CN116694512A - 一株可用于饲料黄曲霉毒素B1净化的耐高温枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60及其应用 - Google Patents
一株可用于饲料黄曲霉毒素B1净化的耐高温枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一株可用于饲料黄曲霉毒素B1净化的耐高温枯草芽胞杆菌NHB‑Bs1‑60及其应用，属于微生物技术领域。枯草芽胞杆菌NHB‑Bs1‑60的分类命名为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)NHB‑Bs1‑60，于2023年02月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO.26517，保藏地址为中国北京。本发明所提供的枯草芽胞杆菌NHB‑Bs1‑60能够高效抑制黄曲霉菌，黑曲霉菌和寄生曲霉菌，并且可以高效降解黄曲霉毒素B1的枯草芽胞杆菌NHB‑Bs1‑60，其12h的降解率即可达到97.32。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株可用于饲料黄曲霉毒素B1净化的耐高温枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60及其应用。
背景技术
饲料和饲料原料在高温高湿的环境下极易收到不同霉菌毒素的污染，这其中黄曲霉毒素B1是饲料中十分普遍的一种污染物。黄曲霉毒素B1是一种强致癌物，饲料中所含有的黄曲霉毒素B1会导致动物的免疫功能丧失，并且会导致动物的生长和繁殖障碍，降低动物的生产性能、孵化率以及产蛋率等。目前，黄曲霉毒素B1的主要脱毒方法是生物脱毒法，生物脱毒法具有处理条件相对温和，不破坏饲料中其他营养成分的优点。
发明专利申请号201710077742.8，用于降解黄曲霉毒素B1的枯草芽孢杆菌及其应用提供了一种降解黄曲霉毒素B1的枯草芽孢杆菌S1(CCTCCNO:M 2016390)。该菌株发酵液对AFB1的降解率达61.36％；以10％接种量培养后，降解率可达80.26％；发酵上清液浓缩8倍后，降解率达85.65％。但是，该菌株的降解率仍然较低且主要用于37℃的常规温度，无法面对极端环境。
发明内容
本发明的目的在于提供一株可用于饲料黄曲霉毒素B1净化的耐高温枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60及其应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一株可用于饲料黄曲霉毒素B1净化的耐高温枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60，分类命名为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)NHB-Bs1-60，于2023年02月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.26517，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
优选地，所述枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60的16S rDNA如SEQ ID NO.1所示。
其次，本发明提供了一种用于降解饲料中黄曲霉毒素B1的发酵菌剂，所述发酵菌剂为如权利要求1所述的枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60的发酵菌剂。
优选地，所述发酵菌剂中枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60的活菌数为4.5×1010CFU/mL。
其次，本发明提供了枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60在制备降解饲料中黄曲霉毒素B1的发酵菌剂中的应用。
优选地，所述发酵菌剂中枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60的活菌数为4.5×1010CFU/mL。
其次，本发明提供了枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60在制备病原菌抑制剂中的应用，所述病原菌为黄曲霉菌，黑曲霉菌和寄生曲霉菌。
优选地，所述抑制剂中枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60的活菌数为4.5×1010CFU/mL。
此外，本发明提供了枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60在制备耐高温的饲料发酵液中的应用。
优选地，所述高温为70-100℃。
本发明的有益效果在于：
本发明筛选出一株能够高效抑制黄曲霉菌，黑曲霉菌和寄生曲霉菌，并且可以高效降解黄曲霉毒素B1的枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60，其12h的降解率即可达到97.32。
同时，本发明所提供的枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60可以耐受高温，并且在高温下依然可以发挥优异黄曲霉毒素B1降解效果。
附图说明
图1是菌株Bs1-34、Bs1-56和Bs1-60对黄曲霉、黑曲霉的抑制效果；
图2是枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60在MRS培养基上的菌落形态图；
