CN101677595A

CN101677595A - 动物用饲料添加剂

Info

Publication number: CN101677595A
Application number: CN200780031445A
Authority: CN
Inventors: 望月正己
Original assignee: Idemitsu Kosan Co Ltd
Current assignee: Idemitsu Kosan Co Ltd
Priority date: 2006-08-24
Filing date: 2007-08-09
Publication date: 2010-03-24
Also published as: KR20090053927A; WO2008023580A1; JPWO2008023580A1

Abstract

本发明提供用于辅助动物的消化活动、提高饲料效率的安全且简便的手段。具体地讲，提供通过抑制动物肠内的病原菌或球虫的增殖来预防·治疗感染症，并实现动物的体重增加的手段。将选自酱油曲霉(Aspergillus sojae)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、黑曲霉(Aspergillus niger)及米曲霉(Aspergillus oryzae)的至少一种的曲霉属菌、含有这些菌所产生的酸性酶的培养物、以及枯草杆菌(Bacillus subtilis)以规定量以上向动物投与。

Description

动物用饲料添加剂

技术领域

本发明涉及具有产生酸性酶的能力的曲霉属菌及含有杆菌属细菌的动物用饲料添加剂。

背景技术

家畜或宠物(以下称为动物)等的饲料虽然进行粉碎等的加工，但由于一般不进行加热处理等，因此存在消化吸收率变低、饲料效率差的问题。而且，最近作为人类的疾病已知的溃疡性结肠炎或克隆病等的炎症性肠病在动物中也见报告，存在引起腹泻等的症状的问题。此外，也已知这样的炎症性肠病会降低饲料的吸收或妨碍健康肥育。作为引起动物的肠内感染症的病原菌，已知的有病原性大肠菌、沙门氏菌属细菌、梭菌属细菌、弯形菌属细菌等。已知这样的病原菌在异常增殖时会产生毒素(肠毒素、细胞毒素)，在肠管粘膜引起疾病，引起软便或剧烈的腹泻等。此外，球虫是寄生于鸡、猪、牛等的肠管内的原虫，感染时会引起腹泻、食欲不振等。为预防·治疗这样的炎症性肠病而使用抗生素，但存在出现耐药性菌等的问题。

近年来，为了改善肠内菌群的平衡、抑制肠内病原菌的增殖而使用益生菌的技术正受到注目(专利文献1、专利文献2)。但是，乳酸菌或双歧杆菌在0.3％脱氧胆酸的浓度下死亡或在pH4以下中死亡的居多，除了统称为大肠菌群的细菌以外，以在胆汁酸中在对微生物具有强烈的抗菌性的脱氧胆酸的存在下不能生存的菌种居多。所以，人们探求在动物的消化管内也不死亡、给宿主带来有利的效果的菌种。

另一方面，报告有通过将动物用饲料在其加工阶段用酶或酶生产菌处理，预先某种程度分解好，由此减轻动物的胃肠负担的技术等有助于消化器系统的疾病的预防或改善(专利文献3)。此外，已知有一种方法，用曲霉菌使鱼粉以低水分发酵来得到含有高浓度的蛋白酶、脂肪酶等的鱼用鱼粉发酵饲料(专利文献4)。然而，这样的技术中存在一个问题，即提高饲料中的水分含量进行饲料的成分分解之后，需要进行干燥并产品化的繁杂的工序。为成分分解而提高水分含量的饲料甚至还存在容易产生腐败菌或霉等，难以维护品质等的问题。

此外，虽报告有一种将曲霉菌向动物经口投与来改良动物的糞便的方法，但未对抑制在动物肠内引起炎症等的有毒细菌的增殖或促进体重增加这样的用途进行过研究，也不知以使曲霉菌产生酸性酶的形态投与动物的情况(专利文献5)。

此外，记载有一种方法，在甲壳类的甲壳粉碎物中加入并混合发酵营养源，在其中接种选自黑曲霉、米曲霉、枯草杆菌、地衣形芽胞杆菌的1种或2种以上，并使几丁质或壳聚糖分解得到发酵物并给予动物(专利文献6)。用该方法得到的动物的成长促进效果一部分得到承认，但未对抑制动物肠内的病原菌的增殖、预防·治疗肠内感染症进行过研究，这样的效果也未得到承认。此外，混合两种以上的微生物并投与动物这一情况，实际上并未被研究。

此外，报告有枯草杆菌具有对病原性大肠杆菌等的病原菌的抗菌活性(专利文献7、8)，但对经口投与动物没有研究。此外，已知枯草杆菌DB9011具有黄曲霉毒素分解性，阻碍真菌的发育，研究了被添加到饲料中的情况(专利文献9)。然而，迄今为止尚未对组合枯草杆菌和其他系统的微生物并使动物摄取一事进行研究。

专利文献1：日本专利特表2005-507670号公报

专利文献2：日本专利特表2004-523241号公报

专利文献3：日本专利特开2004-141147号公报

专利文献4：日本专利特表平6-319464号公报

专利文献5：日本专利特开平11-171674号公报

专利文献6：日本专利特开2002-238466号公报

专利文献7：日本专利特开平11-332555号公报

专利文献8：日本专利特开平11-285378号公报

专利文献9：日本专利第3040234号公报

非专利文献1：George A.Burdock，Madhusudan G..Soni，and Loana G..Carabin(2001)Regulatory Toxicology and Pharmacology 33，80-101

非专利文献2：Harry E.Moron，Walter Kocholaty，Renate Junowicz-Kocholaty，and AlbertKelner(1945)J.Bacteriol 50，579-584

发明内容

本发明的课题在于提供用于辅助动物的消化活动、提高饲料效率的安全且简便的手段。具体地讲，课题在于提供这样一种手段，通过抑制动物肠内的病原菌或球虫的增殖来预防·改善肠内感染症，并实现动物的体重增加。

本发明人为解决上述课题进行专心研究的结果，发现：酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉及米曲霉产生酸性酶尤其是产生淀粉酶的能力优异、这些菌具有对引起肠内感染症的病原菌的抗菌活性以及具有对于球虫的杀原虫活性、以及这些作为益生菌发挥功能。此外，发现这些菌的酸性酶产生能力在以糙米为营养源培养时极其优异。而且，发现通过将这些菌体和由菌体产生的酸性酶组合并与饲料一同使动物摄取，由此促进消化、预防·改善肠内感染症、有助于动物的体重增加。此外，发现枯草杆菌即使与上述曲霉属菌及该菌所产生的酸性酶共存，也不妨碍其增殖。而且，发现通过将曲霉属细菌及该菌所产生的酸性酶、以及枯草杆菌组合并使动物摄取，可得到更优异的成长促进效果、肠内感染症的预防·改善效果，以至完成本发明。

即，本发明如下所述。

(1)一种动物用饲料添加剂，含有选自酱油曲霉(Aspergillus sojae)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、黑曲霉(Aspergillus niger)及米曲霉(Aspergillus oryzae)的至少一种的曲霉属菌、含有这些菌所产生的酸性酶的培养物以及枯草杆菌(Bacillus subtilis)，其特征在于，每g饲料添加剂的酸性酶活性的总合为120U以上，枯草杆菌的浓度为2.5×10⁷～2×10⁹CFU/g。

(2)如(1)记载的动物用饲料添加剂，其特征在于，所述酸性酶含有酸性淀粉酶，每g饲料添加剂的酸性淀粉酶活性为1U以上。

(3)如(1)或(2)记载的动物用饲料添加剂，其特征在于，所述曲霉属菌具有对引起动物肠内感染症的病原菌的抗菌活性及/或对于球虫的杀原虫活性。

(4)如(1)～(3)的任一项记载的动物用饲料添加剂，所述曲霉属菌是酱油曲霉及/或米曲霉。

(5)如(1)～(4)的任一项记载的动物用饲料添加剂，米曲霉是IK-05074株(FERMBP-10622)及/或它们的变异株，其特征在于，是具有与所述菌株相同的酸性酶产生能力的菌株。

(6)如(1)～(5)的任一项记载的动物用饲料添加剂，所述培养物含有植物性营养源。

(7)如(6)所记载的动物用饲料添加剂，所述植物性营养源是糙米。

(8)如(1)～(7)的任一项记载的动物用饲料添加剂，其特征在于，枯草杆菌是DB9011株(FERM BP-3418)及/或它们的变异株。

(9)如(1)～(8)的任一项记载的动物用饲料添加剂，其特征在于，用于成长促进。

(10)如(1)～(8)的任一项记载的动物用饲料添加剂，其特征在于，用于肠内感染症的预防·改善。

(11)一种饲料，含有0.01～1.0质量％的(1)～(10)的任一项记载的动物用饲料添加剂。

(12)一种饲料的制造方法，其特征在于，包括以下工序，在含有用于曲霉属菌的增殖的营养源的固体培养基中培养选自酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉及米曲霉的至少一种的曲霉属菌而得到培养物，含有该得到的培养物至每kg饲料的酸性酶活性的总和在12U以上的工序、和含有枯草杆菌至浓度为2.5×10⁶～2×10¹⁰CFU/kg的工序。

(13)一种动物的饲养方法，其特征在于，使动物摄取(11)所记载的饲料。

具体实施方式

本发明的动物用饲料添加剂的特征为，含有选自酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉及米曲霉的至少一种的曲霉属菌、含有这些菌所产生的酸性酶的培养物、以及枯草杆菌(Bacillus subtilis)细菌。

本发明的动物用饲料添加剂中含有的酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉及米曲霉在该技术领域中根据通常用于曲霉菌的种类鉴别的方法分类时，是分别被分类在上述这些种中的菌。菌种的鉴别，也可以参照如“H.Murakami，The Journal of General and AppliedMicrobiology，17，p.281-309，(1971)”、“村上英也，日本酿造协会志，第74卷，第12号，p.849-853，(1979)”、“Nikkuni，S.，et al，The Journal of General and Applied Microbiology，44，p.225-230，(1998)”等。

