菌处理60～90分钟，冷却后，接种上述菌丝体种菌，于20～30℃温度培养1～3个月以上是优选的。

如权利要求7所述，在权利要求5所述的抗菌剂的制造方法中，上述混合物的配合比（重量比）率是相对于灯心草0.5～1.5而豆腐渣是0.5～1.5，用灭菌锅将上述混合物灭菌处理后，接种上述混合物全体重量的1～10%的万年茸菌丝体是优选的。

权利要求8所述的水溶性植物系统抗菌剂的特征在于，含有将通过上述权利要求5～7之任一项所述的制造方法制造的抗菌剂的干燥原料进行水提取、过滤的滤液或其滤液的浓缩液。

权利要求9所述的粉粒状抗菌防腐剂的特征在于，将通过上述权利要求5～7之任一项所述的制造方法制造的抗菌剂的干燥原料微粉碎。

由此，由于抗菌剂是粉粒状，从而容易处理。

权利要求10所述的粉粒状抗菌剂的特征在于，将通过上述权利要求5～7之任一项所述的制造方法制造的抗菌剂的干燥原料进行水提取，将水提取之后的干燥原料滓微粉碎或与上述干燥原料一同微粉碎。

由此，水提取的其余的滓也可作为抗菌剂利用，从而无浪费且经济。

【发明效果】

如上所述，由本发明涉及的抗菌剂，植入灯心草科的植物及其营养源的菌丝体种菌一边摄取营养源一边培养增殖。菌丝体主要侵入灯心草科的植物内，摄取营养源而增殖。由于菌丝体侵入灯心草科的植物内而增殖，本发明涉及的抗菌剂的菌丝体所具有的抗菌性或杀菌性、防腐性与灯心草科的植物所具有的药效或抗菌性等协同发挥。因此，与仅培养菌丝体种菌增殖时相比，抗菌性或防腐性或杀菌性大幅地升高，所以所制造的抗菌剂即使少量，抗菌防腐效果也高。

通过将本发明涉及的抗菌剂混合到养殖鱼的半生固体饵（湿颗粒）中，饵难以腐败，食后剩下的饵也不给养殖渔场周边的海域带来环境污染、特别是防止由海域的富营养化所至的赤潮的发生。

【附图说明】

【图1】显示本发明的实施品的灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂的对镰孢菌（Fusarium）的抗真菌效果（集落计数法），是显示空白、冷冻干燥及热风干燥的比较的坐标图。

【图2】显示本发明的实施品的灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂的对镰孢菌（Fusarium）的抗真菌效果（标准生长评分），是显示空白、冷冻干燥及热风干燥的比较的坐标图。

【图3】显示本发明的实施品的灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂的对分支孢子菌（Cladosporium）的抗真菌效果（集落计数法），是显示空白、冷冻干燥及热风干燥的比较的坐标图。

【图4】显示本发明的实施品的灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂的对分支孢子菌（Cladosporium）的抗真菌效果（标准生长评分），是显示空白、冷冻干燥及热风干燥的比较的坐标图。

【图5】显示本发明的实施品的灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂的对发癣菌（Trichophyton）的抗真菌效果（集落计数法），是显示空白、冷冻干燥及热风干燥的比较的坐标图。

【图6】显示本发明的实施品的灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂的对发癣菌（Trichophyton）的抗真菌效果（标准生长评分），是显示空白、冷冻干燥及热风干燥的比较的坐标图。

【图7】显示本发明的实施品的灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂的对小孢子菌（Microsporum）的抗真菌效果（集落计数法），是显示空白、冷冻干燥及热风干燥的比较的坐标图。

【图8】显示本发明的实施品的灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂的对小孢子菌（Microsporum）的抗真菌效果（标准生长评分），是显示空白、冷冻干燥及热风干燥的比较的坐标图。

【图9】显示本发明的实施品的灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂的对大肠杆菌的抗菌效果，是显示空白、冷冻干燥及热风干燥的比较的坐标图。

【图10】显示本发明的实施品的灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂的对芽孢杆菌（Bacillus）的抗菌效果，是显示空白、冷冻干燥及热风干燥的比较的坐标图。