图3是枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60菌株的革兰氏染色图；
图4是枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60净化黄曲霉毒素B1前后的高效液相色谱对比图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1
枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60分离、筛选及鉴定
1.芽胞杆菌的分离纯化
取已粉碎的发霉饲料原料样品25g，置于盛有225mL灭菌生理盐水的三角瓶中，于37℃下恒温震荡1h后，于80℃水浴锅中水浴10分钟，然后采用10倍倍比稀释的方法依次稀释至10万倍，选择1000倍、1万倍和10万倍三个稀释度，吸取0.1mL涂布于营养琼脂平板上，平板涂布后37℃倒置培养24h，用接种环挑取疑似芽胞杆菌的菌落在营养琼脂平板上进行划线分离培养，经24h培养后，挑取分离效果较好的菌落，用接种环转接于营养琼脂斜面上作纯培养，重复传代纯培养3次，样品中分离获得1132株芽胞杆菌，而后将菌种细胞悬浮于20％甘油溶液中，于-80℃冰箱保存备用。
2.菌体形态观察
将步骤1保存的甘油管菌种，经营养琼脂平板2-3次活化，然后接种于营养肉汤培养基中，37℃恒温180r/min震荡培养18～20h，取干净的载玻片进行革兰氏染色，镜检，观察菌株显微形态，选取革兰氏染色为阳性的产芽胞杆菌作为备用。
3.降解黄曲霉毒素B1芽胞杆菌筛选
(1)取5mL步骤2制备的菌液于10mL离心管中，然后8000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀即为菌体细胞；
(2)向菌体细胞中入1mL无机氮盐溶液，用移液枪反复吹打，使菌体重悬，然后8000r/min离心5min，弃去上清液，然后无机氮盐溶液重悬沉淀，反复洗涤2次，洗掉菌体中残留培养基；
(3)将洗涤完成后的菌体细胞，加入1mL无机氮盐溶液重悬获得菌悬液；
(4)以黄曲霉毒素B1为唯一碳源采用96孔板法筛选可在黄曲霉毒素B1为唯一碳源生长的芽胞杆菌，吸取150uL无机氮盐溶液加入96孔板中，加入50uL黄曲霉毒素B1溶液，按照2％的接种量将菌悬液接种于含有毒素的微孔中，37℃培养24h，以此方法筛选出连续传代三次能生长的芽胞杆菌；
(5)将可以利用黄曲霉毒素B1的菌株接种于含黄曲霉毒素B1100ppb(0.1ug/ml)的营养肉汤培养基中，37℃，180rpm培养48h，测定培养液中毒素含量，计算黄曲霉毒素降解率；
(6)降解率大于40％的菌株有73株，依次编号为Bs1-1～Bs1-73，其中降解率大于80％的菌株有9株，分别为Bs1-3、Bs1-22、Bs1-34、Bs1-48、Bs1-53、Bs1-56、Bs1-58、Bs1-60、Bs1-68。
4.抑菌性芽胞杆菌筛选
(1)取致病菌(黄曲霉、黑曲霉)浓度为106CFU/mL的孢子悬液2mL，加入装有200mL灭菌后冷至45℃左右的PDA培养基中，然后吸取10mL未凝固的带菌培养基，转入倒有10mL底层平板的营养琼脂平板上，制备成致病菌平板若干个；
(2)在超净工作台上每个病原菌PDA平板用无菌镊子夹取1个灭菌牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管中可加入200μL液体，管的两端要光滑)放在平皿上，使其与培养基接触无空隙，待数分钟后，分别吸取200μL疑似芽胞杆菌菌株发酵液于牛津杯中，于30℃下恒温培养2～3天；
(3)每个菌株至少做3个重复，观察并测量抑菌圈大小，其中抑菌圈大的菌株有3株，并分别为Bs1-34、Bs1-56、Bs1-60；
(4)选择黄曲霉毒素B1降解率和抑菌圈最大的菌株Bs1-60进行下一步研究。
5.菌株属的鉴定
对菌株Bs1-60进行生理生化鉴定，氧化酶、接触酶、明胶液化试验、吲哚试验和淀粉水解均为阳性，表明Bs1-60菌株为芽胞杆菌属。
表1菌株Bs1-60部分生理生化特性
| 鉴定项目 | Bs1-60 | 鉴定项目 | Bs1-60 |
| 革兰氏染色 | + | 65℃生长 | + |
| 葡萄糖 | + | 肌醇 | – |
| 山梨醇 | + | 半乳糖 | – |
| 尿素酶 | – | 耐6.5％NaCl | + |
| D-木糖 | – | 甲基红(MR) | – |
| L-阿拉伯糖 | + | V-P | + |
| 麦芽糖 | + | 丙二酸盐 | – |
| 鼠李糖 | – | 甘露醇 | + |
| 西蒙氏枸橼酸盐 | + | 过氧化氢酶 | + |
| 明胶液化 | + | 氧化酶 | + |
| 淀粉水解 | + | 吲哚 | + |
注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。
6.16S rDNA测序测定
采用细菌DNA提取的试剂盒提取Bs1-60菌株基因组DNA。通过引物F和R对Bs1-60菌株的16S rDNA基因片段进行测序，所得序列如SEQ ID NO.1所示，将所测得的序列与GenBank中的16S rDNA序列进行BLAST分析比对，可以看出菌株Bs1-60与枯草芽胞杆菌(NC_000964.3)的同源性达到99.93％。通过菌株Bs1-60的形态特征、生理生化特征、16S rDNA特征，确定菌株Bs1-60为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，并正式标号为NHB-Bs1-60。
7.菌株保藏
