CN107603901A - 一种产黄曲霉素b1降解酶的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌株。本发明所提供的产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HDR‑02，它在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M2016298，其16S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。实验证明，本发明所提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HDR‑02对黄曲霉毒素B1脱毒能力强，作用效果温和，不会破坏饲料中的营养成分，对饲料的感官品质没有影响；同时，枯草芽孢杆菌HDR‑02繁殖速度快、环境耐受力强，能促进动物的健康生长、提高动物的生产性能，适用于畜牧业生产中。

Description

一种产黄曲霉素B1降解酶的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及黄曲霉毒素技术领域，具体涉及一种产黄曲霉素B1降解酶的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物，黄曲霉毒素是迄今发现的污染农产品毒性最强的一类生物毒素。其中，毒性最强、危害最大的为黄曲霉毒素B1，其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍，被列入严管的特剧毒物质，0.294毫克/公斤剂量的黄曲霉毒素B1，就能引起敏感动物的急性中毒死亡。黄曲霉毒素也是一种强致癌物，黄曲霉毒素B1的致癌能力，是二甲基硝胺的70倍。据在我国肝癌高发区的调查发现，肝癌的高发与吃了被黄曲霉毒素污染的粮食有关。

黄曲霉毒素B1污染范围广且具有很强的毒性作用，严重危害到人类和动物健康，采取有效的脱毒措施成为亟须解决的问题，饲料原料从田间生长到收获、贮存、运输及加工处理等各个环节中，由于生产管理或者环境条件不当，都有可能会被霉菌或者霉菌毒素污染，动物饲料中玉米、花生饼、棉籽饼、豆粕等黄曲霉毒素的含量常常超过国家《饲料卫生标准》的最高限量。传统的物理、化学脱毒方法均存在破坏饲料的营养成分，影响饲料的品质等缺陷。生物法为黄曲霉毒素B1的脱毒提供新的发展方向，但筛选出的微生物及代谢产物安全性存在质疑，会给动物机体造成额外的损伤，难以在实际生产中广泛应用。因此利用益生菌及其制剂来脱除饲料中的AFB1具有广泛的应用前景，是未来研究的热点。

发明内容

为了克服现有技术的上述不足，本发明提供了一种产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌，以及该菌株在黄曲霉毒素B1脱毒中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种产黄曲霉B1降解酶的枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌在2016年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武汉大学内)，其提议的分类命名为枯草芽孢杆菌HDR-02，保藏编号为CCTCCNO：M2016298。

进一步地，所述的产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌的16S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述的产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌在黄曲霉毒素B1脱毒中的应用也属于本发明的保护范围。体外试验表明枯草芽孢杆菌HDR-02对黄曲霉毒素B1有很好的脱毒能力，脱毒24小时，可脱除75.7％的黄曲霉毒素B1。

进一步地，所述产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌是应用于动物体内黄曲霉毒素B1脱毒。

进一步地，所述动物包括鸭、鸡、猪、反刍动物以及毛皮动物。

一种用于动物体内黄曲霉毒素B1脱毒的菌剂，它的活性成份为所述的产黄曲霉B1降解酶的枯草芽孢杆菌HDR-02。以所述的产黄曲霉B1降解酶的枯草芽孢杆菌HDR-02为活性成份的动物体内黄曲霉毒素B1脱毒菌剂，可作为饲料添加剂添加到养殖动物的饮水或饲料中，在进入动物肠道后，枯草芽孢杆菌HDR-02迅速活化、增殖并且同时在肠道微生态环境中形成有益优势菌群，能促进动物生长，降低黄曲霉毒素B1对动物的毒性，缓解黄曲霉毒素B1对动物肝脏的损伤。

本发明的有益效果：(1)本发明所述的枯草芽孢杆菌HDR-02对黄曲霉毒素B1脱毒能力强，作用效果温和，不会破坏饲料中的营养成分，对饲料的感官品质没有影响；(2)本发明所述的枯草芽孢杆菌HDR-02繁殖速度快、环境耐受力强，能促进动物的健康生长、提高动物的生产性能，适用于畜牧业生产中。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌HDR-02的生长曲线图；