酱油曲霉是见于土壤、曲等中的丝状不完全菌的一种，是用于酱油、酱的酿造的菌。在本发明的动物用饲料添加剂中，只要是具有产生以下详述的酸性酶中至少一种、优选具有产生酸性淀粉酶的能力的、在动物摄食这一点上安全的酱油曲霉，则可以无特别限制地使用。在本发明的动物用饲料添加剂中，也可以使用市售的菌株，作为这种菌可以优选使用酱油曲霉AOK 210株(株式会社秋田今野商店)。

溜曲霉是见于土壤、曲、食品等中的丝状不完全菌的一种，是用于酱油、酱的酿造的菌。在本发明的动物用饲料添加剂中，只要是具有产生以下详述的酸性酶中至少一种、优选具有产生酸性淀粉酶的能力的、在动物摄食这一点上安全的溜曲霉，则可以无特别限制地使用。在本发明的动物用饲料添加剂中，也可以使用市售的菌株，作为这种菌可以优选使用溜曲霉AOK 43株(株式会社秋田今野商店)。

臭曲霉是见于土壤、曲、谷物糟粕等中的丝状不完全菌的一种，是用于酱、酱油的酿造的菌。在本发明的动物用饲料添加剂中，只要是具有产生以下详述的酸性酶中至少一种、优选具有产生酸性淀粉酶的能力的、在动物摄食这一点上安全的臭曲霉，则可以无特别限制地使用。在本发明的动物用饲料添加剂中，也可以使用市售的菌株，作为这种菌可以优选使用臭曲霉AOK N4586株(株式会社秋田今野商店)。

黑曲霉是见于土壤、曲、谷物糟粕等中的丝状不完全菌的一种，是在酒类制造、食品加工、糖的制造或医药的制造等各种场合中使用的菌。在本发明的动物用饲料添加剂中，只要是具有产生以下详述的酸性酶中至少一种、优选具有产生酸性淀粉酶的能力的、在动物摄食这一点上安全的黑曲霉，则可以无特别限制地使用。在本发明的动物用饲料添加剂中，也可以使用市售的菌株，作为这种菌可以优选使用黑曲霉AOK B650株(株式会社秋田今野商店)。

此外，也可以使用AOK 210株、AOK 43株、AOK N4586株或AOK B650株的变异株。变异株可以使这些菌株自然变异、或可以从用化学变异剂、或紫外线等进行变异处理而得到的菌株中挑选并得到分别与AOK 210株、AOK 43株、AOK N4586株或AOK B650株一样地具有产生酸性酶的能力的菌株。此外，还优选使用，除了产生酸性酶的能力之外进一步具有与上述菌株相同抗菌活性、杀原虫活性、耐胆汁酸性、耐酸性的至少一个的上述菌株的变异株。此外，进一步优选使用上述以外的菌学性质也和AOK 210株、AOK 43株、AOK N4586株或AOK B650株一样的变异株。

米曲霉是见于土壤、曲等中的丝状不完全菌的一种，是用于酱油、酱的酿造的菌。在本发明的动物用饲料添加剂中，只要是具有产生以下详述的酸性酶中至少一种、优选具有产生酸性淀粉酶的能力的、在动物摄食这一点上安全的米曲霉，则可以无特别限制地使用。在本发明的动物用饲料添加剂中，也可以使用市售的菌株，作为这种菌可以优选使用米曲霉IK-05074株。IK-05074株是自各种发酵食品中分离得到的株，于平成18年2月15日以保藏编号FERM P-20798保存于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(

305-8566，日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)中，于平成18年6月20日根据布达佩斯条约移交国际保藏，所受保藏编号为FERM BP-10622。

IK-05074株的菌学性质如下。

(1)菌落的性状(Czapek-DoX琼脂培养基(25℃下培养7天))

大小为直径50～60mm、颜色从黄到绿、随着时间的经过变化成带有褐色的颜色。菌丝体不明显，背面是无色。

(2)形态

分生孢子柄：薄壁～厚壁、滑面～稍微粗糙面、直径20μm以下、长度2mm以下、顶囊(顶のう)为直径40～50μm、80μm以下的球形。

梗基：在大部分大的分生孢子柄中存在，长度12μm以下。

瓶梗：安瓿型、长度为8～12μm、具有短的颈部。

分生孢子：直径5～6μm的球形、颜色从黄至绿，表面滑面～微细的粗糙面。

根据以上，推定IK-05074株归属于米曲霉(Aspergillus oryzae)。

此外，在本发明的动物用饲料添加剂中，也可以使用IK-05074株的变异株。IK-05074株的变异株可以是使IK-05074株自然变异、或者从用化学变异剂或紫外线等进行变异处理而得到的菌株中挑选得到与IK-05074株一样地具有产生酸性酶的能力的菌株。此外，也优选除了产生酸性酶的能力之外进一步具有与IK-05074株相同的抗菌活性、杀原虫活性、耐胆汁酸性、耐酸性的至少一个的IK-05074株的变异株。此外，进一步优选使用上述以外的菌学性质也和IK-05074株一样的变异株。

此外，在本发明的动物用饲料添加剂中，也可以在例如从土壤、曲、食品、谷物等中离析的酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉中将具备产生酸性酶的能力的菌株分离来使用。

产生酸性酶的能力是指在培养菌体而得到的培养物中以可以检测到酸性酶活性的程度产生酸性酶。培养物的酸性酶活性的测定可以按照常规方法进行。

本发明的动物用饲料添加剂所含有的酸性酶优选上述菌所产生的消化酶，只要是在胃肠内的酸性条件下不失活并具有活性的酶，则无特别限制，尤其优选具有2.5～5.5的最适pH的酶。例如，可以举例如酸性的α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、高峰淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、核糖核酸酶、核酸酶、木聚糖酶、果胶酶、脂肪酶等。本发明的动物用饲料添加剂含有这些当中的一种或两种以上。这其中尤其优选含有分解家畜的饲料成分中主要成分之一的淀粉的酸性淀粉酶。本发明的动物用饲料添加剂所含有的酸性淀粉酶只要是水解淀粉的酸性酶则无特别限制，可举例如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶等。这其中可以优选举例为在3附近具有最适pH的耐酸性α-淀粉酶。

本发明的动物用饲料添加剂只要含有酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉所产生的酸性酶中的至少一种即可，但也可以进一步含有其他菌种或其他生物种来源的酶。

本发明的动物用饲料添加剂的酸性酶活性只要使之在以下范围内即可。每g动物用饲料添加剂的酸性酶活性的总和在120U以上，优选170U以上，进一步优选220U以上，进一步优选270～5400U。酸性酶活性的总和优选是酸性淀粉酶活性、酸性蛋白酶活性及酸性羧基多肽酶活性的总和。此外，每g动物用饲料添加剂的酸性酶淀粉酶活性优选1U以上，进一步优选5U以上，进一步优选10U以上，再优选20～400U。此外，每g动物用饲料添加剂的酸性蛋白酶和酸性羧基多肽酶活性的总和优选100U以上，进一步优选150U以上，进一步优选200U以上，再优选250～5000U。

酸性淀粉酶、酸性蛋白酶及酸性羧基多肽酶的活性只要按照国税厅规定分析法(第3次修改税厅训令第1号)的固体曲的分析法的葡糖淀粉酶活性测定法、α-淀粉酶活性测定法、耐酸性α-淀粉酶活性测定法、酸性蛋白酶活性测定法及酸性羧基多肽酶活性测定法进行测定即可。

本发明的动物用饲料添加剂所含有的选自酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉的至少一种的曲霉属菌、以及含有这些菌所产生的酸性酶的培养物的浓度只要调节至饲料添加剂的酸性酶活性在上述范围内即可。通常，只要将使用充分量的糙米等的植物性营养源在28℃下7天左右培养上述菌而得到的培养物，在0.25～20质量％、优选0.5～10质量％、进一步优选1～5质量％的范围内添加即可。

此外，本发明中使用的上述曲霉属菌优选对引起动物肠内感染症的病原菌具有抗菌活性。

上述病原菌通常属于肠内细菌科。具体地举例有属于病原性大肠杆菌(Escherichiacoli)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯形菌(Campylobacter)、梭菌属(Clostridium)的细菌或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。作为病原性大肠杆菌，举例有产生肠毒素的大肠杆菌(产肠毒素性大肠杆菌、enterotoxigenic E.coli(ETEC))、产生浮肿病或O157等的志贺样(vero)毒素的肠出血性大肠杆菌(Verotoxin-producing E.coli(VTEC)、肠出血性大肠杆菌)等。作为属于沙门氏菌属的细菌，举例有鸡白痢沙门氏菌、鸡沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、德尔俾沙门氏菌、都柏林沙门氏菌等。作为属于弯形菌属的细菌，举例有空肠弯形菌、大肠弯曲杆菌、胎儿弯曲菌等。作为属于梭菌属的细菌举例有产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、艰难梭菌等。本发明的动物用饲料添加剂所含有的酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉特别对沙门氏菌属细菌、尤其是肠炎沙门氏菌以及梭菌属细菌、尤其是产气荚膜梭菌、浮肿病菌等的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有很高的抗菌活性。

对病原菌具有抗菌活性是指和病原菌一起接种在同一培养基时，具有抑制病原菌的增殖的能力。具有抗菌活性的酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉可以通过如将土壤、曲等的分离源添加到接种了肠炎沙门氏菌(SE)、产气荚膜梭菌(CP)、大肠杆菌(EC)、金黄色葡萄球菌(SA)等的病原菌的琼脂培养基中进行培养之后，分离已形成抑菌圈的菌体来得到。这样得到的菌由于具有抑制上述的病原菌的增殖的能力，因此可以通过向动物投食来预防·治疗动物的肠内感染症。