上述经分离、纯化、筛选得到的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)NHB-Bs1-60已于2023年02月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.26517，分类命名为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。
其中，营养琼脂培养基组成为：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，琼脂2％，NaCl0.5％，余量为水，pH 7.2±0.2。
营养肉汤培养基组成为：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，NaCl 0.5％，余量为水，pH 7.2±0.2。
无机氮溶液组成为：硫酸铵0.2％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钠0.05％，氯化钙0.01％，磷酸氢二钾0.05％，余量为水。
黄曲霉毒素B1溶液组成为：黄曲霉毒素B1 0.001％，余量为二甲基亚砜。
PDA培养基组成为：马铃薯浸粉0.5％，葡萄糖2％，琼脂粉2％，氯霉素0.01％，余量为水。
实施例2：枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60发酵液的制备
(1)取枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60(保藏编号为CGMCC NO.26517)种子液(活菌浓度为109CFU/mL)1mL，接种于70mL摇瓶发酵培养基中进行摇瓶发酵培养；
(2)摇瓶发酵结束后进行发酵罐一级种子培养，取70mL摇瓶发酵种子液接种到10L发酵罐中装液量为7L的一级种子培养基中发酵培养；
(3)一级种子培养结束后将10L发酵罐中的一级种子液全部转种至100L发酵罐中的发酵培养基中进行发酵培养，100L发酵罐装液量为70L发酵培养培养基；
(4)发酵结束后，检测发酵液活菌数为4.5×1010CFU/mL，芽胞率达到98％，发酵液于4℃保存在冰箱内备用。
其中，摇瓶发酵培养基和一级种子培养组分相同，由下述组分组成：麦芽浸粉0.5％，豆粕提取物1％，蔗糖0.5％，酵母浸粉1％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.4％，氯化钠0.2％，余量为水。
摇瓶发酵条件为：接种量1％(体积比)，发酵温度为37℃、pH7.0、180r/min，发酵时间8h。
一级种子发酵条件为：控制罐压0.03-0.05MPa，接种量为70mL，发酵温度为37℃，发酵时间12h，pH值7.0，搅拌转速200r/min，通气量10L/min。
100L发酵罐的培养基成分为：麦芽浸粉1.5％，豆粕提取物1％，酵母粉1％，硫酸铵1％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.1％，氯化钠0.5％，碳酸钙0.1％，余量为水。
所述100L发酵罐发酵条件为：pH6.0-8.0，装液量为70L培养基，控制罐压0.03-0.05MPa，接种量为7L，发酵温度为37℃，发酵时间24h，pH值7.0，搅拌转速200r/min，通气量30L/min。
实施例3：枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60黄曲霉毒素B1脱除作用
1.孵育时间对黄曲霉毒素B1的脱除作用影响
取实施例2制备的发酵液0.05mL于10mL离心管中，加入4.5mL PBS缓冲液，混合均匀后加入0.5mL黄曲霉毒素B1标准品，使用HPLC检测黄曲霉毒素B1的浓度，37℃、180r/min条件下孵育12、24h的黄曲霉毒素B1的降解率。
表2孵育时间对黄曲霉毒素B1的脱除作用的影响
从表2可以看出，使用本发明的发酵液处理12h时，降解率便达到了97.32％，当达到24h时，黄曲霉毒素B1降解率达到99.20％，表明本发明所提供的发酵液可以快速降解黄曲霉毒素B1。
2.枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60对不同浓度黄曲霉毒素B1的脱除作用
取实施例2制备的发酵液0.05mL于10mL离心管中，加入5mL PBS缓冲液，混合均匀后加入不同质量的黄曲霉毒素B1标准品，使用HPLC检测黄曲霉毒素B1的浓度，37℃、180r/min条件下孵育24h的黄曲霉毒素B1的降解率。
表3发酵液对不同浓度黄曲霉毒素B1的脱除作用
从表3可以看出，随着黄曲霉毒素B1的浓度增加，降解效果减弱，从结果可以看出枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60对高浓度黄曲霉毒素B1也具有很好的降解效果。
3.经蛋白酶k、热处理后的Bs1-60发酵液对黄曲霉毒素B1的脱除作用
将实施例2制备的发酵液中加入1mg/mL蛋白酶K，37℃混合培养12h，加入0.5mL黄曲霉毒素B1标准品，37℃180r/min孵育12h。分别将发酵液在25、37、50、65、80、90、100℃水浴锅中加入30min后与黄曲霉毒素B1标准品混合均匀，37℃180r/min孵育12h，然后用HPLC检测黄曲霉毒素B1降解率。
表4经蛋白酶k、热处理后的发酵液对黄曲霉毒素B1的脱除作用
| 处理 | 黄曲霉毒素B1浓度ug/L | 降解率 |
| CK | 116.32±1.09 | —— |
| 发酵液 | 3.47±0.34 | 97.02 |
| 蛋白酶K | 59.06±2.46 | 49.23 |
| 25℃水浴30min | 72.10±6.78 | 38.02 |
| 37℃水浴30min | 2.80±0.09 | 97.59 |
| 50℃水浴30min | 2.08±0.32 | 98.21 |