【图11】显示本发明的实施品的灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂的对金黄色葡萄球菌的抗菌效果，是显示空白、冷冻干燥及热风干燥的比较的坐标图。

【图12】显示本发明的实施品的灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂的对微球菌（Micrococcus）的抗菌效果，是显示空白、冷冻干燥及热风干燥的比较的坐标图。

【实施方式】

以下，对于本发明涉及的抗菌剂及其制造方法的实施方式进行说明，但本发明不限于此实施方式。

在本实施方式中，作为原料之一的灯心草科的植物，使用食用灯心草（通常、在耕地中无农药栽培，主要使用地下水生长）。灯心草自身有抗菌作用。将灯心草水洗而除去附着物，漂白处理之后，截断成长度5厘米的尺寸。在漂洗处理中，将灯心草在100℃的热水中汤8分钟（通常7～9分钟左右）。由此处理，可抑制灯心草的变色或变性，可经长期间维持品质。另外，由于作为灯心草中含的不需要成分的灰汁被除去，可使用仅凝缩药效成分的截断灯心草。

菌丝体由于使用万年茸的菌丝体，将成为其营养源的“豆腐渣”与上述截断灯心草用混合机或手均一地混合。此混合作业进行3分钟左右。

混合之后，于121℃用灭菌锅进行灭菌处理60～90分钟，冷却至常温。冷却之后，将作为种菌的万年茸的菌丝体接种到上述混合物中。此时，将菌丝体在无菌条件下（例如清洁室内）接种是优选的。

其中，对于作为种菌的万年茸菌丝体的培养方法进行详细地说明。

（1）从自生或天然的万年茸子实体之一部分，使用组织培养法在马铃薯右旋糖琼脂（PDA）培养基上分离菌丝体集落，从而取得万年茸菌丝体。

（2）将菌丝体用液体培养基或琼脂培养基培养。

（2）-1用液体培养基培养时，在300ml三角瓶中制成100ml在右马铃薯右旋糖肉汤（PDB）培养基，进行高压灭菌处理。高压灭菌处理后，将上述（1）中得到的万年茸菌丝体使用铂耳加到适当量（本例中是10ml）的灭菌水中，搅拌。其后，将1～2ml菌丝体悬浮液添加到PDB培养基中，于30℃进行48小时振荡培养。

（2）-2用琼脂培养基培养时，也在300ml三角瓶中，制成100ml左右马铃薯右旋糖肉汤（PDB）培养基，进行高压灭菌处理。用灭菌锅灭菌处理后，向固体化的PDA琼脂培养基上添加上述（1）中得到的万年茸菌丝体，于30℃温度进行48小时培养。

（3）作为种菌使用（2）-1中培养的物质时，相对于灯心草200g、豆腐渣200g而添加20ml种菌（2）-1而进行培养。

（4）作为种菌使用（2）-2中培养的物质时，用药刀切琼脂培养基，相对于灯心草200g、豆腐渣200g添加至菌丝体量成10g而进行培养。

各原料的配合比（重量比）率可适宜变更，在本实施方式中，相对于灯心草0.5～1.5（在此是1.0），混合豆腐渣0.5～1.5（在此是1.0），用灭菌锅灭菌处理后，接种全体量的1～10%（例如10%）量的种菌。以具体的数值表示，则如上所述，是向混合各200g灯心草－豆腐渣的混合物接种20mL（10g）的种菌的形态。

如此，将万年茸菌丝体接种到上述混合物中后，考虑菌丝体的发育温度而在20～30℃条件下进行发酵（培养）处理。发酵期间作为约1～3个月（在此是1个月），发酵该时间以上也可。

通过将经以上的制造步骤制造的抗菌剂的原料（a）热风干燥或（b）冷冻干燥，可制造抗菌剂的干燥原料。此抗菌剂由茶色系粉粒体形成。

（a）热风干燥的条件：用温度60℃的热风干燥12小时。

（b）冷冻干燥的条件：使用真空冷冻干燥器进行干燥。将上述抗菌剂投入到冷冻器后，确认冷冻器内的温度于-30℃成真空条件下，使冷冻器内的温度升高至30℃。由此，自冷冻器内的温度达30℃起干燥24小时。