此外，引起动物的肠内感染症的病原菌的增殖被抑制是可以通过如测定动物的盲肠内容物或粪便中的病原菌的菌体浓度(生菌数)等来确认。

此外，本发明中使用的上述曲霉属菌优选对引起动物的肠内感染症的病原菌的球虫具有杀原虫活性。

球虫是指属于孢子虫类(Sporozoasida亚纲)的原虫。具体举例有艾美耳球虫属、等孢属、弓形虫属、隐孢子虫属等。作为属于艾美耳属的原虫举例有柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、邱氏艾美耳球虫、牛艾美耳球虫等。作为属于等孢属的原虫举例有猪等孢球虫、贝氏等孢球虫、人等胞子球虫(I.hominis)等。作为属于弓形虫属的原虫举例有刚地弓形虫等。作为属于隐孢子虫属的原虫举例有微小隐孢子虫等。本发明的动物用饲料添加剂尤其适宜用于柔嫩艾美耳球虫、邱氏艾美耳球虫引起的感染症。

对球虫具有杀原虫活性指使球虫的卵囊和菌的培养物共存时具有抑制卵囊的发芽·增殖的能力，优选具有减少卵囊的能力。具体地是指具有使卵囊的细胞壁变形、溶解、使卵囊损坏的能力。卵囊的损坏或细胞壁的状态用显微镜观察即可。

具有对球虫的杀原虫活性的酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉例如可以通过以下方法来得到。将土壤、曲等的分离源添加到装有使柔嫩艾美耳球虫或邱氏艾美耳球虫的卵囊悬浊的灭菌水的培养皿中，37℃中培养，观察1～7天。在已确认卵囊变形或溶解的培养皿中分离菌体，将此再添加到装有使柔嫩艾美耳球虫或邱氏艾美耳球虫的卵囊悬浊的灭菌水的培养皿中，37℃中培养，确认卵囊的变形或溶解。这样培养在培养皿中所含的菌，通过分别挑选属于酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉的菌，可以得到用于本发明的曲霉属菌。通过向动物投与这样得到的菌，可以、预防·治疗动物的肠内球虫感染症。

此外，对球虫的增殖被抑制与否，可以通过如显微镜下观察动物的盲肠内容物或粪便中的球虫的卵囊等来进行确认。

本发明的动物用饲料添加剂所含有的酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉优选具有对胃酸或胆汁酸的耐性。由此，即便在动物的肠内，菌体也产生有用的酸性酶、酸性酶引起的消化辅助的功能得以持续。此外，这些曲霉属菌具有对上述这样的病原菌的抗菌活性时，抑制引起动肠内感染症的病原菌的增殖，也有助于改善肠内菌群的平衡。对胃酸或胆汁酸具有耐性是指，菌在通常的消化器官内的条件下没有死亡，而是到达至肠。通常，动物的胃内部在空腹时pH2或有时达至其以下，但在摄取食物的状态下胃内部的pH为3.5～6的范围，高于空腹时的pH。因此，具有可以用于本发明的动物用饲料添加剂的耐酸性的菌株可以通过例如在pH3.5中将分离源处理2小时左右时挑选具有生存能力的菌株来获得。再有，通过在脱氧胆酸浓度10g/l的存在下将这样选择的菌处理24小时左右，并挑选具有生存能力的菌株，可以得到适合用于本发明的饲料添加剂的具有对对胃酸或胆汁酸的耐性的菌株。此外，菌没有死亡而到达至肠可以通过如测定动物排泄物中的菌体的浓度等来确认。

本发明的动物用饲料添加剂在上述菌种中可以单独含有一种菌株，也可以将两种以上菌株组合含有。尤其优选含有酱油曲霉及米曲霉的至少一种。

本发明的动物用饲料添加剂所含有的酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉的菌体浓度只要是在将饲料添加剂向动物投与时菌体不在消化器官内死亡的范围即可，通常将对制造具有上述酸性酶活性的饲料添加剂适当浓度的菌体接种在培养基并培养，最终将酸性酶活性的调节到上述值即可。

用于本发明的动物用饲料添加剂的酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉及米曲霉通过在通常的培养条件下培养来产生酸性酶。如，培养温度可以在25℃～40℃下进行，通常优选在28℃～32℃下培养。此外，培养方法可以使用利用往复运动式振荡培养、发酵罐培养等的液体培养法或固体培养法，但在上述菌体所具有的产生酸性酶的基因中也存在仅在固体培养基中发现的基因，因此本发明中优选使用固体培养法。

用于培养的培养基成分可以使用动物性或植物性的任一种，但优选含有植物性的营养源，例如优选含有糙米、糠、米糠、大豆、大麦等。尤其，特别优选糙米作为营养源。由此，可以提高酸性淀粉酶等的酸性酶的产生效率。

此外，也可以作为其他的炭源添加葡萄糖、蔗糖、糖蜜等的糖类、或作为氮源添加氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵等的铵盐或硝酸盐等。

如上操作得到的曲霉属菌的培养物优选干燥而放置。此外，也优选进行再添加用于提高保存性的任意成分等的加工来提高品质稳定性。

干燥方法无特别限定，可以利用如通风干燥、自然干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等来进行，尤其优选采用通风干燥。此外，也可以使用冷冻干燥，但此时也可以添加防护剂。防护剂的种类无特别限定，优选从脱脂乳、谷氨酸钠及糖类挑选一种或两种以上来使用。此外，使用糖类时其种类无特别限定，但优选使用葡萄糖或海藻糖。

再有，优选干燥后在得到的干燥物中加入脱氧剂、脱水剂，并放入气密性铝袋中密封，从室温至低温下保藏。由此，可以长时间以活的状态保存菌体。

用于本发明的动物用饲料添加剂的枯草杆菌只要是在伯杰氏细菌学鉴定手册(Bergey’s manual of Determinative Bacteriology)第9版(1994)中被分类到“枯草杆菌(Bacillus Subtilis)”的细菌，则无特别限制。作为这样的菌，可以使用枯草杆菌DB9011株、NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株等。DB9011株于1991年5月21日以FERM BP-3418存放在通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所(现在为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、

305-8566，日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。还有，DB9011株保存时被分类为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，但之后确认归属于枯草杆菌。此外，NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株是被登记在独立行政法人产品评价技术基盘机构的生物遗传资源部门(NBRC)的株。

DB9011株的菌学性质如下所述。

[表1]

表1

项目	DB9011
项目	DB9011	菌体的膨胀7％NaClNO₃→NO₂VP反应蛋黄(egg·york)吲哚60℃革兰氏芽孢的位置光泽菌落表面	-+++---+中央无褶皱

形态：菌体宽0.7～0.8μm的杆菌。椭圆形的芽孢在略微中央，菌体无膨胀。有运动性，形成R型菌落。厌氧性条件下不繁殖。

各培养基中的繁殖状态：

(1)DHL琼脂培养基：不繁殖。

(2)麦康凯琼脂培养基：不发育。

(3)甘露醇食盐培养基：发育良好。有光泽。菌落表面无褶皱、菌落色黄。

(4)普通琼脂培养基：发育良好。无光泽。菌落表面有褶皱、菌落色白。

(5)心浸液琼脂培养基：发育良好。无光泽。菌落表面有褶皱、菌落色白。

(6)血液琼脂培养基(加10％绵羊血)

发育良好。无光泽。菌落表面有褶皱、菌落色白。

(7)PDA培养基：发育良好。无光泽。菌落表面有褶皱、菌落色白。

生理学性质：

革兰氏反应： +

明胶试验：

繁殖状态；全面液化

明胶液化； +

石蕊牛乳：

反应；酸

状态；凝固

硝酸盐还原： +

脱氮反应： -

MR试验： -

吲哚的生成：

硫化氢的生成：

柠檬酸的利用(Christensen)： +

尿素酶： -

氧化酶： +

过氧化氢酶： +

繁殖的范围：

pH； 4～9

温度； 25～50℃

OF试验：发酵及产生气体(由于葡萄糖分解引起)

糖类的利用性

气体产生酸生成

L-阿拉伯糖 - +

D-木糖 - +

D-葡萄糖 + +

D-甘露糖 - +

D-果糖 - +

D-半乳糖 - +

麦芽糖(maltose) - +

蔗糖(sucrose) - +

乳糖(lactose) - +

海藻糖 - +

D-山梨糖醇 - +

D-甘露醇 - +

肌醇 - +

甘油 - +

淀粉 - +

6-β-α-葡萄糖苷的分解： +

丙二酸的利用：

精氨酸的分解： +

赖氨酸的脱碳酸反应： +

尿素分解： ±

黄曲霉毒素分解： +

鸟氨酸的脱碳酸反应： -

凝血酶： -

溶血性： +

氯化钠的耐性： 10％以下

氰化钾的耐性：可以发育

卵磷脂酶：-

此外，本发明的动物用饲料添加剂中也可以使用这样的菌株，是使枯草杆菌DB9011株、NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株自然变异、或者从用化学变异剂或紫外线等发生变异而得到的菌株中挑选具有与各菌株相同菌学性质的菌株。作为枯草杆菌DB9011株的变异株优选挑选使用具有上述菌学性质的菌株。

在本发明的动物用饲料添加剂中，枯草杆菌的浓度为2.5×10⁷～2×10⁹CFU/g，优选5×10⁷～1×10⁹CFU/g，进一步优选1×10⁸～5×10⁸CFU/g。

此外，在本发明的动物用饲料添加剂中，枯草杆菌的浓度也可以作成：每显示1U的酸性酶活性总和的动物用饲料添加剂中为2.0×10³～5×10⁶CFU，优选1.0×10⁴～1.0×10⁶CFU，每显示1U的酸性淀粉酶活性的动物用饲料添加剂中为1.0×10⁵～2.5×10⁸CFU，优选5.0×10⁵～5.0×10⁷CFU，每显示1U的酸性蛋白酶活性和酸性羧基多肽酶活性的总和的动物用饲料添加剂中为2.0×10³～5.0×10⁶CFU，优选1.0×10⁴～1.0×10⁶CFU。