| 65℃水浴30min | 1.78±0.07 | 98.47 |
| 80℃水浴30min | 1.29±0.14 | 98.89 |
| 90℃水浴30min | 1.24±0.01 | 98.93 |
| 100℃水浴30min | 0.21±0.02 | 99.82 |
从表4可以看出，使用蛋白酶K处理后，会降低对于黄曲霉毒素B1的降解效果，而高温处理不影响对于黄曲霉毒素B1的降解效果。
实施例4
枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60益生性与抗逆性验证
1.抑菌性能
取致病菌(黄曲霉、黑曲霉、寄生曲霉)浓度为106CFU/mL的孢子悬液2mL，加入装有200mL灭菌后冷至45℃左右的PDA培养基中，然后吸取10mL未凝固的带菌培养基，转入倒有10mL底层平板的营养琼脂平板上，制备成致病菌平板若干个。在超净工作台上每个病原菌PDA平板用无菌镊子夹取1个灭菌牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管中可加入200μL液体，管的两端要光滑)放在平皿上，使其与培养基接触无空隙，待数分钟后，分别吸取200μL枯草芽胞杆菌菌株发酵液于牛津杯中，于30℃下恒温培养2～3天。每个菌株至少做3个重复，观察并测量抑菌圈大小，结果如表5所示。
表5枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60对病原菌的抑菌效果
| 病原菌 | 抑菌直径(mm) |
| 黄曲霉Aspergillusflavus | 34.67±2.31 |
| 黑曲霉Aspergillus niger | 30.32±1.07 |
| 寄生曲霉Aspergillusparasiticus | 36.39±3.45 |
从表5可以看出，本发明所提供的枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60能够对黄曲霉菌，黑曲霉菌，寄生曲霉菌产生显著的抑制作用。
2.耐温性能
分别取10mL枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60菌悬液(按照实施例2中描述的方法制备)置于90、100℃水浴锅中加热10min，然后进行稀释平板菌落培养计数。结果如表6所示。
表6枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60耐温性能
| 处理 | 90℃ | 100℃ |
| 初始活性CFU/mL | 4.5×1010 | 4.5×1010 |
| 处理后活性CFU/mL | 4.4×1010 | 4.4×1010 |
| 处理后存活率％ | 98 | 98 |
从表6可以看出，本发明所提供的枯草芽孢杆菌NHB-Bs1-60具有优异的耐高温性能。
3.耐人工胃液性能测定
取10mL枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60菌悬液(按照实施例2中描述的方法制备)置于90mL(250mL三角瓶)配置的人工胃液中，37℃，200r/min恒温震荡180min；震荡完成后取10mL样液调节pH值至7.0，加入90mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数，结果如表7所示。
其中，人工胃液制备方法如下：人工胃液的制备参照《中华人民共和国药典》2010版中的制备方法，取稀盐酸16.4mL，加水约800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水称释成1000mL，调节pH值分别为1.5、2.0和2.5，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。
表7枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60在人工胃液中处理后3h的存活情况
| 处理 | pH1.5 | pH2.0 | pH2.5 |
| 初始活性CFU/mL | 4.5×1010 | 4.5×1010 | 4.5×1010 |
| 处理后活性CFU/mL | 4.3×1010 | 4.4×1010 | 4.5×1010 |
| 处理后存活率％ | 95.6 | 97.8 | 100 |
从表7中可以看出，枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60在pH1.5、pH2.0、pH2.5的人工胃液(含酶)中分别处理3h存活率均在95％以上，表明该菌株具有较高的耐酸性。
4.耐人工肠液性能测定
取1mL枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60菌悬液(按照实施例2中描述的方法制备)置于99mL(250mL三角瓶)人工肠液中，37℃，200r/min恒温震荡5h，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。
结果显示，枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60在人工肠液中活性不减少，存活率100％。
其中，人工肠液的制备方法如下：人工肠液的制备参照《中华人民共和国药典》2010版中的制备方法，磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH6.8)，取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量溶解，将两液混合后，加水稀释至1000mL，然后用0.22μm微滤膜过滤除菌，即得。