接下来，对于根据使用目的的抗菌剂的其之前的制造方法进行说明。

作为使用用途，有A.固体食品用防腐剂、B.植物用农药、C.脚癣治疗药、D.手或指的抗菌剂，E.养殖鱼用饵的抗菌剂等。

A.固体食品用防腐剂的情况中，将上述的干燥原料直接，或者将干燥原料（也含水提取粕）微粉碎的物质喷雾或添加到食品而使用。

B.植物用农药的情况中，对上述的干燥原料进行水提取，将用滤器过滤后的滤液浓缩，或者将滤液直接喷雾到土壤或作物上。此时，可通过添加铺展剂来增强其效果。再有，通过将水提取粕干燥后，与土壤改良剂或肥料混和，实施到植物栽培根圈，可期待从土中，地上的两面协同防除病原菌发生的效果。

C.脚癣治疗药及D.手或指的抗菌剂的情况中，将上述的干燥原料进行水提取，将过滤后的滤液浓缩，或者将滤液直接喷雾或涂布到患部。或者，可再与霜或其他脚癣治疗药混和，容易地涂布到患部。另外，与霜等混和时，也可将上述的干燥原料或水提取粕微粉碎而使用。

E.养殖鱼饵的抗菌剂的情况中，将上述的干燥前或干燥后的灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂混合到养殖鱼用半生固体饵（湿颗粒）中使用。干燥前的灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂的情况中，混合养殖鱼用半生固体饵的5～20重量%。结果，饵难变腐败，食后残留的饵不给养殖渔场周边的海域造成环境污染、特别是防止由海域的富营养化所至的赤潮的发生。

干燥原料的微粉碎是使用固定到旋转盘的锤在箱内高速旋转而进行冲击式粉碎的粉碎机进行微粉碎至平均粒径成20μm以下。

干燥原料的水提取，在本例中是将干燥原料0.0095g加到1000mL的灭菌水中，于25℃温度以70rpm进行振荡提取。其后过滤，得到提取液。或者，将干燥原料0.0095g加到1000mL的灭菌水中，于25℃温度通过超声波处理均一地分散而可得提取液。

如上所述，虽然对本发明的适宜的实施方式进行了说明，但在不脱离本发明的宗旨的范围内，各种追加、变更或删除是可能的。特别是，灯心草科的植物可为选自下列的至少一种植物：小髭，细蔺，犬蔺，蝦夷细蔺，丝蔺，深山蔺，高根蔺，花火石菖，草蔺。另外，菌丝体可为选自下列的至少一种担子菌类的菌丝体：木层孔菌、山伏茸、木耳、榆木茸、香菇及蘑菇（Agaricus）（姬松茸）。

再者，菌丝体的营养源中也可使用小麦麸（麦皮）、米糠、酒粕（烧酒蒸馏粕）及大豆煮汁（大豆蒸煮液）。从而，本发明的范围内也包括这些。

灯心草单独的抗菌性或药效的确认也重要，接下来对于与万年茸菌丝体的协同效果，进行关于“灯心草－万年茸·（豆腐渣）抗菌剂”的生理的功能性（抗菌效果及抗氧化性）的试验，接下来进行说明。

【试验方法】

1.真菌的抗菌性评价

1-1：灯心草－万年茸－豆腐渣粉末

灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂的样品有冷冻干燥和热风干燥的2种样品，将这些样品放入破碎机（大阪Chemical株式会社制，型番WB-1），于25,000rpm粉碎30分钟来进行微粉末化。

1-2：样品添加培养基的制备

将样品0.0095g加到500mL的灭菌水之后，用超声波处理将样品均一地分散。向300mL三角瓶加马铃薯右旋糖肉汤培养基（PDB培养基）2.4g和离子交换水49mL，向其中添加在上述制备的样品溶液50mL，进行高压灭菌处理。最终成为含9.5μg/mL的样品的PDB培养基。

1-3：抗真菌性试验

在本试验，将以下的真菌作为检验菌，进行样品的抗真菌性评价。

■检验菌

●支孢样支孢霉（Cladosporium cladosporioides）NBRC30314或支孢样支孢霉（Cladosporium cladosporioides）NBRC30314

●尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）NBRC31631

●紫色发癣菌（Trichophyton violaceum）NBRC31064

●犬小孢子菌（Microsporum canis）NBRC32464

向1-2中制备的样品液体培养基接种1mL检验菌的悬浮液至初始孢子浓度为10¹～10²孢子/mL之后，于30℃温度，以70rpm进行1周振荡培养。其中，向PDB培养基接种菌液至初始孢子浓度为10¹～10²孢子/mL的作为空白。在培养第1，3，7天进行采样，将马铃薯右旋糖琼脂培养基（PDA培养基）作为增菌培养基，于30℃进行培养。对于实验结果，作为由目测的评价方法而进行表1所示的由6阶段的判断。与此目测的评价同时，为了经时算出残留孢子数，使用集落计数法。

【表1】标准生长评分

评分	观察到的生长
		1	孢子大量形成
2	孢子轻度形成
		3	孢子略微形成
4	菌丝颠峰生长（完全覆盖）
		5	菌丝略微生长
6	无生长

2.细菌的抗菌性评价

2-1：灯心草－万年茸－豆腐渣粉末

灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂的样品有冷冻干燥和热风干燥的2种样品，将这些样品放入破碎机（大阪Chemical株式会社制，型番WB-1），于25,000rpm粉碎30分钟而进行微粉末化。

2-2：样品添加培养基的制备

将样品0.0095g加到500mL的灭菌水之后，用超声波处理，将样品均一地分散。向300mL三角瓶加营养肉汤培养基（NB培养基）0.8g和离子交换水49mL，向其中添加在上述制备的样品溶液50mL，进行高压灭菌处理。最终成含9.5μg/mL的样品的NB培养基。

2-3：抗菌性试验

在本实验中，将以下的细菌作为检验菌，进行样品的抗菌性评价。

■检验菌

●枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）IFO3335或－枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）IFO3335

●藤黄微球菌（Micrococcus luteus）IFO3333

●大肠埃希氏菌（Escherichia coli）IFO3972

●金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）IFO12732

向2-2中制备的样品液体培养基接种1mL检验菌的悬浮液至初始菌数浓度为10～10²CFU/mL之后，于30℃，以70rpm进行3天振荡培养。其中，向NB培养基接种菌液至初始菌数浓度为10¹～10²CFU/mL的作为空白。在培养第1，2，3天进行采样，将营养琼脂培养基（NA培养基）作为增菌培养基，于30℃进行培养。用集落计数法经时算出残留活菌数。

3.抗氧化性的测定

抗氧化性的测定是制成β胡萝卜素（100mg/100ml氯仿）、亚油酸（4g/100ml氯仿）、吐温80溶液（4g/100ml氯仿），各自取0.55ml、0.55ml、1.1ml到200ml的三角瓶中，加110ml的蒸馏水而溶解，制成亚油酸β胡萝卜素溶液。向此溶液90ml加8ml的0.2M磷酸缓冲液（pH6.8），安静地搅拌后，将4.9ml分注到试管中，添加0.1ml的样品（灯心草－万年茸－豆腐渣样品提取液）、混合，快速移到50℃的反应槽中，求出15分钟后～45分钟后的吸光度（470nm）的减少量。再者，求出的减少量除以对于添加基准溶液的BHA溶液（1mg/100ml的0.1M醋酸缓冲液（pH4.5）和甲醇的2：8（v/v）混合液）制成的反应液的吸光度的减少量而作为抗氧化活性值。

【试验结果】

1.抗真菌性试验结果

1-1植物病原性真菌（镰孢菌（Fusarium））

镰孢菌（Fusarium）属于不完全菌。在土壤中生息，作为植物的病原菌，由于使植物（主要根的部分）枯黄，屡屡成为问题。另外，由于在低湿、冷凉条件下也可发育，非常难控制。也知生产低温毒素（真菌毒素），这进入体内引起中毒症状（恶心、呕吐、腹痛、痢疾、造血功能障碍、免疫缺陷等）。制作新月型的分生子，孢子的颜色初始为白色，逐日缓慢着色，最终变成浓红色的集落。从而，本研究中对“灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌防腐剂”的对镰孢菌（Fusarium）的抗真菌效果进行试验