本发明的动物用饲料添加剂所使用的枯草杆菌优选具有在上述曲霉属菌及该菌所产生的酸性酶的存在下增殖的能力。

本发明的动物用饲料添加剂所使用的枯草杆菌优选有耐胆汁酸性。

“耐胆汁酸性”是指在含有高浓度的胆汁酸的培养基中形成具有发芽·增殖的能力的孢子。

胆汁酸是指在哺乳类、鸟类、爬虫类、两栖类、鱼类的胆汁中广泛可见的4环结构的类固醇，包含胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸以及熊去氧胆酸。通常，胆汁酸在动物体内的胆汁中以与甘氨酸或牛磺酸进行酰胺键合的接合形存在，为钠盐。本说明书中仅称“胆汁酸”时包括上述胆汁酸和这些盐以及这些接合体。

含有高浓度的胆汁酸的培养基是如含有将新鲜胆汁以10倍浓缩·干固的胆汁粉末(Oxgall、Difco制造)的培养基，举例有胆汁末的浓度为0.3质量％以上、优选1质量％以上、进一步优选3质量％以上的培养基。此外，“具有发芽·增殖的能力”是指在含有如上所述高浓度的胆汁酸的培养基中接种孢子，并将胆汁酸浓度以外的条件设定为适宜培养枯草杆菌的条件时，细菌发芽、重新进行增殖分裂，形成菌落。

耐胆汁酸的枯草杆菌可以如下进行得到。将含有枯草杆菌的分离源在适于形成孢子的条件下培养，使之形成孢子。得到的孢子接种于上述添加高浓度的胆汁酸的培养基中进行培养之后，分离所形成的菌落。在该菌落之中挑选具有枯草杆菌的菌学性质的菌。

用于本发明的动物用饲料添加剂的枯草杆菌进一步优选有耐酸性。通过使用这样的细菌，细菌即便在胃内部也不会死亡而是到达至肠。“耐酸性”是指向动物投与细菌时，即便在胃内部的条件下(摄取食物的状态下通常pH3.5～6)也不会死亡而到达至肠时，仍维持可增殖的程度的菌数。枯草杆菌的孢子通常是耐酸性，因此使用孢子时尤其不成问题。

本发明的动物用饲料添加剂可以单独含有枯草杆菌的一种菌株，也可以将2种以上的菌株组合来含有。这其中，特别优选单独使用DB9011，或与其他菌株组合使用。

培养用于本发明的动物用饲料添加剂的枯草杆菌的方法无特别限制，可以在依据细菌的性质的适当的条件下按照常规方法进行。例如，培养温度可以在20～40℃下进行，但通常优选30～37℃下培养。此外，培养方法可以使用利用静置培养、往复运动式振荡培养、旋转运动式振荡培养、发酵罐培养等的液体培养法或固体培养法。

用于培养的培养基成分也无特别限制，作为炭源可以使用葡萄糖、半乳糖、乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、淀粉、淀粉水解物、糖蜜等的糖类、柠檬酸等的有机酸类、甘油等的醇类，作为氮源可以使用氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵等的铵盐类或硝酸盐类，此外，可以使用氯化钠、氯化钾、磷酸钾、硫酸镁、氯化钙、硝酸钙、氯化锰、硫酸亚铁等的无机盐类、胨、大豆粉、脱脂大豆粕、肉提取物、酵母提取物等。

用于本发明的动物用饲料添加剂的枯草杆菌从保存稳定性、耐酸性的观点来看，优选是孢子的状态。孢子的状态下由于耐热、耐干燥，因此可以在制造饲料添加剂时使之充分干燥，保存稳定性提高。为了在细菌中形成孢子，只要在培养周期中将培养基的组成、培养基的pH、培养温度、培养湿度、培养时的氧浓度等的培养条件调节至适合形成孢子的条件即可。作为这样的方法，如举例有Schaeffer P.，J.Millet，J.P.Aubert，“美国国家科学院刊(Proceedings of the National Academy of Science)”美国，1965年，第54卷，p704～711中记载的方法等。

此外，从保存稳定性的观点来看，按照上述方法得到的枯草杆菌的培养物或孢子优选做成干燥粉末来放置。干燥优选例如使水分含量成为20质量％以下。干燥及保存的方法与曲霉属菌的培养物的干燥相同。

本发明的动物用饲料添加剂可以混合上述的酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉及米曲霉的至少一种的曲霉属菌、以及含有该菌所产生的酸性酶的全部或一部分培养物和枯草杆菌的菌体而得到。

此外，本发明的动物用饲料添加剂可以进一步添加任意成分。这些任意成分作为饲料成分其安全已得到认可，只要是不使上述曲霉属菌以及枯草杆菌死亡且不使酸性酶活性失活的，则无特别限制地使用。例如，优选举例有β-葡聚糖、葡糖甘露糖胶、甘露糖胶低聚糖、海藻等的免疫活化剂、葡糖酸、γ-氨基酪酸、柠檬酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、泛酸、丁酸等的有价酸等。

本发明的动物用饲料添加剂通过使动物摄取来促进动物的体重增加，因此可以作为促进成长用的动物用饲料添加剂。此时，尤其优选调制成每g饲料添加剂的酸性酶活性的总和在270U以上、酸性淀粉酶活性在20U以上、酸性蛋白酶和酸性羧基多肽酶活性的总和在250U以上、枯草杆菌的浓度为1×10⁸CFU/g以上。

本发明的动物用饲料添加剂通过使动物摄取来预防肠内感染症等，因此可以作为肠内感染症的预防·改善用的动物用饲料添加剂。此时，尤其优选调制成每g饲料添加剂的酸性酶活性的总和在540U以上、酸性淀粉酶活性在40U以上、酸性蛋白酶活性和酸性羧基多肽酶活性的总和在500U以上、枯草杆菌的浓度为2.5×10⁸CFU/g以上。

此外，本发明的动物用饲料添加剂从安全性的观点来看优选曲酸的含有浓度低。通常曲酸的含有浓度优选0.1mg/l以下、进一步优选0.01mg/l以下。

本发明的饲料的特征在于，相对于饲料总量，含有干燥状态下0.01～1.0质量％、优选0.02～0.5质量％、进一步优选0.04～0.25质量％的本发明的动物用饲料添加剂。

此外，每kg本发明的饲料的酸性酶活性的总和为12U以上、优选17U以上、进一步优选22U以上、再优选27～54000U。此外，枯草杆菌的浓度为2.5×10⁶～2.0×10¹⁰CFU/kg、优选5.0×10⁶～1.0×10¹⁰CFU/kg、进一步优选1.0×10⁷～5.0×10⁹CFU/kg。此外，每kg饲料的酸性淀粉酶活性优选为0.1U以上、进一步优选0.5U以上、再优选1U以上、再优选2～4000U。此外，每kg饲料的酸性蛋白酶活性和酸性羧基多肽酶活性的总和优选为10U以上、进一步优选15U以上、再优选20U以上、再优选25～50000U。

本发明的饲料可以通过将本发明的动物用饲料添加剂添加到通常使用的饲料成分中来制造。只要本发明的动物用饲料添加剂中所含的菌体不死亡、且酸性酶不失活，则饲料的种类或成分无特别限制，通常在家畜饲料或宠物食品、动物用添加物等作为动物饲料使用的物品中添加·混合即可。

此外，本发明的饲料也可以将动物用饲料添加剂以干燥状态添加到饲料成分中进行混合，但为了使混合容易，也可以以液状或凝胶状的形态来使用。此时，可以将水、大豆油、菜籽油、玉米油等的植物油、液体动物油、聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸等的水溶性高分子化合物作为液体载体来使用。此外，为保持饲料中的菌体浓度的均一性，也优选混合藻酸、藻酸钠、苍耳烷胶、酪蛋白钠、阿拉伯胶、愈疮胶、罗望子种子多糖类等的水溶性多糖类。此外，为防止杂菌的繁殖，还优选混合有机酸。

此外，本发明的饲料还可以通过以下所述来制造，在含有用于曲霉属菌的增殖的营养源的固体培养基中培养选自酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉的至少一种曲霉属菌，将所得的培养物以及枯草杆菌分别与饲料成分混合，将调节饲料的酸性酶活性以及枯草杆菌的浓度至上述范围内。

本发明的饲料可以作为用于促进动物的成长的饲料。此外，当上述的曲霉属菌进一步具有针对引起动物的肠内感染症的病原菌的抗菌活性以及/或针对球虫的杀原虫活性时，可以作为用于预防·治疗病原菌以及/或球虫引起的肠内感染症的饲料。

摄取本发明的饲料的动物种类无特别限制，可举例的有哺乳类、鸟类、爬虫类、两栖类、鱼类等。这其中，特别合适地用于家禽、家畜。作为家禽合适的有鸡、鸭、鹌鹑、火鸟等，作为家畜合适的有猪、牛、羊、兔等。使动物摄取的饲料的量可以根据动物的种类、体重、年龄、性别、使用目的、健康状态、饲料的成分等适当调节。

摄取饲料的方法也可以根据动物的种类采取通常采用的方法。

实施例

<1>曲霉属菌的培养

调节马铃薯右旋糖琼脂培养基的pH为5，在121℃下杀菌15分钟。该琼脂培养基的温度降到60℃时，以每1L培养基为10g的浓度添加脱氧胆酸钠，接种保存在株式会社秋田今野商店(日本国秋田县大仙市刈和野248)的曲霉属菌，结果酱油曲霉(Aspergillussojae)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、黑曲霉(Aspergillus niger)在培养基中繁殖良好。酱油曲霉AOK210株、溜曲霉AOK43株、臭曲霉AOK N4586株及黑曲霉AOK B650株尤其繁殖良好。

在和上述一样含有脱氧胆酸钠的培养基中将各种发酵食品作为分离源接种很多曲霉属菌，在培养基中繁殖的菌株中挑选繁殖最好的株。将该株作为米曲霉IK-05074株，保存在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。