5.耐胆盐性能测定
取1mL枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60菌悬液(按照实施例2中描述的方法制备)置于99mL(250mL三角瓶)不同胆盐浓度的溶液中，胆盐浓度分别为0.15％、0.3％、1％、1.5％，然后37℃，200r/min恒温震荡5小时，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数，结果如表8所示。
其中，不同浓度胆盐溶液制备方法如下：分别取9mL、18mL、60mL、90mL的5％胆盐溶液加入pH7.4的PBS溶液中，定容至300mL，混合均匀，此为含胆盐0.15％、0.30％、1％、1.5％的PBS溶液。
5％胆盐溶液的制备方法如下：准确称取5.0g胆盐，用100mLPBS溶液溶解定容，121℃灭菌20min。
PBS溶液的制备方法如下：氯化钠0.8％，氯化钾0.02％，磷酸氢二钠0.363％，磷酸二氢钾0.024％，余量为水。用6mol/L的HCl调pH至7.4，121℃灭菌20min，备用。
表8枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60在不同浓度胆盐溶液中处理2h后的存活情况
从表8可以看出，本发明所提供的枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60在0.3％胆盐溶度的溶液中处理5小时，存活率为100％，说明其可以耐受胆盐。
实施例5：枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60降解AFB1产物细胞毒力评价试验
(1)将健康的猪空肠上皮细胞系IPEC-J2在DMEM-Ham的F-12(1:1)中培养，并添加5％胎牛血清(FBS)、3ng/mL重组人上皮生长因子(EGF)、青霉素(100IU/mL)、链霉素(100μg/mL)和0.25μg/mL的双性霉素B，并在37℃5％二氧化碳培养箱中进行培养；
(2)将IPEC-J2细胞以1×104个细胞/mL的密度接种到96个孔板，并培养至90％的细胞铺满。用AFB1(100μg/kg)和NHB-BS1-60脱除的相同浓度的AFB1脱除液(实施例2制备的发酵液)孵育24h，孵育后用PBS洗涤2次，加入含有10％WTS-1的100μL新鲜培养基孵育1h，以菌株发酵液和未处理的细胞为对照组；
(3)使用Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader测量450nm处的吸光度，细胞活力以未处理对照细胞的百分比表示，结果如表9所示。
9枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60降解AFB1产物细胞毒力评价
从表9可以看出，使用NHB-BS1-60脱除的AFB1脱除液对于细胞不存在毒性。
实施例6：枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60湿基发酵饲料制备
1.发酵花生粕制备
将枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60发酵液按照2％接种量接种于花生粕(黄曲霉毒素B1含量200ug/kg,粉碎)中，加水调节到合适的湿度混合均匀，混合均匀后装入呼吸袋中密封，发酵24h，获得枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60湿基发酵花生粕。湿基发酵花生粕经过检测，发酵前后相关指标检测结果如表10所示，发酵前后明显降低花生粕中黄曲霉毒素B1，改善营养物质含量。
表10湿基发酵花生粕发酵前后相关指标检测情况
| 项目 | 发酵前 | 发酵后 |
| 黄曲霉毒素B1(ug/kg) | 200±8.34 | 未检出 |
| 粗蛋白(％) | 55.79±0.21 | 57.32±0.52 |
| 酸溶蛋白(％) | 3.30±0.12 | 4.34±0.56 |
| 总酸(％) | 0.57±0.09 | 2.32±0.21 |
| pH | 6.58±0.02 | 5.24±0.01 |
2.发酵麸皮制备
将枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60发酵液按照1％接种量接种于麸皮(黄曲霉毒素B1含量200ug/kg)中，加水调节到合适的湿度混合均匀，混合均匀后装入呼吸袋中密封，发酵24h，获得枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60湿基发酵麸皮。湿基发酵麸皮经过检测，发酵前后相关指标检测结果如表11所示，发酵前后明显降低麸皮中黄曲霉毒素B1，改善营养物质含量。
表11湿基发酵麸皮发酵前后相关指标检测情况
| 项目 | 发酵前 | 发酵后 |
| 黄曲霉毒素B1(ug/kg) | 200±8.34 | 未检出 |
| 粗蛋白(％) | 17.8±0.12 | 18.5±0.36 |
| 酸溶蛋白(％) | 2.1±0.42 | 4.5±0.08 |
| 总酸(％) | 0.55±0.02 | 3.25±0.11 |
| pH | 6.63±0.04 | 5.00±0.03 |
3.发酵复合小麦混合原料制备
将枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60发酵液按照1％接种量接种于复合小麦粉混合原料(黄曲霉毒素B1含量200ug/kg)中，加水调节到合适的湿度混合均匀，混合均匀后装入呼吸袋中密封，发酵24h，获得枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60湿基发酵复合小麦混合原料。湿基发酵饲料经过检测，发酵前后相关指标检测结果如表12所示，发酵前后明显降低小麦混合饲料中黄曲霉毒素B1，改善营养物质含量。