图2为枯草芽孢杆菌HDR-02以及黄曲霉毒素B1对雏鸭肝脏组织结构的影响示意图。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。

实施例1：枯草芽孢杆菌HDR-02采集、分离和初筛

1、菌株的采集、分离

样品取自90日龄健康肉鸡鸡粪和霉变谷物。样品采集后，放入装有3mL无菌水的7mL EP管中，于80℃水浴10min后LB活化培养基中划线培养，37℃、24h培养后，选取白色而有光泽、表面湿润、平坦、边缘整齐、1mm左右大小的菌落，挑取疑似菌落做纯培养。

纯培养的菌落经菌落形态的观察、革兰氏染色进行筛选，细菌呈长杆状，单个、成对或链状排列的革兰氏阳性杆菌均传代保存。

2、菌株的初筛

将分离菌株接于混有香豆素溶液的改良初筛培养基中，保证香豆素成为唯一碳源和能源，将其置于37℃培养箱中培养一周，观察菌株的生长情况。为避免细菌在原环境中的碳源干扰，挑取有生长现象的菌株，连续三次以同样方法进行培养，最后保存那些能在以香豆素为唯一碳源的培养基上生长的菌株。

其中，10％香豆素溶液：1g香豆素溶于10mL无菌水单独配成溶液，过滤灭菌。香豆素不溶于水，采用微热方式使其在水中融化，并迅速用0.22μm无菌过滤器过滤。

固体初筛培养基：(NH₄)₂SO₄2.0g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄·H₂O 0.2g，CaCl₂0.1g，琼脂15g，蒸馏水990mL，pH＝7.0，121℃灭菌15min，稍冷后加入10mL10％香豆素溶液并混匀。

3、黄曲霉毒素B₁纯品脱毒复筛：

分别取初筛分离菌株的发酵液950μL，各加入50μL的AFB₁标准工作液(1ppm)，在37℃、200r/min条件下反应24小时，以等量的LB液体培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，用蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌15min)。加等量的黄曲霉毒素B₁标准工作液为对照，采用黄曲霉毒素B₁酶联免疫定量测试盒对其进行毒素测定及脱毒率的分析。

结论：通过黄曲霉毒素B1酶联免疫定量测试盒对脱毒率的分析，反应24小时后对黄曲霉毒素B1脱毒率最高的三种菌株初步命名为HDR-02、HDR-21、HDR-30，脱毒率分别为75.7％、65.7％和41.4％。

4、生物学特性的复筛

1)生长曲线的测定：挑取上述HDR-02、HDR-21、HDR-30菌株发酵，将菌株HDR-02、HDR-21、HDR-30发酵液以1％的接种量接种到5mL的LB液体培养基中，分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h时将培养液取出，将培养液10倍梯度稀释后用倾注法测菌株的生长曲线，每组试验做三个重复。以培养时间为横坐标，log(CFU/mL)值为纵坐标，绘制菌株的生长曲线(见图1)。

结论：HDR-02、HDR-21、HDR-30中HDR-02的适应期最短、繁殖速度最快，可在2小时内进入对数期。

2)高温耐受性测定：取步骤1)中挑选保存好的HDR-02芽孢悬液注入到离心管中，采用10倍梯度稀释，用倾注法测剩余活菌数。再将装有剩余芽孢悬液的离心管分别置于75℃、80℃、85℃、90℃水浴锅中热处理5min，取热处理后的菌液进行逐级10倍梯度稀释，用倾注法测剩余活菌数。以等量的芽孢悬液加等量的生理盐水为对照，每组试验做三个重复，HDR-02芽孢高温耐受性结果见表1。