IK-05074株的菌学性质如上所述。

将糙米作为固体培养基，进行了酱油曲霉AOK 210株、溜曲霉AOK43株、臭曲霉AOK N4586株、黑曲霉AOK B650株以及米曲霉IK-05074株的培养。即，在水中浸泡糙米一昼夜使之膨胀之后，以2厘米的厚度放入在盖上带有无菌过滤器、直径14厘米、深10厘米的聚碳酸酯制的容器中，用高压灭菌器在121℃下杀菌15分钟。在该容器接种上述各菌体，28℃下培养5天，制造种菌。

然后，将和上述一样膨胀的糙米在30×40×10cm的不锈钢容器中以1.5cm厚度层叠，盖上具有以20×25厘米的过滤器覆盖的通气口的盖子，放入大型高压灭菌器在121℃下杀菌25分钟。冷却该容器之后，接种已事先培养好的全部上述种菌。将该容器放入28℃的孵卵器中培养7天。

培养后，35℃下通风干燥、用喷射式粉碎机粉碎，针对各个菌种得到固体培养物。

测定了每1g各个固体培养物的耐酸性α-淀粉酶活性、以及酸性蛋白酶活性和酸性羧基多肽酶活性的总和。每1g各固体培养物的上述酶活性在表2表示。

还有，上述酸性酶的测定按照国税厅规定分析法(第3次修改税厅训令第1号)的固体曲的分析法的耐酸性α-淀粉酶活性测定法、酸性蛋白酶活性测定法及酸性羧基多肽酶活性测定法进行测定。

[表2]

表2

菌株	耐酸性α-淀粉酶活性(U)	酸性蛋白酶活性、酸性羧基多肽酶活性的总和(U)
菌株	耐酸性α-淀粉酶活性(U)	酸性蛋白酶活性、酸性羧基多肽酶活性的总和(U)	酱油曲霉	2555	46917
溜曲霉	313	50248	酱油曲霉	2555	46917
溜曲霉	313	50248	臭曲霉	586	29660
黑曲霉	399	20341	臭曲霉	586	29660
黑曲霉	399	20341	米曲霉	4250	51301

<2>曲霉属菌的培养物的抗菌活性的测定

通过将酱油曲霉AOK 210株及米曲霉IK-05074株和细菌共同培养，试验了这些曲霉属菌对细菌的抗菌活性。

对肠炎沙门氏菌(SE)，在标准琼脂培养基(日水制药(株)制造)37℃下进行24小时的需氧培养。挑取平板上发育的菌落，使之悬浮在灭菌生理盐水中。在1L容量的三角烧瓶中制作500ml脑心浸液肉汤“日水”，高压灭菌器杀菌之后，无菌性地投入至SE的最终浓度成为约1.0×10⁴～1.0×10⁵CFU/ml。将各个酱油曲霉AOK 210株及米曲霉IK-05074株的粉碎固体培养物各5g无菌性投入到三角烧瓶中，作为试验例1及2，将未加曲菌培养物的三角烧瓶作为对照区。各个三角烧瓶在37℃的恒温器中在需氧条件下缓慢搅拌培养。

对产其荚膜梭菌(CP)，用Anaeropack kenki(三菱瓦斯化学(株)制造)在加蛋黄的CW琼脂培养基(日水制药(株)制造)中37℃下进行24小时的厌氧培养。挑取平板上发育的菌落，使之悬浮在灭菌生理盐水中。在1L容量的三角烧瓶中制作500ml脑心浸液肉汤“日水”，高压灭菌器杀菌之后，无菌性地投入至CP的最终浓度成为约1.0×10⁴～1.0×10⁵CFU/ml。将酱油曲霉AOK 210株及米曲霉IK-05074株的粉碎固体培养物每种各5g无菌性地投入到三角烧瓶中，作为试验例3及4，将未加曲菌培养物的三角烧瓶作为对照区。各个三角烧瓶在37℃的恒温器中用Anaeropack kenki在厌氧条件下缓慢搅拌培养。

试验开始后，在第0天、3天、7天实施SE及CP的生菌数测定。SE的生菌数测定方法是，用灭菌生理盐水将采取的培养液阶段稀释10倍之后，将各个稀释阶段液的0.1ml涂布在X-SAL琼脂培养基“日水”，进行37℃、24小时的需氧培养，计数已发育的特征性的菌落。CP的生菌数测定方法是，用灭菌生理盐水将采取的培养液阶段稀释10倍之后，将各个稀释阶段液的0.1ml涂布在加蛋黄的CW琼脂培养基(日水制药(株)制造)，用Anaeropack kenki进行37℃、24小时的厌氧培养，计数已发育的特征性的菌落。

在表3显示SE的生菌数，在表4显示CP的生菌数。

[表3]

表3

[表4]

表4

如试验例1及2所示，酱油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的固体培养物显示出对于SE的抗菌活性。还有，在对照区中可见到试验第7天为止菌数上升，在第7天显示为2.9×10⁸CFU/ml。

如试验例3及4所示，酱油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的固体培养物显示出对于CP的抗菌活性。在对照区中可见到试验第7天为止菌数上升，在第7天显示为1.2×10⁶CFU/ml。

对大肠杆菌Escherichia coli(EC)，在标准琼脂培养基(日水制药(株)制造)37℃下进行24小时的需氧培养。挑取平板上发育的菌落，使之悬浮在灭菌生理盐水中。在1L容量的三角烧瓶中制作500ml脑心浸液肉汤“日水”(日水制药(株)制造)，高压灭菌器杀菌之后，无菌性地投入至EC的最终浓度成为约1.0×10⁵～1.0×10⁶CFU/ml。将酱油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的粉碎固体培养物每种各5g无菌性投入到三角烧瓶中，作为试验例5及6，将未加曲菌培养物的三角烧瓶作为对照区。各个三角烧瓶在37℃的恒温器中在需氧条件下缓慢搅拌培养。

对金黄色葡萄球菌(SA)，在标准琼脂培养基(日水制药(株)制造)37℃下进行24小时的需氧培养。挑取平板上发育的菌落，使之悬浮在灭菌生理盐水中。在1L容量的三角烧瓶中制作500ml脑心浸液肉汤“日水”(日水制药(株)制造)，高压灭菌器杀菌之后，无菌性地投入至SA的最终浓度成为约1.0×10⁵～1.0×10⁶CFU/ml。将酱油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的粉碎固体培养每种各5g无菌性投入至三角烧瓶中，作为试验例7及8，将未加曲菌培养物的三角烧瓶作为对照区。各个三角烧瓶在37℃的恒温器中在需氧条件下缓慢搅拌培养。

试验开始后，在第0天、3天、7天实施EC及SA的生菌数测定。EC的生菌数测定方法是，用灭菌生理盐水将采取的培养液阶段稀释10倍之后，将各个稀释阶段液的0.1ml涂布在Chromocult Coliform琼脂“默克”(默克制造)之后，进行37℃、24小时的需氧培养，计数已发育的特征性的菌落。SA的生菌数测定方法是，用灭菌生理盐水将采取的培养液阶段稀释10倍之后，将各个稀释阶段液的0.1ml涂布在加蛋黄的甘露醇食盐培养基“荣研”(荣研器材(株)制造)之后，进行37℃、24小时的需氧培养，计数已发育的特征性的菌落。

在表5显示EC的生菌数，在表6显示SA的生菌数。

[表5]

表5

[表6]

表6

如试验例5及6所示，酱油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的固体培养物显示出对于EC的抗菌活性。还有，在对照区中在试验第3天可见到最高的菌数，在第3天显示为4.3×10⁸CFU/ml、第7天显示为1.7×10⁷CFU/ml。

如试验例7及8所示，酱油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的固体培养物显示出对于SA的抗菌活性。在对照区中在试验第3天可见到最高的菌数，在第3天显示为4.2×10⁸CFU/ml、第7天显示为7.2×10⁷CFU/ml。

对枯草杆菌DB9011株、NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株，在标准琼脂培养基(日水制药(株)制造)37℃下进行24小时的需氧培养。挑取平板上发育的菌落，使之悬浮在灭菌生理盐水中。在1L容量的三角烧瓶中制作500ml脑心浸液肉汤“日水”(日水制药(株)制造)，高压灭菌器杀菌之后，无菌性地投入至DB9011株、NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株的最终浓度成为约1.0×10⁴～1.0×10⁵CFU/ml。将每种酱油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的粉碎固体培养物各5g无菌性投入到三角烧瓶中，作为试验例9～18，将未加曲菌培养物的三角烧瓶作为对照区。各个三角烧瓶在37℃的恒温器中在需氧条件下缓慢搅拌培养。

试验开始后，在第0天、3天、7天实施DB9011株、NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株的生菌数以及孢子数测定。上述株的生菌数测定方法是，用灭菌生理盐水将采取的培养液阶段稀释10倍之后，将各个稀释阶段液的0.1ml涂布在标准琼脂培养基(日水制药(株)制造)之后，进行37℃、48小时的需氧培养，计数已发育的特征性的菌落。上述株的孢子数测定方法如下。首先，用灭菌生理盐水将采取的培养液阶段稀释10倍，进行70℃下的30分钟加热处理。冷却后，用灭菌生理盐水阶段稀释10倍之后，将各个稀释阶段液的0.1ml涂布在标准琼脂培养基(日水制药(株)制造)之后，进行37℃、48小时的需氧培养，计数已发育的特征性的菌落。

将DB9011株的生菌数在表7、孢子数在表8表示。

[表7]

表7

[表8]

表8

将NBRC3009株的生菌数在表9、孢子数在表10表示。

[表9]

表9

[表10]

表10

将NBRC3025株的生菌数在表11、孢子数在表12表示。

[表11]

表11

[表12]

表12

将NBRC3108株的生菌数在表13、孢子数在表14表示。

[表13]

表13

[表14]

表14

将NBRC3336株的生菌数在表15、孢子数在表16表示。

[表15]

表15

[表16]

表16

如试验例9～18所示，酱油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的固体培养物没有显示出对枯草杆菌DB9011株、NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株的抗菌活性。

对嗜酸乳杆菌(LA)，用Anaeropack kenki(三菱瓦斯化学(株)制造)在加BCP的平板计数琼脂(日水制药(株)制造)中37℃下进行72小时的厌氧培养。挑取平板上发育的菌落，使之悬浮在灭菌生理盐水中。在1L容量的三角烧瓶中制作500ml GAM肉汤(日水制药(株)制造)，高压灭菌器杀菌之后，无菌性地投入至LA的最终浓度成为约1.0×10³～1.0×10⁴CFU/ml。将每个酱油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的粉碎固体培养物各5g无菌性地投入到三角烧瓶中，作为试验例19及20，将未加曲菌培养物的三角烧瓶作为对照区。各个三角烧瓶在37℃的恒温器中用Anaeropack kenki在厌氧条件下缓慢搅拌培养。

对短双歧杆菌(BB)，用Anaeropack kenki(三菱瓦斯化学(株)制造)在BL琼脂培养基(日水制药(株)制造)中37℃下进行48小时的厌氧培养。挑取平板上发育的菌落，使之悬浮在灭菌生理盐水中。在1L容量的三角烧瓶中制作500ml GAM肉汤(日水制药(株)制造)，高压灭菌器杀菌之后，无菌性地投入至BB的最终浓度成为约1.0×10⁴～1.0×10⁵CFU/ml。将每种酱油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的粉碎固体培养物各5g无菌性地投入到三角烧瓶中，作为试验例21及22，将未加曲菌培养物的三角烧瓶作为对照区。各个三角烧瓶在37℃的恒温器中用Anaeropack kenki在厌氧条件下缓慢搅拌培养。

试验开始后，在第0天、3天、7天实施LA及BB的生菌数测定。LA的生菌数测定方法是，用灭菌生理盐水将采取的培养液阶段稀释10倍之后，将各个稀释阶段液的0.1ml涂布在加BCP的平板计数琼脂“日水”(日水制药(株)制造)之后，使用Anaeropack kenki进行37℃、72小时的厌氧培养，计数已发育的特征性的菌落。BB的生菌数测定是，用灭菌生理盐水将采取的培养液阶段稀释10倍之后，将各个稀释阶段液的0.1ml涂布在BL琼脂培养基(日水制药(株)制造)之后，使用Anaeropack kenki进行37℃、48小时的厌氧培养，计数已发育的特征性的菌落。

表17中表示LA的生菌数、在表18表示BB的生菌数。

[表17]

表17

[表18]

表18

如试验例19及20所示，酱油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的固体培养物没有显示出对LA的抗菌活性。

如试验例21及22所示，酱油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的固体培养物没有显示出对BB的抗菌活性。

从以上结果可知，酱油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株虽然对病原性细菌大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌显示出抗菌活性，但对可作为益生菌的枯草杆菌或理想的肠内细菌嗜酸乳杆菌以及短双歧杆菌没有显示出抗菌活性。因此，通过将酱油曲霉AOK210株及/或米曲霉IK-05074株与枯草杆菌进行组合，能够开发出如下新的动物用饲料添加剂，其能够在不使枯草杆菌丧失能力的情况下发挥功效，同时不给作为肠内细菌有用的嗜酸乳杆菌以及短双歧杆菌带来坏影响。

<3>曲霉属菌的培养物的杀原虫活性的测定

(1)防治柔嫩艾美耳球虫试验

收集自然感染柔嫩艾美耳球虫的鸡粪，在实体显微镜下分离卵囊，用生理盐水清洗。在直径9cm的培养皿中添加5ml生理盐水，投入已清洗的卵囊至约成为4000个/ml。在每个培养皿中投入AOK210株、AOK 43株、AOK N4586株或AOK B650株及IK-05074株的粉碎固体培养物各50mg，各自设定为试验例23～27。此外，将未加曲菌培养物的培养皿作为对照区。将各个培养皿在37℃中振荡(150rpm)。7天后，在实体显微镜下测定卵囊的个数、观察细胞壁的变形或溶解状态，算出卵囊的减少率以及溶解变性率。

结果在表19中显示。

[表19]

表19

1)第7天残留的卵囊中的比例

如试验例23～27所示，已知AOK210株、AOK 43株、AOK N4586株或AOK B650株及IK-05074株的固体培养物使柔嫩艾美耳球虫的卵囊数减少，显示卵囊溶解变性活性。尤其在AOK210株以及IK-05074株，通过处理柔嫩艾美耳球虫的卵囊，得到了极高的卵囊减少率及溶解变性率。

(2)防治邱氏艾美耳球虫试验

收集感染邱氏艾美耳球虫的牛腹泻粪便，在实体显微镜下分离卵囊，用生理盐水清洗。在直径9cm的培养皿中添加5ml生理盐水，投入已清洗的卵囊至约成为2000个/ml。在每个培养皿中各投入AOK210株、AOK 43株、AOK N4586株或AOK B650株及IK-05074株的粉碎固体培养物50mg，各自设定为试验例28～32。此外，将未加曲菌培养物的培养皿作为对照区。将各个培养皿在37℃中振荡(150rpm)。7天后，在实体显微镜下测定卵囊的个数、观察细胞壁的变形或溶解状态，算出卵囊的减少率以及溶解变性率。

结果在表20中显示。

[表20]

表20

1)第7天残留的卵囊中的比例

如试验例28～32所示，已知AOK210株、AOK 43株、AOK N4586株或AOK B650株及IK-05074株的固体培养物使邱氏艾美耳球虫的卵囊数减少，还显示很高的卵囊溶解变性活性。尤其在AOK210株以及IK-05074株，通过处理邱氏艾美耳球虫的卵囊，得到了极高的卵囊减少率及溶解变性率。

从以上推测，上述曲霉属菌对球虫的防治也有效。

<4>枯草杆菌的培养

使用下述所示组成的孢子形成培养基，分别在37℃下72小时液体培养枯草杆菌DB9011株、NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株。离心分离得到的培养液，收集菌体。将得到的菌体冷冻干燥之后粉碎，得到孢子粉末。DB9011株、NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株的孢子密度各自为1.01×10¹¹CFU/g、1.21×10¹¹CFU/g、1.15×10¹¹CFU/g、1.06×10¹¹CFU/g、1.09×10¹¹CFU/g。将得到的孢子粉末用灭菌水稀释至适当的浓度，并70℃下加热30分钟，依此仅杀灭营养细胞之后接种到普通琼脂培养基，计数所形成的菌落数，由此测定孢子密度。

还有，枯草杆菌DB9011株以FERM BP-3418保存在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。此外，NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株是被分别登记在独立行政法人产品评价技术基盘机构的生物遗传资源部门(NBRC)的株。

孢子形成培养基成分¹⁾

Difco营养肉汤 8.0g

KCl 1.0g

MgSO₄·7H₂O 0.25g

MnCl₂·4H₂O 0.002g

调节pH为7.0、总量1,000ml

高压灭菌器灭菌后，分别添加灭菌完的CaCl₂溶液以及FeSO₄溶液至成为5×10^-4M以及1×10^-6M

1)Schaeffer P.，J.Millet，J.P.Aubert，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，54，704～711(1965)

<5>饲养试验-1

(1)饲料添加剂的制造

将上述<1>中得到的酱油曲霉AOK210株的粉碎固体培养物、米曲霉IK-05047株的粉碎固体培养物、DB9011株以及NBRC3009株的孢子并分别用乳糖稀释来制作不同浓度的饲料添加剂(制造例1～4)。此外，将AOK210株或IK-05047株的培养物与、DB9011株或NBRC3009株的孢子分别组合并分别用乳糖稀释来制作不同浓度的饲料添加剂(制造例5～8)。每个饲料添加剂中的固体培养物以及枯草杆菌的添加量在表21显示。

[表21]

表21

(2)雏鸡饲养试验

在雏鸡饲料(SD Broiler前后期用、日本混合饲料(株)制造、未加抗菌性物质的饲料)中混合制造例1～8的饲料添加剂至相对于雏鸡饲料的总质量中为0.1质量％。将从Broiler种鸡(商品名：チヤンキ一)来源的种蛋孵化的雏鸡12只为一组，每组给上述饲料35天，进行成长试验。以不断给饲料、自由给水来饲养。此外，将仅混合0.1质量％的乳糖的饲料作为对照区，同样进行成长试验。35天后测定各组的雏鸡的体重，算出各组的平均值。

结果在表22表示。

[表22]

表22

给予含有15质量％以上的、酱油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株的培养物的制造例1(E～G)以及制造例2(E～G)的饲料添加剂的雏鸡与对照区的雏鸡相比，可见到显著的体重增加。给予含有1.5×10⁹CFU/g以上的枯草杆菌DB9011株或NBRC3009株的孢子的制造例3(E～G)以及制造例4(E～G)的饲料添加剂的雏鸡与对照区的雏鸡相比，可见到显著的体重增加。

另一方面，使动物摄取分别组合AOK210株或IK-05047株的培养物1.0质量％以上和DB9011株或NBRC3009株1.0×10⁸CFU/g以上的制造例5(B～G)、制造例6(B～G)、制造例7(B～G)及制造例8(B～G)时，可见到体重显著增加的效果。由此知道，通过将曲霉属菌的培养物和枯草杆菌组合，可以用比单独使用各自的有效成分时相比低的浓度促进雏鸡的体重增加。

(3)仔猪饲养试验

在仔猪饲料中混合制造例1～8的饲料添加剂至其相对于仔猪饲料的总质量(SD仔猪人工乳前后期用标准饲料、日本混合饲料(株)制造、未加抗菌性物质的饲料)中为0.1质量％。将3周龄的仔猪(商品名：大约克夏)8头为一组，每组以不断给饲料35天，自由给水来进行成长试验。此外，将仅混合0.1质量％的乳糖的饲料作为对照区，同样进行成长试验。35天后测定各组的仔猪的体重，算出各组的平均值。