结果示于附图的图1（集落计数法）、图2（标准生长评分）。集落计数法的结果确认，本抗菌剂对镰孢菌（Fusarium）有1～2量级的抗真菌效果。在热风干燥和冷冻干燥样品中，在冷冻干燥样品中得到若干高的抗真菌效果，检测不到大的差异。但是，在标准生长评分中检测不到与空白之间明确的差异。

本提取液的浓度是9.5μg/mL（0.0095mg/mL），经计算以0.95%的低浓度发挥抗真菌效果。以这样的低浓度镰孢菌（Fusarium）可控制1～2量级，说明本提取液可作为农药利用。镰孢菌（Fusarium）被知为是对番茄、香蕉、红薯、豆科、瓜科、油菜科植物等广泛的植物的病原菌。“灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂”对镰孢菌（Fusarium）有抗真菌效果是大的成果，今后，本提取物的作为农药的利用可能性扩大。

1-2室内污染真菌（分支孢子菌（Cladosporium））

分支孢子菌（Cladosporium）属于不完全菌组。在空中悬浮的真菌之中也是最多的真菌。不仅在草席上，在浴室或被褥、厕所、盥洗室、厨房等的住居内也被发现。不仅在住居内，在包子，蛋糕、蔬菜等各种各样的食品上也滋生。颜色为从暗绿色至黑色的集落。虽然分支孢子菌（Cladosporium）并非自身产生毒性物质，但作为哮喘等的变应原而成为问题。从而，在本研究中，对于“灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂”的对分支孢子菌（Cladosporium）的抗真菌效果进行试验。

结果示于附图的图3（集落计数法）、图4（标准生长评分）。在任何的情况中，本提取液均无对分支孢子菌（Cladosporium）属菌的抗真菌效果。

1-3脚癣病原真菌（白癣菌）

脚癣是指白癣症之一。白癣症是被称为白癣菌的真菌之一种通过感染皮肤而引起的皮肤真菌症。在此白癣菌中有发癣菌（Trichophyton）属菌或小孢子菌（Microsporum）属菌，有喜好高温多湿的环境的性质。白癣菌感染人体的各种各样的部位，日本人中四人中有一人是白癣症。其感染途径大半是家庭内感染，对白癣症的日常的预防非常地重要。从而，在本研究中，对于“灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂”的对发癣菌（Trichophyton）属菌及小孢子菌（Microsporum）属菌的抗真菌效果进行试验。

发癣菌（Trichophyton）属菌的结果示于附图的图5（集落计数法）、图6（标准生长评分），小孢子菌（Microsporum）属菌的结果示于附图的图7（集落计数法）、图8（标准生长评分）。结果，发癣菌（Trichophyton）至3天培养检测不到大的抗真菌效果，但在7天培养的样品中得到明确的抗真菌效果。特别是在冷冻干燥样品中成为几乎全部发癣菌（Trichophyton）被杀灭的结果。

发癣菌（Trichophyton）的标准生长评分与空白比较，未呈现明确的差异，从而生长的成经7天培养杀灭的形态。即为灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂迟效地对发癣菌（Trichophyton）呈现效果的非常令人感兴趣的内容。另一方面，对于小孢子菌（Microsporum），检测不到抗真菌效果。

发癣菌（Trichophyton）属菌是占白癣症的大半的病原菌，另外，小孢子菌（Microsporum）属菌由于喜好寄生在犬或猫中，经由宠物感染人。因此，对发癣菌（Trichophyton）得到抗真菌效果成大大扩大了其作为脚癣治疗剂的可能性的结果。

顺便而言，灯心草单独的情况也对发癣菌（Trichophyton）得到抗真菌效果。灯心草单独的情况中，如果不是5%以上的浓度，则不发挥效果。本提取液的浓度是9.5μg/mL（0.0095mg/mL），经计算以0.95%的低浓度发挥抗真菌效果。结果是，由灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂的协同效果示相比灯心草单独的效果，抗真菌活性更增强的有用的数据。