表1枯草芽孢杆菌HDR-02芽孢高温耐受性

处理温度	75℃	80℃	85℃	90℃
					存活率	97.9±4.8％	96.6±3.9％	95.8±1.8％	61.5±2.6％

3)模拟胃液耐受性测定：取0.5mL的HDR-02芽孢悬液加入到4.5mL的模拟胃液中(pH值为2.0)，并迅速在振荡器上充分混和，然后置于37℃培养箱静置培养。分别在0h、2h和4h的时候取出培养液并立即进行逐级10倍梯度稀释，用倾注法测剩余活菌数。以等量的芽孢悬液加等量的生理盐水为对照，每组试验做三个重复，枯草芽孢杆菌HDR-02芽孢高温耐受性结果见表2。

表2枯草芽孢杆菌HDR-02芽孢模拟胃液耐受性

处理时间	2小时	4小时
			存活率	98.1±1.9％	94.5±5.9％

4)模拟胆盐耐受性测定：取0.5mL的HDR-02芽孢悬液加入到4.5mL的0.3％模拟胆盐中(pH值为8.0)，并迅速在振荡器上充分混和，然后置于37℃培养箱静置培养。分别在0h、24h的时候取出培养液并立即进行逐级10倍梯度稀释，用倾注法测剩余活菌数。以等量的芽孢悬液加等量的生理盐水为对照，每组试验做三个重复。HDR-02芽孢在模拟胆盐中反应24小时后有92.4±5.4％的存活率。

结论：试验表明，菌株HDR-02具有较强的黄曲霉毒素B₁脱毒能力，脱毒率达到75.7％，同时还具有繁殖速度快、耐受力强的优点。

实施案例2：HDR-02菌株的鉴定

1、形态学鉴定及理化特征鉴定

上述HDR-02菌株的细胞形态和理化特征见表3。

表3 HDR-02菌株的细胞形态和理化特征

鉴定指标	结果	鉴定指标	结果
				菌落颜色	白色或微黄	葡萄糖产酸	+
革兰氏染色	阳性	木糖产酸	+
				细胞形态	杆状	阿拉伯糖产酸	+
芽孢	+	甘露醇产酸	+
				接触酶	+	利用丙酸盐	—
水解明胶	+	硝酸盐还原	+
				形成吲哚	—	水解淀粉	+
厌氧生长	—	7％氯化钠生长	+

2、分子鉴定

通过菌株16SrRNA序列对菌株HDR-02进行种属鉴定。芽孢杆菌16SrRNA基因组PCR扩增所用引物为F1和R1(序列如下)。PCR扩增反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃最后延伸10min。扩增后，产物送至上海生工生物工程有限公司测序，菌株HDR-02的16S rRNA测序结果如SEQ ID No.1所示。

F1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

R1：5’-AAGGAGGTGATCCACCC-3’

HDR-02的16SrRNA序列在NCBI进行Blastn比较，检索发现，HDR-02与Genebank中枯草芽孢杆菌序列同源性较高，相似性为99％(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，证明菌株HDR-02为枯草芽孢杆菌，正式命名为枯草芽孢杆菌HDR-02。

通过以上鉴定结果，确定实施例1所得的菌株HDR-02为产黄曲霉B1降解酶的枯草芽孢杆菌，并于2016年5月31日送交湖北省武汉市武汉大学内中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为：CCTCC NO：M2016298。

实施案例3：枯草芽孢杆菌HDR-02在雏鸭体内的应用

1日龄樱桃谷肉鸭，基础日粮预饲3天后，随机选取健康、体重相近的雏鸭，随机分为4个组，每组4个重复，每个重复5只雏鸭。具体分组如下：空白对照组、枯草芽孢杆菌HDR-02组、黄曲霉毒素B₁攻毒组、黄曲霉毒素B₁攻毒+枯草芽孢杆菌HDR-02组。其中黄曲霉毒素B1攻毒量为0.1mg/kg·BW，枯草芽孢杆菌HDR-02加菌量为每天10⁸CFU/mL，枯草芽孢杆菌HDR-02以灌胃方式加入，连续灌胃1周。