结果在表23表示。

[表23]

表23

给予含有15质量％以上的、酱油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株的培养物的制造例1(E～G)以及制造例2(E～G)的饲料添加剂的仔猪与对照区的仔猪相比，可见到显著的体重增加。给予含有1.5×10⁸CFU/g以上的枯草杆菌DB9011株的制造例3(E～G)以及含有1.5×10⁸CFU/g以上的NBRC3009株的孢子的制造例4(E～G)的饲料添加剂的仔猪与对照区的仔猪相比，可见到显著的体重增加。

另一方面，使动物摄取分别组合AOK210株或IK-05047株的培养物1.0质量％以上和DB9011株或NBRC3009株的孢子1.0×10⁸CFU/g以上的制造例5(B～G)、制造例6(B～G)、制造例7(B～G)及制造例8(B～G)时，可见到体重显著增加的效果。由此知道，通过将曲霉属菌的培养物和枯草杆菌组合，可以用比单独使用各自的有效成分时相比低的浓度促进仔猪的体重增加。

<6>饲养试验-2

(1)饲料添加剂的制造

将上述<1>中的得到的AOK 210株或IK-05074株的培养物、与DB9011株或NBRC3009株的孢子组合并用乳糖稀释，制作了以不同的比例含有各成分的饲料添加剂(制造例9～12)。各个饲料添加剂中的固体培养物、枯草杆菌的添加量在表24表示。

[表24]

表24

(2)雏鸡饲养试验

在雏鸡饲料中混合制造例9～12的饲料添加剂至其相对于雏鸡饲料的总质量(SDBroiler前后期用、日本混合饲料(株)制造、未加抗菌性物质的饲料)中为0.1质量％。将从Broiler种鸡(商品名：チヤンキ一)来源的种蛋孵化的雏鸡12只为一组，每组给上述饲料35天，进行成长试验。以不断给饲料、自由给水来饲养。此外，将仅混合0.1质量％的乳糖的饲料作为对照区，同样进行成长试验。35天后测定各组的雏鸡的体重，算出各组的平均值。

结果在表25表示。

[表25]

表25

酱油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株的粉碎固体培养物与DB9011株或NBRC3009株的比例最适范围是4质量％：1×10⁸CFU/g～1质量％：4×10⁸CFU/g(制造例9(B～F)、制造例10(B～F))、制造例11(B～F)、制造例12(B～F))。由此知道，每1U显示耐酸性α-淀粉酶活性的饲料添加剂的枯草杆菌浓度最适范围是：0.5×10⁶～2.0×10⁷CFU/g。此外，每1U显示酸性蛋白酶及酸性羧基多肽酶的总和的饲料添加剂的枯草杆菌浓度最适范围是：4.5×10⁴～8.5×10⁵CFU/g。

(2)仔猪饲养试验

在仔猪饲料中混合制造例9～12的饲料添加剂至其相对于仔猪饲料总质量(SD仔猪人工乳前后期用标准饲料、日本混合饲料(株)制造、未加抗菌性物质的饲料)中为0.1质量％。将3周龄的仔猪(商品名：大约克夏)8头为一组，每组以不断给上述饲料35天，自由给水来进行成长试验。此外，将仅混合0.1质量％的乳糖的饲料作为对照区，同样进行成长试验。35天后测定各组的仔猪的体重，算出各组的平均值。

结果在表26显示。

[表26]

表26

酱油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株的粉碎固体培养物与DB9011株或NBRC3009株的比例最适范围是4质量％：1×10⁸CFU/g～1质量％：4×10⁸CFU/g(制造例9(B～F)、制造例10(B～F))、制造例11(B～F)、制造例12(B～F))。

<7>对雏鸡的病原菌攻击试验

(1)肠炎沙门氏菌攻击试验

在雏鸡饲料中混合制造例1～8的饲料添加剂至其相对于雏鸡饲料总质量(SD Broiler前后期用、日本混合饲料(株)制造、未加抗菌性物质的饲料)中为0.1质量％。将从Broiler种鸡(商品名：チヤンキ一)来源的种蛋孵化的雏鸡12只为一组，以不断给饲料35天、自由给水喂食14天。将仅混合0.1质量％的乳糖的饲料作为对照区，同样进行试验。7天大时，每只经口投与2.3×10⁷CFU的肠炎沙门氏菌(SE)。14天大时用棉棒擦拭盲肠内容物和总排泄腔来采取粪便。

盲肠内容物的SE生菌数根据以下方法测定，算出感染指数及防御指数。

向盲肠内容物1g加入灭菌磷酸缓冲生理盐水稀释为10倍，充分混合制作试样原液。接着，用灭菌生理盐水将试样原液阶段稀释为10倍，制作阶段稀释液。将试样原液及阶段稀释液分别在SS琼脂平板培养基“日水”(日水制药(株)制造)以及亮绿琼脂平板培养基(Difco Laboratories制造)中各涂抹0.1ml，37℃中培养24小时，测定各平板培养基上繁殖的典型的SE菌落数。再有，挑取菌落接种于赖氨酸脱碳酸试验用的SIM琼脂培养基“日水”(日水制药(株)制造)以及TSI琼脂培养基“日水”(日水制药(株)制造)，37℃中培养24小时，确认性状。

其中，在被认为是SE的菌落数乘以稀释液的稀释倍率来算出每1g盲肠内容物的SE生菌数。以该结果为基础，如下算出感染指数及防御指数。感染指数是指显示病原菌的感染率的高低的值，防御指数是指与投与了对照区的饲料的情况相比较时显示各个饲料防御病原菌感染的能力的值。

感染指数：各个体的盲肠内容物的SE生菌数的对数平均值(log CFU/g的平均值)

防御指数：对照区的感染指数/各试验区的感染指数

关于从总排泄腔采取的粪便，通过根据如下方法对各个体进行定性培养来确认SE的形状。即，将附着在棉棒上的粪便悬浊于10ml的灭菌磷酸缓冲生理盐水中，做成试样原液之后，将此在SS琼脂平板培养基以及亮绿琼脂平板培养基中各涂抹0.1ml，37℃中培养24小时，判定各平板培养基上有无繁殖的典型的SE菌落的形成。再有，挑取菌落接种于LIM琼脂培养基“日水”(日水制药(株)制造)、SIM琼脂培养基以及TSI琼脂培养基中，37℃中培养24小时来确认形状。

感染指数示于表27、防御指数示于表28、采取总排泄腔粪便的SE的检测个体数示于表29。

[表27]

表27

1)检测限以下

[表28]

表28

[表29]

表29

酱油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株的粉碎固体培养物在单独20质量％以上添加到饲料添加剂时，盲肠内容物的SE的菌体浓度变低，显示了较低的SE的感染指数(制造例1(F、G)、制造例2(F、G))。枯草杆菌DB9011株或NBRC3009株在单独2.0×10⁹CFU/g以上添加到饲料添加剂时，盲肠内容物的SE的菌体浓度变低，显示了较低的SE的感染指数(制造例3(F、G)、制造例4(F、G))。然而，在酱油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株、与枯草杆菌DB9011株或NBRC3009株的组合中，将AOK210株或IK-05047株的培养物以2.5质量％以上、将DB9011株或NBRC3009株以2.5×10⁸CFU/g以上添加到饲料添加剂时，得到的SE的防治效果的程度与将AOK210株或IK-05047株单独以20质量％以上添加到饲料添加剂时或将DB9011株或NBRC3009株单独以2.0×10⁹CFU/g以上添加到饲料添加剂时相同(制造例5(C～G)、制造例6(C～G)制造例7(C～G)、制造例8(C～G))。再有，在给予将AOK210株或IK-05047株以20质量％以上、将DB9011株或NBRC3009株以2.0×10⁹CFU/g以上组合而成的饲料添加剂时，完全可以防治SE(制造例5(G)、制造例6(G)、制造例7(G)、制造例8(G))。由此可知，通过将酱油曲霉或米曲霉、与枯草杆菌组合而喂食给雏鸡，具有以比各个有效成分单独使用的情况更低的浓度预防SE感染症的效果。

(2)产气荚膜梭菌攻击试验

使用上述制作的饲料添加剂，与上述同样处理来饲养雏鸡。7天大时向每只经口投与5.0×10⁷CFU的产气荚膜梭菌(CP)。14天大时用棉棒擦拭盲肠内容物和总排泄腔来采取粪便。

盲肠内容物的CP生菌数根据以下方法测定，算出感染指数及防御指数。

向盲肠内容物1g加入灭菌磷酸缓冲生理盐水稀释为10倍，充分混合制作试样原液。接着，用灭菌生理盐水将试样原液阶段稀释为10倍，制作阶段稀释液。将试样原液及阶段稀释液分别在测定梭菌纲(clostridia)用培养基(日水制药(株)制造)中各涂抹0.1ml，用Anaeropack kenki35℃中厌氧培养24小时，测定各平板培养基上繁殖的黑色菌落数。再有，挑取菌落接种于加蛋黄的CW琼脂培养基(日水制药(株)制造)，35℃中需氧以及厌氧培养24～48小时，确认形状。

其中，被认为是CP的菌落数乘以稀释液的稀释倍率来算出每1g盲肠内容物的CP生菌数。以该结果为基础，与上述同样地算出感染指数及防御指数。

关于从总排泄腔采取的粪便，通过根据以下方法对各个体进行定性培养来确认CP的形状。即，将附着在棉棒上的粪便悬浊于10ml的灭菌磷酸缓冲生理盐水中，作为试样原液之后，将此在测定梭菌纲用培养基(日水制药(株)制造)中各涂抹0.1ml，用Anaeropackkenki35℃中厌氧培养24小时，判定各平板培养基上有无繁殖的黑色菌落的形成。再有，挑取菌落接种于加蛋黄的CW琼脂培养基(日水制药(株)制造)，35℃中需氧以及厌氧培养24～48小时来确认性状。