2.抗菌性试验结果

2-1卫生指标细菌（大肠杆菌）

肠菌是革兰氏阴性的杆菌，属于兼性厌氧性菌，是环境中存在的细菌之中主要的种之一。此菌也是肠内细菌，在恒温动物（鸟类、哺乳类）的消化管内、特别是大肠中生息。作为细菌的代表成为模型生物之一，除了在各种研究中作为材料之外，也合并基因而在有用的化学物质的生产中利用。存在非病原性和病原性的大肠杆菌，非病原性大肠杆菌对人体无害，但在病原性大肠杆菌中，在几个病例中成为疾病的原因。在人体中，侵入血液中或尿路系统时成为病原体。由于产生内毒素，由大肠杆菌的败血症引起重度的内毒素休克。作为败血症的原因（得知时）最多的是尿路感染症，但大肠杆菌是作为尿路感染症的原因菌最多的菌。

从而，在本研究中，对于“灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂”的对大肠杆菌的抗菌效果进行调查。结果示于图9。

结果，至2天培养，无论冷冻干燥样品还是热风干燥样品均检测到比空白约7个量级多的大的抗菌效果。但是，在3天培养中，检测不到与空白的显著的差异，所以得知本作用有静菌效果。

2-2腐败菌（芽孢杆菌（Bacillus））

芽孢杆菌（Bacillus）是在自然界普遍存在的真正细菌之一种。由于有机物的分解能力强，作为腐败细菌为人所知。从而，在本研究中，对于“灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂”的对芽孢杆菌（Bacillus）的抗菌效果进行试验。结果示于附图的图10。

结果，经2天培养，无论是冷冻干燥样品还是热风干燥样品均检测到比空白6个量级多的大的抗菌效果。虽然经3天培养的样品，对于热风干燥的样品检测不到菌（约7个量级的抗菌效果），对于冷冻干燥样品，检测到比空白大的抗菌效果（约3量级的抗菌效果），但比热风干燥检测到4个量级左右的菌。在这里也得知本作用有静菌效果。

2-3人常在菌（金黄色葡萄球菌、微球菌（Micrococcus））

金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus））是人或动物的皮肤、消化管（肠）常见菌（肠内细菌）的葡萄球菌之一。是成为人的脓肿等的各种各样的表皮感染症或食中毒、另外肺炎、髓膜炎、败血症等致死的感染症的起因菌。微球菌（Micrococcus）是分类为革兰氏阳性细菌的真正细菌之一属，分类学上包括于放线菌。是人中常见的菌，食品腐败的菌种多。无菌丝形成能力，广泛分布于土壤或多样的水系统。

从而，在本研究中对于“灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂”的对金黄色葡萄球菌、微球菌（Micrococcus）的抗菌效果进行试验。结果示于附图的图11（金黄色葡萄球菌）、图12（微球菌（Micrococcus））。

结果，在任何的情况中均检测不到抗菌效果。

2-4灯心草单独的抗菌效果

灯心草的水提取液的抗菌谱示于表2。灯心草对于以沙门氏菌（Salmonella）属菌、葡萄球菌（Staphylococcus）属菌、EHEC O157、O26、O111为首的食中毒细菌或芽孢杆菌（Bacillus）属菌，小球菌（Micrococcus）属菌等的腐败细菌、还有作为军团菌症的原因菌的嗜肺军团菌（Legionella pneumophila），在MIC值0.78～100mg/mL的范围内检测到抗菌活性。显示最强的抗菌活性的是大肠埃希氏菌（Escherichia coli），MIC值是0.78mg/mL。由于本提取液的浓度是9.5μg/mL（0.0095mg/mL），经计算灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌剂对大肠杆菌或芽孢杆菌（Bacillus）以大大低的浓度发挥抗菌效果。

【表2】灯心草的抗菌谱

检验菌	MIC（mg/mL）
		枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）IFO3335	1.6
鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）IFO13245	3.1
		藤黄微球菌（Micrococcus luteus）IFO3333	1.6
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）IFO3972	0.78
		金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）IFO12732	50
荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）IFO3507	-
		酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）IFO2363	-
米曲霉（Aspergillus oryzae）IFO30102	-
		日本根霉（Rhizopus japonicus）IFO4697	-
EHEC O157:H7（VT1型）	100
		EHEC O157:H7（VT2型）	100
EHEC O157:H7（VT1、VT2型）	100
		EHEC O26:H11（VT1型）	100
EHEC O111:H8（VT1型）	100
		两岐双岐杆菌（Bifidobacterium bifidium）IFO14252	-
粪肠球菌（Enterococcus faecalis）IFO3971	-
		粪肠球菌（Enterococcus faecalis）IFO12580	-
屎肠球菌（Enterococcus faecium）IFO3128	-
		牛链球菌（Streptococcus bovis）IFO12057	-
普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）IFO14291	-
		嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）SG1	20