复合小麦混合原料组成为：小麦粉60％，豆粕15％，麸皮15％，DDGS 10％。
表12湿基发酵饲料发酵前后相关指标检测情况
| 项目 | 发酵前 | 发酵后 |
| 黄曲霉毒素B1(ug/kg) | 200±8.34 | 未检出 |
| 酸性洗涤纤维(％) | 5.7±0.21 | 3.3±0.15 |
| 中性洗涤纤维(％) | 14.7±0.56 | 10.3±0.79 |
| 酸溶蛋白(％) | 1.36±0.02 | 4.54±0.06 |
| 总酸(％) | 0.69±0.03 | 3.47±0.19 |
| 粗蛋白质(％) | 23.97±1.47 | 25.75±3.11 |
| pH值 | 6.18±0.02 | 4.50±0.04 |
实施例7：枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60黄曲霉毒素B1脱除小鼠试验(小鼠试验验证)
选取普通昆明小白鼠60只，雌性，16-18g，常规饲养。随机分为三组，试验处理分别为：(1)对照组基础日粮40％+花生粕60％；(2)负对照组组基础日粮40％+花生粕60％+黄曲霉毒素200ug/kg；(3)试验组基础日粮40％+枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60湿基发酵花生粕(花生粕实施例7制备)。试验期间小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食饮水，环境温度控制在25±2℃，湿度60％。通过每日观察，负对照组小鼠有病态出现，表现为：精神萎靡不振、不活泼；毛色不光泽，且背毛凌乱。试验结果如表13所示，试验组明显改善因黄曲霉毒素B1对小鼠造成的负面影响，增重明显提升。
表13小鼠增重情况
| 处理组 | 对照组 | 负对照组 | 试验组 |
| 初始重(g) | 17.28±0.13a | 17.33±1.51a | 17.23±0.67a |
| 22d末重(g) | 35.49±1.45b | 31.57±2.57c | 36.37±2.32a |
| 增重(g) | 18.21±3.36a | 14.24±2.37b | 19.14±2.95a |
| 平均日采食量(g) | 5.30±0.08a | 4.38±0.13c | 5.06±0.12b |
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，肩标相同小写字母或者无字母表示差异不显著(p>0.05)。
Claims (10)
1.一株可用于饲料黄曲霉毒素B1净化的耐高温枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60，分类命名为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)NHB-Bs1-60，于2023年02月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.26517，保藏地址为中国北京。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60的16S rDNA如SEQ ID NO.1所示。
3.一种用于降解饲料中黄曲霉毒素B1的发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂为如权利要求1所述的枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60的发酵菌剂。
4.根据权利要求3所述的发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂中枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60的活菌数为4.5×1010CFU/mL。
5.如权利要求1所述的枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60在制备降解饲料中黄曲霉毒素B1的发酵菌剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵菌剂中枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60的活菌数为4.5×1010CFU/mL。
7.如权利要求1所述的枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60在制备病原菌抑制剂中的应用，其特征在于，所述病原菌为黄曲霉菌，黑曲霉菌和寄生曲霉菌。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制剂中枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60的活菌数为4.5×1010CFU/mL。
9.如权利要求1所述的枯草芽胞杆菌NHB-Bs1-60在制备耐高温的饲料发酵液中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述高温为70-100℃。
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| GR01 | Patent grant | ||
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