感染指数示于表30、防御指数示于表31、采取总排泄腔粪便的CP的检测个体数示于表32。

[表30]

表30

1)检测限以下

[表31]

表31

[表32]

表32

酱油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株的粉碎固体培养物在单独20质量％以上添加到饲料添加剂时，盲肠内容物的CP的菌体浓度变低，显示了较低的CP的感染指数(制造例1(F、G)、制造例2(F、G))。枯草杆菌DB9011株或NBRC3009株在单独2.0×10⁹CFU/g以上添加到饲料添加剂时，盲肠内容物的CP的菌体浓度变低，显示了较低的CP的感染指数(制造例3(F、G)、制造例4(F、G))。然而，在酱油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株与枯草杆菌DB9011株或NBRC3009株的组合中，将AOK210株或IK-05047株以2.5质量％以上、将DB9011株或NBRC3009株以2.5×10⁸CFU/g以上添加到饲料添加剂时，得到的CP的防治效果的程度与将AOK210株或IK-05047株单独以20质量％以上添加到饲料添加剂时或将DB9011株或NBRC3009株单独以2.0×10⁹CFU/g以上添加到饲料添加剂时相同(制造例5(C～G)、制造例6(C～G)制造例7(C～G)、制造例8(C～G))。再有，在将AOK210株或IK-05047株以20质量％以上、将DB9011株或NBRC3009株以2.0×10⁹CFU/g以上添加于饲料添加剂时，完全可以防治CP(制造例5(G)、制造例6(F、G)、制造例7(G)、制造例8(G))。由此可知，通过将酱油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株与枯草杆菌DB9011株或NBRC3009株组合，具有比各个有效成分单独使用的情况更低的浓度预防CP感染症的效果。

<8>对仔猪的浮肿病菌攻击试验

在仔猪饲料中混合上述已制造的制造例1～8的饲料添加剂至其相对于仔猪饲料的总质量(SD仔猪人工乳前后期用标准饲料、日本混合饲料(株)制造、未加抗菌性物质的饲料)中为0.1质量％。将3周龄的仔猪(商品名：大约克夏种)8头为一组，每组以不断给饲料、自由给水来喂食14天。将仅混合0.1质量％的乳糖的饲料作为对照区，同样进行试验。将猪浮肿病菌大肠杆菌Escherichia coli(EC)在胰酶大豆肉汤(Difco Laboratories制造)中37℃下培养4小时。4℃下离心分离(3,000rpm，15分钟)将颗粒放入肠溶性胶囊中。4周龄时将4.5×10⁸CFU的EC用肠溶性胶囊向每头强制经口投与，1日1次，连续3天。将生理盐水替代浮肿病菌放入肠溶性胶囊中，同样强制经口投与，作为无接种例，同样进行试验。饲养至5周龄之后测定体重，算出各组的增加体重的平均值。此外，从强制经口投与开始至试验完结为止，每天进行粪便性状以及眼周围浮肿的临床观察，按每个个体算出试验期间中的粪便性状分数以及眼周围浮肿分数的合计，算出各组的分数的平均值。

试验期间中的增加体重示于表33、粪便性状分数示于表34、眼周围浮肿分数示于表35。

[表33]

表33

[表34]

表34

粪便正常分数：0.正常便、1.软便、2.泥状便、3.水溶性腹泻

[表35]

表35

眼周围浮肿分数：0.无、1.轻度、2.中度、3.重度

酱油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株的粉碎固体培养物单独通过以15质量％以上添加到饲料添加剂时，显示所增体重与无接种例相同程度的值(制造例1(E～G)、制造例2(E～G))。枯草杆菌DB9011株或NBRC3009株通过单独15×10⁸CFU/g以上添加到饲料添加剂，显示所增体重与无接种例相同程度的值(制造例3(E～G)、制造例4(E～G))。关于粪便性状分数、眼周围浮肿分数，也显示了相同的倾向。然而，在酱油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株与枯草杆菌DB9011株或NBRC3009株的组合中，通过将AOK210株或IK-05047株以2.5质量％以上、将DB9011株或NBRC3009株以2.5×10⁸CFU/g以上添加到饲料添加剂，显示所增体重与无接种例相同程度的值(制造例5(C～G)、制造例6(C～G)制造例7(C～G)、制造例8(C～G))。关于粪便性状分数、眼周围浮肿分数，也显示了相同的倾向。由此可知，通过将酱油曲霉或米曲霉与枯草杆菌组合，具有以比各个有效成分单独使用的情况相比更低的浓度预防浮肿病菌感染的效果。

<9>对仔牛的鼠伤寒沙门氏菌攻击试验

将出生后1周龄的公仔牛(Holstein种)4头为一组，将市售哺乳期仔牛用代用乳(プロミルク、日本混合饲料(株))早晚2次、每次各2L喂食至7周龄为止。自由给水、干草和市售人工乳(ス一パ一ほいくモ一レツト、全农)不断喂食。将上述中制造的制造例1～8的饲料添加剂混合代用乳每天每头投与25g。仅将25g乳糖混合于代用乳作为对照区，同样进行试验。2周龄时每头经口投与悬浮在10％NaHCO₃ 50ml的5.0×10⁶CFU的鼠伤寒沙门氏菌(ST)。饲养至7周龄，测定体重，算出各组的增加体重的平均值。此外，从强制经口投与开始至试验完结为止，每天进行粪便性状的观察，按每个个体算出试验期间中的粪便性状分数的合计，算出各组的分数的平均值。

试验期间中的增加体重示于表36、粪便性状分数示于表37。

[表36]

表36

[表37]

表37

粪便正常分数：0.正常便、1.软便、2.泥状便、3.粘液～水溶便、4.血便

通过将酱油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株的粉碎固体培养物单独以20质量％以上添加到饲料添加剂中，显示所增体重与无接种例相同程度的值(制造例1(F、G)、制造例2(F、G))。枯草杆菌DB9011株或NBRC3009株通过单独2.0×10⁹CFU/g以上添加到饲料添加剂，显示所增体重与无接种例相同程度的值(制造例3(F、G)、制造例4(F、G))。关于粪便性状分数，也显示了相同的倾向。然而，在酱油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株与枯草杆菌DB9011株或NBRC3009株的组合中，通过将AOK210株或IK-05047株以2.5质量％以上、将DB9011株或NBRC3009株以2.5×10⁸CFU/g以上添加到饲料添加剂，显示所增体重与无接种例相同程度的值(制造例5(C～G)、制造例6(C～G)制造例7(C～G)、制造例8(C～G))。关于粪便性状分数，也显示了相同的倾向。由此可知，通过将酱油曲霉或米曲霉与枯草杆菌组合，具有以比各个有效成分单独使用的情况相比更低的浓度预防ST感染的效果。

产业上的利用可能性

将本发明的包含曲霉属菌和该菌所产生的酸性酶的培养物、以及枯草杆菌的动物用饲料添加剂与饲料混合而使动物摄取，促进营养吸收、饲料效率上升。具体地，曲霉属菌产生的酸性酶显示对肠内的病原菌等的抗菌活性，枯草杆菌活化免疫，结果预防·改善动物的肠内感染症，有助于动物的体重增加。本发明的饲料可以适用于鸡、猪、牛等的家畜的饲养。

Claims

1.一种动物用饲料添加剂，含有：选自酱油曲霉(Aspergillus sojae)、溜曲霉(Aspergillustamarii)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、黑曲霉(Aspergillus niger)及米曲霉(Aspergillusoryzae)的至少一种的曲霉属菌、含有这些菌所产生的酸性酶的培养物以及枯草杆菌(Bacillus subtilis)，每1g饲料添加剂的酸性酶活性的总和为120U以上，枯草杆菌的浓度为2.5×1⁰7～2×10⁹CFU/g。

2.如权利要求1记载的动物用饲料添加剂，其特征在于，所述酸性酶含有酸性淀粉酶，每1g饲料添加剂的酸性淀粉酶活性为1U以上。

3.如权利要求1或2记载的动物用饲料添加剂，其特征在于，所述曲霉属菌具有对引起动物肠内感染症的病原菌的抗菌活性及/或对于球虫的杀原虫活性。

4.如权利要求1～3的任一项记载的动物用饲料添加剂，所述曲霉属菌是酱油曲霉及/或米曲霉。

5.如权利要求1～4的任一项记载的动物用饲料添加剂，其特征在于，米曲霉是IK-05074株(FERM BP-10622)及/或它们的变异株，是具有与所述菌株相同的酸性酶产生能力的菌株。

6.如权利要求1～5的任一项记载的动物用饲料添加剂，所述培养物含有植物性营养源。

7.如权利要求6所记载的动物用饲料添加剂，所述植物性营养源是糙米。

8.如权利要求1～7的任一项记载的动物用饲料添加剂，其特征在于，枯草杆菌是DB9011株(FERM BP-3418)及/或它们的变异株。

9.如权利要求1～8的任一项记载的动物用饲料添加剂，其特征在于，用于促进成长。

10.如权利要求1～8的任一项记载的动物用饲料添加剂，其特征在于，用于肠内感染症的预防·改善。

11.一种饲料，含有0.01～1.0质量％的权利要求1～10的任一项记载的动物用饲料添加剂。

12.一种饲料的制造方法，其特征在于，包括以下工序，在含有用于曲霉属菌的增殖的营养源的固体培养基中培养选自酱油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉及米曲霉的至少一种曲霉属菌而得到培养物，含有该得到的培养物至每kg饲料的酸性酶活性的总和在12U以上的工序、和含有枯草杆菌至浓度为2.5×10⁶～2.0×10¹⁰CFU/kg的工序。

13.一种动物的饲养方法，其特征在于，使动物摄取权利要求11所记载的饲料。