（-：检测不到）

3.抗氧化性试验

这回对灯心草－万年茸－豆腐渣抗菌防腐剂的抗氧化试验进行评价，但很遗憾没有检测到抗氧化活性。

Claims

1.抗菌剂的制造方法，其特征在于，

将截断或截断后粉碎的灯心草、和菌丝体种菌的营养源混合之后，

将上述菌丝体种菌接种于上述灯心草和上述营养源的混合物，

将上述菌丝体种菌以其发育温度培养一定期间，

其中所述的菌丝体种菌是蘑菇的菌丝种菌，

所述抗菌剂是灯心草、灯心草内增殖的菌丝体、及其营养源的混合物。

2.抗菌剂的制造方法，其特征在于，

将截断或截断后粉碎的灯心草、和作为菌丝体种菌的营养源的豆腐渣混合之后，

将上述菌丝体种菌接种于上述灯心草和上述豆腐渣的混合物，

将上述菌丝体种菌以其发育温度培养一定期间，

其中所述的菌丝体种菌是灵芝的菌丝体种菌，

3.权利要求1所述的抗菌剂的制造方法，其中上述菌丝体种菌还可以是灵芝、木层孔菌、山伏茸、木耳、榆木茸、香菇及姬松茸中的至少一种。

4.权利要求1所述的抗菌剂的制造方法，其中上述菌丝体种菌还可以是灵芝、木层孔菌、榆木茸及香菇中的至少一种。

5.权利要求1所述的抗菌剂的制造方法，其中上述营养源由选自下列的至少1种形成：豆腐渣，小麦麸、米糠、含烧酒蒸馏粕的酒粕及含大豆蒸煮液的大豆煮汁。

6.权利要求3或4中任一项所述的抗菌剂的制造方法，其中上述营养源由选自下列的至少1种形成：豆腐渣，小麦麸、米糠、含烧酒蒸馏粕的酒粕及含大豆蒸煮液的大豆煮汁。

7.权利要求3或4中任一项所述的抗菌剂的制造方法，其中

上述菌丝体种菌是灵芝的菌丝体，

上述营养源是豆腐渣。

8.权利要求6所述的抗菌剂的制造方法，其中

上述菌丝体种菌是灵芝的菌丝体，

上述营养源是豆腐渣。

9.抗菌剂的制造方法，其在上述权利要求2或权利要求7所述的抗菌剂的制造方法中，

将上述混合物于121℃用灭菌锅进行灭菌处理60～90分钟，

冷却后，接种上述菌丝体种菌，

于20～30℃温度培养1～3个月以上。

10.抗菌剂的制造方法，其在上述权利要求2或权利要求7所述的抗菌剂的制造方法中，

上述混合物的配合比率以重量百分比计相对于灯心草的0.5～1.5，豆腐渣为0.5～1.5，

用灭菌锅将上述混合物灭菌处理后，

接种上述混合物总重量的1～10％的灵芝的菌丝体。

11.水溶性抗菌剂，其特征在于，其为将包含通过上述权利要求1、2或7～10中任一项的制造方法所制造的抗菌剂的干燥原料进行水提取、由此而得到的过滤的滤液或其滤液的浓缩液。

12.粉末状抗菌剂，其特征在于，将通过上述权利要求1、2或7～10中任一项所述的制造方法制造的抗菌剂的干燥原料进行微粉碎。

13.微粉末状抗菌剂，其特征在于，

将通过上述权利要求1、2或7～10中任一项所述的制造方法制造的抗菌剂的干燥原料进行水提取，

将水提取之后的干燥原料粕进行微粉碎后或水提取之后的干燥原料粕与上述干燥原料一同微粉碎。