试验结果：灌服HDR-02能显著提高未攻毒组雏鸭的平均日增重，黄曲霉毒素B₁攻毒使雏鸭平均日增重显著降低，甚至引起雏鸭死亡；灌服HDR-02菌悬液能缓解黄曲霉毒素B₁中毒的影响(见表4)。灌服HDR-02不损伤雏鸭的肝脏，黄曲霉毒素B₁攻毒组雏鸭肝脏损伤严重，而HDR-02的添加可以显著缓解黄曲霉毒素B₁对雏鸭肝脏的损伤(见表5和图2)。

表4枯草芽孢杆菌HDR-02和黄曲霉毒素B₁对雏鸭平均日增重的影响

表5枯草芽孢杆菌HDR-02和黄曲霉毒素B₁对雏鸭血清生化指标的影响

组别	ALT(U/L)	AST(U/L)	ALB/GLO
				空白组	37.72±2.69a	34.16±13.5a	0.420±0.12
益生菌组	36.36±11.8	20.28±9.36	0.587±0.50
				益生菌+攻毒组	61.42±12.4a	58.76±21.2a	0.298±0.17
攻毒组	95.72±6.65b	117.9±47.2b	0.235±0.15

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种产黄曲霉素B1降解酶的枯草芽孢杆菌及其应用

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1598

<212> DNA

<213> HDR-02

<400> 1

cttgcttacg aatacgagct cggtacccta gggacctcta gagattggtt accttgttac 60

gacttcaccc caatcatctg tcccaccttc ggcggctggc tcctaaaagg ttacctcacc 120

gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg 180

tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta ctagcgattc cagcttcacg cagtcgagtt 240

gcagactgcg atccgaactg agaacagatt tgtgggattg gcttaacctc gcggtttcgc 300

tgccctttgt tctgtccatt gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat 360

ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag tcaccttaga gtgcccaact 420

gaatgctggc aactaagatc aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac 480

gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc tgtcactctg cccccgaagg ggacgtccta 540

tctccaggat tgtcagagga tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta 600

aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg 660

accgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgca gcactaaggg gcggaaaccc 720

cctaacactt agcactcatc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc 780

tccccacgct ttcgctcctc agcgtcagtt acagaccaga gagtcgcctt cgccactggt 840

gttcctccac atctctacgc atttcaccgc tacacgtgga attccactct cctcttctgc 900

actcaagttc cccagtttcc aatgaccctc cccggttgag ccgggggctt tcacatcaga 960

cttaagaaac cgcctgcgag ccctttacgc ccaataattc cggacaacgc ttgccaccta 1020

cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt tctggttagg taccgtcaag 1080

gtgccgccct atttgaacgg cacttgttct tccctaacaa cagagcttta cgatccgaaa 1140

accttcatca ctcacgcggc gttgctccgt cagactttcg tccattgcgg aagattccct 1200

actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggcc gatcaccctc 1260

tcaggtcggc tacgcatcgt cgccttggtg agccgttacc tcaccaacta gctaatgcgc 1320

cgcgggtcca tctgtaagtg gtagcggaag ccacctttta tgtctgaatc atgcggttca 1380

aacaaccatc cggtattagc cccggtttcc cggagttatc ccagtcttac aggcaggtta 1440

cccacgtgtt actcacccgt ccgccgctaa catcagggag caagctccca tctgtccgct 1500

cgacttgcat gtattaggca cgccgccagc gttcgtcctg agccaggatc aactctaatc 1560

gtcgacctgc aggcatgcaa gctggcacga ccgtcgtg 1598

Claims (6)

1.一种产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于：该枯草芽孢杆菌在2016年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其提议的分类命名为枯草芽孢杆菌HDR-02，保藏编号为CCTCC NO：M2016298。

2.根据权利要求1所述的一种产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌的16SrRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.一种产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌应用于黄曲霉毒素B1脱毒。

4.根据权利要求3所述的一种产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌是应用于动物体内黄曲霉毒素B1脱毒。

5.根据权利要求4所述的一种产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述动物包括鸭、鸡、猪、反刍动物以及毛皮动物。

6.一种用于动物体内黄曲霉毒素B1脱毒的菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成份为权利要求1所述的产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌。